一種厭氧發酵玉米秸稈生產木聚糖酶的方法與流程
2024-04-04 20:31:05
本發明涉及生物技術可再生能源領域，具體為一種厭氧發酵玉米秸稈生產木聚糖酶的方法。
背景技術：
玉米是我國的主要糧食作物，播種面積廣泛，每年伴隨產生的秸稈數量也是非常巨大的。目前我國農村的大量玉米秸稈資源完全處於高消耗、高汙染、低利用率、低產出狀況，玉米秸稈作為能源物質沒有得到合理開發利用。通過厭氧消化處理可將玉米秸稈進行資源再生，但現有的厭氧消化技術存在技術效率低，推廣難度大的問題。
木聚糖酶系是一類降解木聚糖的酶系，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。木聚糖酶可以應用在釀造、飼料工業中。木聚糖酶可以分解釀造或飼料工業中的原料細胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進有效物質的釋放，以及降低飼料用糧中的非澱粉多糖，促進營養物質的吸收利用，並因而更易取可溶性脂類成分。木聚糖酶可以將飼料的非澱粉多糖（nsps）分解成較小聚合度的低聚木糖，從而改善飼料性能，消除或降低非澱粉多糖在動物腸胃中因粘度較大而引起的抗營養作用同時它可以破壞植物細胞壁的結構，提高內源性消化酶的活性，提高飼料養分的利用。另外，木聚糖酶在造紙、食品和紡織等行業中的應用也較為廣泛。
通過厭氧發酵玉米秸稈生產木聚糖酶，其難點主要集中在木質纖維素的水解過程。常見的預處理木質纖維素方法有機械法、熱處理法、化學處理，這些都能有效的促進厭氧消化，但這些預處理方法成本高，不環保。普通的微生物處理也存在較多缺陷，單一微生物處理效果不好，人工構件的複合菌群效果也不理想，各菌種間存在相互拮抗的表現，導致預處理時間長，轉化效率低，目前尚未有完備的方案進行玉米秸稈的厭氧發酵來生產木聚糖酶。
技術實現要素：
本發明的目的是客服上述技術的不足，提出一種厭氧發酵玉米秸稈生產木聚糖酶的方法。
本發明中厭氧發酵使用的菌種，是從青藏高原天祝牧場全放牧犛牛瘤胃內容物中分離的自然共存的厭氧真菌和反芻獸甲烷短桿菌共培養物，piromycesyaktz+m.ruminantium。該共培養物保藏在中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為cgmccno.12952，保藏日期為2016年11月25日，分類命名為：「一株厭氧真菌piromyces與反芻獸甲烷短桿菌（methenobrevibacterruminantium）的共培養物」。
本發明提供的方法，具體包括如下步驟：
（1）piromycesyaktz+m.ruminantium共培養物菌劑的製備
將piromycesyaktz+m.ruminantium共培養物菌液以10%（v/v）接種量接種到厭氧培養基中，加入1%（w/v）乾燥粉碎的小麥秸稈作為底物，同時加入複合抗生素傳代培養，置39℃厭氧培養72h即得到高活力菌劑。
厭氧培養基配方：酵母膏1.0g，蛋白腖1.0g，nahco37.0g，刃天青(1.0g/l)1ml，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前採集瘤胃液8000×g，4℃離心20min後的上清170ml，鹽溶液i165ml，鹽溶液ii165ml，蒸餾水定容至1000ml。
鹽溶液i包括nacl6g，(nh4)2so43g，kh2po43g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·2h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。
鹽溶液ii包括4gk2hpo4，蒸餾水定容至1000ml。
加入秸稈底物後除氧。高溫高壓滅菌。
作為優選，複合抗生素為青黴素鈉和硫酸鏈黴素，在厭氧培養基的終濃度分別為1600iu/ml和2000iu/ml。
（2）玉米秸稈發酵生產木聚糖酶
吸取步驟（1）製備的菌劑，按10%（v/v）接種量接入以1%（w/v）玉米秸稈為底物的與步驟（1）相同的厭氧培養基中，同時加入複合抗生素，39℃厭氧培養7天。
作為優選，複合抗生素為青黴素鈉和硫酸鏈黴素，在厭氧培養基的終濃度分別為1600iu/ml和2000iu/ml。
本發明中採用的厭氧真菌和反芻獸甲烷短桿菌共培養物piromycesyaktz+m.ruminantium是從犛牛瘤胃中分離獲得的，長期的自然選擇和進化使犛牛瘤胃成為一個高效木質纖維素降解酶系統，與人為混合的厭氧真菌和甲烷菌共培養物相比，犛牛瘤胃自然存在的厭氧真菌和甲烷菌共培養物具有獨特優勢和高效的木質纖維素降解能力。採用piromycesyaktz+m.ruminantium發酵玉米秸稈，7天厭氧培養期內產木聚糖酶活性可達到6905mu。
在發酵過程中添加複合抗生素，可防止共培養物體系不受細菌汙染，提高厭氧發酵效率。同時，本發明中採用的共培養物可以通過保藏在體外存活傳代，發酵玉米秸稈可產生高活性木聚糖酶，且發酵工藝簡單，對設備要求低，便於推廣，在工業領域具有重要工業應用價值和開發前景。
通過天祝放牧犛牛瘤胃厭氧真菌和產甲烷菌共培養物厭氧發酵玉米秸稈可產生高活性木聚糖酶，可進一步提高玉米秸稈的使用率，顯著提高經濟效益。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
下述實施例中所使用的培養基如下：
厭氧培養基配方：酵母膏1.0g，蛋白腖1.0g，nahco37.0g，刃天青(1.0g/l)1ml，l-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前採集瘤胃液8000×g，4℃離心20min後的上清170ml，鹽溶液i165ml，鹽溶液ii165ml，蒸餾水定容至1000ml。
鹽溶液i包括nacl6g，(nh4)2so43g，kh2po43g，cacl2·2h2o0.4g，mgso4·2h2o0.6g，蒸餾水定容至1000ml。
鹽溶液ii包括4gk2hpo4，蒸餾水定容至1000ml。
加入秸稈底物後除氧。高溫高壓滅菌。
實施例一、piromycesyaktz+m.ruminantium菌劑的製備。
吸取1mlpiromycesyaktz+m.ruminantium共培養物接種到20ml體積的亨氏厭氧管中的9ml以風乾粉碎的小麥秸稈為底物的厭氧培養基中，同時加入複合抗生素，使其在厭氧培養基溶液的終濃度為青黴素1600iu/ml和硫酸鏈黴素2000iu/ml。39℃厭氧培養72h，即達到生長高峰，此時發酵液為高活力菌劑。
實施例二、厭氧發酵玉米秸稈生產木聚糖酶。
在100ml體積厭氧發酵瓶中盛45ml液體基本培養基，以0.5g粉碎風乾後的玉米秸稈為底物。除氧。滅菌。把傳代培養72h的piromycesyaktz+m.ruminantium共培養物用無菌注射器吸取5ml接種到上述加有玉米秸稈的厭氧培養基中，同時加入複合抗生素，使其在厭氧培養基溶液的終濃度為青黴素1600iu/ml和硫酸鏈黴素2000iu/ml，39°c厭氧培養7天。
將共培養物的發酵液1000×g離心10min，取上清液作為粗酶液，採用分光光度計用dns法測定木聚糖酶酶活性。具體方法如下：稀釋的粗酶液（稀釋至od值大約在0.2-0.8範圍）、底物10g/l樺木木聚糖（sigmax-0502）和50mm磷酸鈉緩衝液（ph6.8）置39°c預熱15min，750ml粗酶液中加入750ml磷酸鈉緩衝液和500ml底物，39°c反應15min後，加入3000mldns終止反應。沸水浴5min後冷卻至室溫，取2000ml於比色皿中，在540nm下檢測吸光值。根據木糖的標準曲線計算木聚糖酶活性。
1個酶活力單位（u）是指在以上所述酶促反應條件下，1ml酶液在1min內自標準底物中釋放1µmol葡萄糖所需的酶量。
測定結果顯示，玉米秸稈通過piromycesyaktz+m.ruminantium共培養物厭氧發酵7d後，其發酵液的木聚糖酶酶活性為6905mu。
綜上可知，本發明提供的方法，即採用天祝放牧犛牛瘤胃自然共培養物piromycesyaktz+m.ruminantium厭氧發酵玉米秸稈可產生大量高活性木聚糖酶，其酶活性高達6905mu，具有重要的工業應用價值。
甘肅省科學院生物研究所
一種厭氧發酵玉米秸稈生產木聚糖酶的方法
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