一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法
2024-03-01 17:39:15
一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法，包括以下步驟：用利馬豆液體培養基或燕麥液體培養基稀釋烯醯嗎啉配置各種質量濃度的藥劑；將菸草黑脛病菌在利馬豆固體培養基平板上培養，經V8液體培養基誘導得到遊動孢子懸浮液，將其濃度調整為1×104個/mL；將96孔微孔板置於監控培養箱中，28℃黑暗條件下培養72h，採用生長曲線監控軟體讀取0-72h小時黑脛病菌生長曲線的數據；培養0和72h時，採用濁度測定軟體測定590nm每孔黑脛病菌的OD值，按照公式(1)計算殺菌劑對黑脛病菌孢子萌發、菌絲生長的抑制率，並計算藥劑對菌株的EC50值。本發明檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性簡便、快速、高效、準確。
【專利說明】一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體來說涉及一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法。
[0002]
【背景技術】
[0003]由菸草黑胚病菌(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)引起的菸草黑胚病是世界範圍內菸草危害最為嚴重的病害之一，在菸草整個生育期內均可侵染菸草根系、莖杆以及葉片等多個組織，通常導致根系壞死、葉片黃化、植株萎蔫、甚至枯死等症狀。在不採取防治措施的情況下，損失可以達到100%。目前，菸草黑脛病的防治主要依賴化學農藥，且防治藥劑品種較為單一。苯基醯胺類殺菌劑甲霜靈在菸草上已連續使用多年，抗藥性問題日益突出，防治效果逐漸降低，及時進行快速高效的敏感性檢測是黑脛病抗藥性治理的必要前提。此外，新型化學殺菌劑的開發需要採用室內生物測定的方法對病原菌的生物活性進行高通量篩選。病原真菌傳統的室內生物測定方法有孢子萌發法和菌絲生長速率法。前者通常採用「載玻片法」和「營養瓊脂法」，但都涉及顯微鏡下觀察，計數較麻煩；後者通常採用「培養皿培養法」，但測試時間較長、工作量大。兩種方法很難作為大批量病原菌敏感性檢測和高通量篩選殺菌化合物的方法。尋找簡便、快速、高效和準確的生物測定方法成為國內、外病原菌敏感性測定和殺菌劑高通量篩選的重要目標。
[0004]微孔板法(MicropLate method)是利用監控培養箱(BioLog OminLog)培養待測病原菌、生長曲線監控軟體(OminLog-PM)獲取病原菌的生長曲線，濁度測定軟體(Microstation)快速檢測微孔板(96孔)中菌懸液的OD值，以OD增加值作為評價指標，用空白對照組與藥劑處理組OD增加值的差值來計算藥劑抑制率的方法。這種方法既能夠獲得藥劑選擇下病原菌的生長曲線，又能測得病原菌對化學殺菌劑的敏感性。Gerd曾用YBA培養液測定了啶醯菌胺對灰黴病菌孢子萌發及菌絲生長的綜合抑制效果，但該方法僅能獲得病原菌生長的濁度值，不能反映病原菌生長的具體動態特徵。
[0005]
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於克服上述問題而提供的一種簡便、快速、高效、準確的檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法。
[0007]本發明的一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法，包括以下步驟:
(1)用利馬豆液體培養基或燕麥培養基稀釋烯醯嗎啉，配置各種質量濃度的藥劑；
(2)將菸草黑脛病菌在利馬豆固體培養基平板上培養4d，取菌落1/3處直徑為5mm的菌絲塊10塊，放入盛有20mL10%V8培養液培養皿中，光照培養4d後菌絲表面形成大量的孢子囊；將形成孢子囊的黑脛病平板置於4°C冰箱低溫處理30min，然後再置於室溫2h，從溶液中收集遊動孢子懸浮液，將其濃度調整為I X 104個/mL，貯存、待用；(3)8通道電動移液器將8種不同質量濃度的藥劑每孔140 μ L加入到96孔微孔板中，並設置空白對照組；無菌條件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4個/mL的遊動孢子懸浮液IOyL;蓋好96孔板板蓋，將96孔微孔板置於監控培養箱(BioLog OminLog)中，28°C黑暗條件下培養72h，採用生長曲線監控軟體(OminLog-PM)讀取0_72h小時黑脛病菌生長曲線的數據；培養O和72h時，採用濁度測定軟體(Microstation)測定590nm每孔黑脛病菌的OD值(處理O和72h的吸光度值分別記為ODtl和OD72)，按照公式(I)計算殺菌劑對黑脛病菌孢子萌發的抑制率，並計算藥劑對菌株孢子萌發的EC5tl值。
【權利要求】
1.一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法，包括以下步驟: (1)用利馬豆液體培養基或燕麥培養基稀釋烯醯嗎啉，配置各種質量濃度的藥劑； (2)將菸草黑脛病菌在利馬豆固體培養基平板上培養4d，取菌落1/3處直徑為5mm的菌絲塊10塊，放入盛有20mL10%V8培養液培養皿中，光照培養4d後菌絲表面形成大量的孢子囊；將形成孢子囊的黑脛病平板置於4°C冰箱低溫處理30min，然後再置於室溫2h，從溶液中收集遊動孢子懸浮液，將其濃度調整為I X IO4個/mL，貯存、待用； (3)8通道電動移 液器將8種不同質量濃度的藥劑每孔140μ L加入到96孔微孔板中，並設置空白對照組；無菌條件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4個/mL的遊動孢子懸浮液10μ L ;蓋好96孔板板蓋,將96孔微孔板置於監控培養箱中，28°C黑暗條件下培養72h,採用生長曲線監控軟體讀取0-72h小時黑脛病菌生長曲線的數據；培養O和72h時，採用濁度測定軟體測定590nm每孔黑脛病菌的OD值(處理O和72h的吸光度值分別記為ODtl和OD72),按照公式(I)計算殺菌劑對黑脛病菌孢子萌發的抑制率，並計算藥劑對菌株孢子萌發的EC5tl值；
2.如權利要求1所述的一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法，其中第(3)步可為下述方法:在無菌條件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4個/mL的遊動孢子懸浮液10 μ L，將其置於監控培養箱(BioLog OminLog)中，於28°C黑暗條件下培養24h後，再分別加入140 μ L經利馬豆培養基稀釋過質量濃度為2、1、0.5,0.25,0.13,0.063,0.031mg/L的烯醯嗎啉藥劑，設置添加同體積無菌水為空白對照組；採用池度測定軟體(Microstation)測定96孔微孔板590nm的OD值(處理Oh的吸光度值為ODtl),將微孔板繼續置於監控培養箱(BioLog OminLog)中黑暗條件下培養,採用生長曲線監控軟體(OminLog-PM)讀取0_72h小時黑脛病菌生長曲線的數據；於72h後再次測定OD值(處理72h的吸光度值為OD72),按照公式(I)計算藥劑對菌絲生長的抑制率，並計算藥劑對菌株菌絲生長的EC5tl值。
3.如權利要求1或2所述的一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法，其中利馬豆液體培養基的配置方法為:稱取60g利馬豆於800mL無菌水中煮沸Ih,過濾,濾液定容至1L，滅菌、待用；利馬豆固體培養基的配置方法為:稱取60g利馬豆於800mL無菌水中煮沸lh，過濾，濾液中添加16g瓊脂粉，煮沸定容至1L，滅菌、待用。
4.如權利要求3所述的一種檢測菸草黑脛病菌對殺菌劑敏感性的方法，其中10%V8液體培養基的配置方法為:100mLV8營養液1500rpm離心5分鐘，收集上清液，並加入.0.2gCaC03,加去離子水至1L, pH6.5~7.5,經滅菌後分裝待用。
【文檔編號】C12Q1/04GK103555811SQ201310580090
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】汪漢成, 王茂勝, 陳慶園, 李文紅, 陸寧, 夏海乾 申請人:貴州省菸草科學研究院, 貴州省植物保護研究所