一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法
2024-04-03 04:31:05 1
專利名稱：一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法
技術領域：
本發明屬於檢測受體與配體相互作用領域，特別涉及一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法。
背景技術：
肽酸酯(PAEQ是一類重要的有機化合物，屬環境雌激素類物質，其常見的主要有鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)和鄰苯二甲酸丁基苄酯(BBP)。肽酸酯類物質對人類及動物體的肝臟、生殖系統、免疫系統等具有一定的毒性作用，某些條件下對生物體還具有急性毒性作用，有研究發現肽酸酯還具有遠期的生物毒理效應。有研究認為，肽酸酯類物質主要是通過與生物體內的雌激素受體發生作用，進而幹擾生物體的正常機能。表面等離子共振SI^R是一種物理光學現象。其原理為當入射光以臨界角入射到兩種不同透明介質(如鍍在玻璃表面的金膜)界面時，可引起金屬自由電子的共振，電子吸收光能量從而使反射光在一定角度內大大減弱，其中使反射光完全消失的入射光角度即為共振角(sra角)。sra隨金屬表面的折射率變化而變化，而折射率的變化又和結合在金屬表面的生物分子質量成正比，因而可通過對生物反應過程中sra角的動態變化獲取生物分子相互作用的特異信號。該技術目前被廣泛應用於受體-配體、抗體-抗原、免疫識別等生物分子之間的檢測。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，該方法受體與配體的結合特異性好，檢出限低，可達10_17g/L，靈敏度為10_8ng/L，操作快捷簡便，可用於研究低濃度下配體-受體的相互作用，具有良好的應用前景。本發明的一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，包括(1)將餵養於含肽酸酯的水中的鯉魚殺死並取出肝臟，用KCl溶液洗去血液，吸乾水分，加入與肝臟質量體積比為Ig 4 6ml的HEDG緩衝液勻漿，離心取上清，即得含有受體的細胞溶質；(2)使用SDS-PAGE電泳對上述含有受體的細胞溶質進行分離分析，濃縮膠中使用 80 90V電壓，進入分離膠後使用120 130V電壓；分離分析結束後將目的蛋白條切碎， 裝入ImL電洗脫液，置於電泳槽中以120 130V的電壓洗脫，離心取上清，即為純化後的受體蛋白溶液；(3)用超純水衝洗金片，將金片放入硫酸/過氧化氫混合液中，靜置，隨後依次用超純水、丙酮、超純水、無水乙醇、超純水衝洗金片表面，烘乾；將金片置於lOmmol/L的3-巰基丙酸乙醇溶液中，40°C下孵育30 40min，取出金片用乙醇(80vol % )洗滌，再用超純水衝洗、吹乾；在金片上分別滴加150 μ 1 EDC/NHS混合液和150 μ 1 200 μ g/L的鏈黴親和素溶液，分別於室溫靜置、超純水衝洗、吹乾；
(4)將經上述預處理的金片放到表面等離子共振儀上，通入PBS緩衝液，注入 70 μ 1受體，靜置反應20min，再用PBS緩衝液衝洗至穩定，再依次進樣不同濃度的肽酸酯溶液，得到雌激素受體-肽酸酯配體結合曲線。所述步驟(1)中的KCl溶液濃度為0. 15 0. 2mol/L。所述步驟⑵中的濃縮膠(質量百分比濃度)為5%，分離膠(質量百分比濃度) 為 12%。所述步驟(3)中的靜置時間為15 20min。所述步驟(3)中的吹乾採用隊吹乾。所述步驟⑷中的肽酸酯溶液濃度分別為lX10-17g/L、lXl(r15g/L、lX10-13g/L、 1 X 10_ng/L、1 X 10_9g/L、1 X 10_7g/L、1 X 10_5g/L。有益效果本發明受體與配體的結合特異性好，檢出限低，可達10_17g/L，靈敏度為10_8ng/L， 操作快捷簡便，可用於研究低濃度下配體-受體的相互作用，具有良好的應用前景。
圖ι為實施例ι的sra檢測雌激素受體-肽酸酯配體相互作用曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例1一、鯉魚體內雌激素受體的提取與純化1.含雌激素受體的細胞溶質的提取取馴養於含肽酸酯的水中的鯉魚肝臟，先用0. 15mol/L的KCl溶液將肝臟表面血液清洗乾淨，再將表面水分吸乾，稱重，再以質量體積比為Ig 細1的比例加入HEDG緩衝液進行研磨，獲得肝組織勻漿(以上操作均在冰上進行)。勻漿液於15000rmp，4°C下離心 1小時，吸取上清，即為含有受體的細胞質溶液。分裝於-80°C保存。2.雌激素受體的分離純化使用SDS-PAGE電泳進行分離分析，濃縮膠質量百分比濃度為5%，分離膠質量百分比濃度為12%，濃縮膠中使用80V電壓，進入分離膠後使用120V電壓；跑膠過程結束後使用考馬斯亮藍法進行染色，後用脫色液脫色，至背景清晰。將目的蛋白條帶切下，切碎，裝入合適的透析袋中，裝入ImL電洗脫液，置於電泳槽中，加入適量電洗脫液，以120V的電壓洗脫2小時，然後取上清於10000rmp，4°C下離心15min，取上清，在尿素緩衝液中梯度透析復性，即為純化後的受體蛋白溶液。二、sra特殊晶片的製備取一鍍金晶片，用超純水衝洗金膜，將金膜放入硫酸/過氧化氫Piranha混合液中，靜置15min，隨後用超純水-丙酮-超純水-無水乙醇-超純水衝洗金膜表面，烘乾；將金片置於lOmmol/L的3-巰基丙酸乙醇溶液中，40°C下孵育30min，取出金片用80VOl%乙醇洗滌，再用超純水衝洗，N2吹乾；將金片置於培養皿中，在金片正中間滴加150 μ 1 EDC/ NHS混合液，室溫靜置15min，超純水衝洗，N2吹乾；重新將金片置於培養皿中，在金膜正中間滴加150 μ 1200 μ g/L的SA (鏈黴親和素)溶液，室溫靜置15min，超純水衝洗，N2吹乾。三、表面等離子共振檢測雌激素受體與肽酸酯配體的相互作用將處理好的金片放到表面等離子共振儀上，通PBS緩衝液，使其注滿整個流通池， 待基線平穩後，注入70 μ 1雌激素受體，靜置反應20min，再通入PBS緩衝液衝洗未結合上的受體，穩定後再依次進樣不同濃度的DBP，其濃度分別為1 X 10_5g/L、1 X 10_7g/L、1 X 10_9g/ L、1 X ΙΟ—1、/!、1 X 10_13g/L、1 X 10_15g/L、1 X 10_17g/L，得到雌激素受體-肽酸酯配體結合曲線。由圖ι可見，當雌激素受體結合到晶片上後，sra的響應強度顯著增大，讓其反應約 20min，然後繼續用PBS緩衝液衝洗，將多餘的未結合上的受體洗脫，待穩定後開始進樣DBP 溶液，濃度由低到高，由圖中曲線可見，當配體與受體結合後SPR響應強度隨之增大，且隨著DBP溶液濃度的增大而增大，當受體上的結合位點基本上都與配體結合後，增大趨勢便開始減弱，至基本飽和，然後繼續用PBS緩衝液將多餘的DBP衝洗掉，此時，sra的響應強度基本穩定，可見雌激素受體與肽酸酯配體已穩定地結合。實施例2四、鯉魚體內雌激素受體的提取與純化3.含雌激素受體的細胞溶質的提取取馴養於含肽酸酯的水中的鯉魚肝臟，先用0. 2mol/L的KCl溶液將肝臟表面血液清洗乾淨，再將表面水分吸乾，稱重，再以質量體積比為Ig 6ml的比例加入HEDG緩衝液進行研磨，獲得肝組織勻漿(以上操作均在冰上進行)。勻漿液於15000rmp，4°C下離心1 小時，吸取上清，即為含有受體的細胞質溶液。分裝於_80°C保存。4.雌激素受體的分離純化使用SDS-PAGE電泳進行分離分析，濃縮膠質量百分比濃度為5%，分離膠質量百分比濃度為12%，濃縮膠中使用90V電壓，進入分離膠後使用130V電壓；跑膠過程結束後使用考馬斯亮藍法進行染色，後用脫色液脫色，至背景清晰。將目的蛋白條帶切下，切碎，裝入合適的透析袋中，裝入ImL電洗脫液，置於電泳槽中，加入適量電洗脫液，以130V的電壓洗脫2小時，然後取上清於10000rmp，4°C下離心15min，取上清，在尿素緩衝液中梯度透析復性，即為純化後的受體蛋白溶液。五、sra特殊晶片的製備取一鍍金晶片，用超純水衝洗金膜，將金膜放入硫酸/過氧化氫Piranha混合液中，靜置20min，隨後用超純水-丙酮-超純水-無水乙醇-超純水衝洗金膜表面，烘乾；將金片置於15mmol/L的3-巰基丙酸乙醇溶液中，40°C下孵育40min，取出金片用80VOl%乙醇洗滌，再用超純水衝洗，N2吹乾；將金片置於培養皿中，在金片正中間滴加150μ 1EDC/NHS 混合液，室溫靜置20min，超純水衝洗，N2吹乾；重新將金片置於培養皿中，在金膜正中間滴加150 μ 1200 μ g/L的SA (鏈黴親和素)溶液，室溫靜置20min，超純水衝洗，隊吹乾。六、表面等離子共振檢測雌激素受體與肽酸酯配體的相互作用將處理好的金片放到表面等離子共振儀上，通PBS緩衝液，使其注滿整個流通池， 待基線平穩後，注入70 μ 1雌激素受體，靜置反應20min，再通入PBS緩衝液衝洗未結合上的受體，穩定後再依次進樣不同濃度的DBP，其濃度分別為1 X 10_5g/L、1 X 10_7g/L、1 X 10_9g/ L、1 X ΙΟ—1、/!、1 X 10_13g/L、1 X 10_15g/L、1 X 10_17g/L，得到雌激素受體 _ 肽酸酯配體結合曲線。
權利要求
1.一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，包括(1)將餵養於含肽酸酯的水中的鯉魚殺死並取出肝臟，用KCl溶液洗去血液，吸乾水分，加入與肝臟質量體積比為Ig 4 6ml的HEDG緩衝液勻漿，離心取上清，即得含有受體的細胞溶質；(2)使用SDS-PAGE電泳對上述含有受體的細胞溶質進行分離分析，濃縮膠中使用80 90V電壓，進入分離膠後使用120 130V電壓；分離分析結束後將目的蛋白條切碎，裝入 ImL電洗脫液，置於電泳槽中以120 130V的電壓洗脫，離心取上清，即為純化後的受體蛋白溶液；(3)用超純水衝洗金片，將金片放入硫酸/過氧化氫混合液中，靜置，隨後依次用超純水、丙酮、超純水、無水乙醇、超純水衝洗金片表面，烘乾；將金片置於10 15mmol/L的 3-巰基丙酸乙醇溶液中，40°C下孵育30 40min，取出金片用乙醇洗滌，再用超純水衝洗、 吹乾；在金片上分別滴加150 μ 1 EDC/NHS混合液和150 μ 1 200 μ g/L的鏈黴親和素溶液， 分別於室溫靜置、超純水衝洗、吹乾；(4)將經上述預處理的金片放到表面等離子共振儀上，通入PBS緩衝液，注入70μ 1受體，靜置反應20min，再用PBS緩衝液衝洗至穩定，再依次進樣不同濃度的肽酸酯溶液，得到雌激素受體-肽酸酯配體結合曲線。
2.根據權利要求1所述的一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的KCl溶液濃度為0. 15 0. 2mol/L。
3.根據權利要求1所述的一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特徵在於所述步驟O)中的濃縮膠濃度為5 %，分離膠濃度為12%。
4.根據權利要求1所述的一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特徵在於所述步驟(3)中的靜置時間為15 20min。
5.根據權利要求1所述的一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特徵在於所述步驟(3)中的吹乾採用N2吹乾。
6.根據權利要求1所述的一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特徵在於所述步驟⑷中的肽酸酯溶液濃度分別為lX10_17g/L、lX10_15g/L、lX10_13g/L、 1 X 10_ng/L、1 X 10_9g/L、1 X 10_7g/L、1 X 10_5g/L。
全文摘要
本發明涉及一種檢測雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，包括將SPR的金屬晶片進行特殊處理，再將從鯉魚肝臟中提取的雌激素受體固定到經過特殊處理的金屬晶片上，再進樣不同濃度的肽酸酯溶液，得到受體-配體結合曲線。本發明受體與配體的結合特異性好，檢出限低，可達10-17g/L，靈敏度為10-8ng/L，操作快捷簡便，可用於研究低濃度下配體-受體的相互作用，具有良好的應用前景。
文檔編號G01N21/55GK102253008SQ20111015656
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者康丹妮, 祁明亮, 趙曉祥, 鄭寅 申請人:東華大學