一種獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法與流程
2024-04-03 23:32:05
技術領域
本發明及獼猴桃種植技術領域，特別涉及一種獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法。
背景技術：
獼猴桃是獼猴桃科（Actinidiacea）獼猴桃屬（Actinidia）落葉藤本果樹，其果實營養豐富，富含胺基酸、蛋白質、礦物質以及多種維生素，尤其是維生素C含量居各種水果之首。同時，獼猴桃又具有很高藥用價值，獼猴桃全株均可入藥，其根、果實等部位提取物具有抗突變、抗腫瘤、抗氧化等作用。獼猴桃在我國分布範圍很廣，北方的陝西、甘肅和河南，南方的兩廣和福建，西南的貴州、雲南、四川、重慶，以及長江中下遊流域的各省(區)都有栽培種植。
近年來，由於獼猴桃種植面積迅速擴大，獼猴桃細菌性潰瘍病（kiwifruit bacterial canker）快速蔓延，在日本、美國、韓國、中國、義大利、法國、葡萄牙、西班牙、紐西蘭、瑞士和智利等國家相繼被發現，並在報導的國家造成了嚴重的產量和經濟損失。目前該病害已成為2005年以來獼猴桃栽培過程中最具毀滅性的危害，嚴重威脅世界獼猴桃的安全生產。
據有關報導，獼猴桃細菌性潰瘍病菌在潛伏期很難發現，具有一定的隱蔽性，且病原菌極易隨繁殖材料和苗木遠距離傳播。雖然化學和生物農藥在防治方面有一定的效果，但是一旦在果園發生，要徹底防治就相當難。獼猴桃細菌性潰瘍病是一種毀滅性病害，由丁香假單孢桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidae）引起，主要為害獼猴桃的主幹、枝幹和葉片。到目前為止，有關獼猴桃細菌性潰瘍病病菌鑑定的研究很多，但大多集中於病原菌的形態學和生理生化特性等傳統的鑑定方法。前期對病原菌的檢測主要通過症狀、形態、生理生化反應等方法開展，這些方法費時費力，需要對病原進行分離純化，往往因為樣品帶菌少和分離純化過程複雜等而失敗，從而造成漏檢及疫情的逃逸、擴散。
傳統的檢測方法如分離培養、生理生化指標的測定、寄主症狀觀察等都比較耗時費力，而且經驗性強，不能滿足口岸檢疫快速驗放的要求，更難以標準化和大規模推廣應用。隨著生命科學和基礎科學的迅猛發展，血清學、分子雜交及聚合酶鏈式反應（PCR）等方法、技術逐步應用到植物病原細菌的檢測和鑑定工作中，這些方法特異性好，靈敏度高，耗時短，能夠很好地提高檢測效率。但是這些方法易出現假陽性或假陰性結果，容易對實驗室造成汙染，也容易對實驗人員的身體造成傷害。
技術實現要素：
本發明為解決上述技術問題為提供一種自動化程度高、檢測快速、靈敏度高的獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法。
為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為：
一種獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法，包括以下步驟：
步驟一、將細菌ITS通用引物對獼猴桃潰瘍病菌標準菌株和其它獼猴桃潰瘍病病原菌的16S~23SrDNA間的ITS區域進行PCR擴增並測序，並得到測序後的序列；
步驟二、用生物學軟體clastal X對測序後的序列及GenBank資料庫中已登錄的丁香假單胞桿菌屬ITS序列進行多重同源性比較分析，並找出獼猴桃潰瘍病菌穩定性點突變區；
步驟三、根據獼猴桃潰瘍病菌穩定性點突變區，應用引物和探針設計軟體Prmier Express設計獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針；
步驟四、對獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針進行可用性檢測、特異性檢測、以菌液為模板的靈敏度檢測、以DNA為模板的靈敏度檢測、以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的螢光PCR檢測和以田間發病樣品為對象的螢光PCR檢測；
步驟五、重複步驟三和步驟四直至獲得用於對獼猴桃細菌性潰瘍病菌檢測的實時螢光PCR引物和實時螢光PCR探針。
本實發明有益效果是：通過建立基於實時螢光PCR的快速獼猴桃潰瘍病菌分子檢測技術，可以有效地防止檢測過程中的汙染和假陽性結果。並且可對獼猴桃種苗、接穗、花、果實上的獼猴桃潰瘍病菌進行微量檢測，以及帶有潛伏病菌而未表現症狀的獼猴桃材料進行有效的監測，阻止該病害在新區的擴散蔓延。依據獼猴桃潰瘍病菌ITS序列的多態性得到實時螢光PCR引物和探針，建立獼猴桃潰瘍病菌實時定量螢光PCR檢測體系，實現獼猴桃潰瘍病菌的快速、特異、靈敏、定量檢測。
作為本發明的一種優選結構，所述步驟四中可用性檢測為以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株的染色體DNA為模板進行實時定量螢光PCR的檢測。
作為本發明的一種優選結構，所述步驟四中特異性檢測為選取獼猴桃潰瘍病菌不同菌株及其近似亞種、近似種、近似屬的菌株進行螢光PCR反應的檢測。
作為本發明的一種優選結構，所述步驟四中以菌液為模板的靈敏度檢測步驟為：
將獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作為陽性，在NB液體培養基中26℃振蕩培養12h；
將培養好的菌液進行10×濃度梯度稀釋，通過平板計數法計算菌液原始濃度；
以連續稀釋的不同濃度梯度菌液為模板進行螢光PCR檢測。
作為本發明的一種優選結構，所述步驟四中以DNA為模板的靈敏度檢測步驟為：
將獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作為陽性，在NA液體培養基中26℃振蕩培養12h；
提取培養好的獼猴桃潰瘍病菌菌液的總DNA，通過ND-2000超微量分光光度計測定DNA的濃度，將培養好的菌液進行10×濃度梯度稀釋；
以DNA各濃度梯度為模板進行螢光PCR檢測。
作為本發明的一種優選結構，所述步驟四中以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的螢光PCR檢測步驟為：
將獼猴桃潰瘍病菌在NA液體培養基中26℃振蕩培養12h；
通過注射器針刺將培養好的獼猴桃潰瘍病菌菌液接種至健康獼猴桃植株的莖杆上；
通過蘸有無菌水的棉花對接種後的獼猴桃植株進行保溼，觀察獼猴桃發病情況；
在接種獼猴桃植株發病後，提取發病植株有症狀部位及無症狀部位的總DNA；
以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株為陽性對照，進行螢光PCR檢測。
作為本發明的一種優選結構，所述步驟四中以田間發病樣品為對象的螢光PCR檢測步驟為：
採集田間發病獼猴桃樣品，提取其病健交界處的總DNA；
以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作陽性對照，健康的獼猴桃樣品作陰性對照，進行實時螢光PCR檢測。
具體實施方式
為詳細說明本發明的技術內容、構造特徵、所實現目的及效果，以下結合實施方式詳予說明。
本發明一種獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測方法，包括以下步驟：
步驟一、將細菌ITS通用引物對獼猴桃潰瘍病菌標準菌株和其它獼猴桃潰瘍病病原菌的16S~23SrDNA間的ITS區域進行PCR擴增並測序，並得到測序後的序列；
步驟二、用生物學軟體clastal X對測序後的序列及GenBank資料庫中已登錄的丁香假單胞桿菌屬ITS序列進行多重同源性比較分析，並找出獼猴桃潰瘍病菌穩定性點突變區；
步驟三、根據獼猴桃潰瘍病菌穩定性點突變區，應用引物和探針設計軟體Prmier Express設計獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針；
步驟四、對獼猴桃潰瘍病菌特異引物和獼猴桃潰瘍病菌特異探針進行可用性檢測、特異性檢測、以菌液為模板的靈敏度檢測、以DNA為模板的靈敏度檢測、以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的螢光PCR檢測和以田間發病樣品為對象的螢光PCR檢測；
步驟五、重複步驟三和步驟四直至獲得用於對獼猴桃細菌性潰瘍病菌檢測的實時螢光PCR引物和實時螢光PCR探針。以獲得對獼猴桃潰瘍病菌檢測靈敏度高、特異性強的實時螢光PCR引物和探針為準。
通過本實施例，可建立基於TaqMan實時螢光PCR的快速獼猴桃潰瘍病菌分子檢測技術，可以有效地防止檢測過程中的汙染和假陽性結果。並且可對獼猴桃種苗、接穗、花、果實上的獼猴桃潰瘍病菌進行微量檢測，以及帶有潛伏病菌而未表現症狀的獼猴桃材料進行有效的監測，阻止該病害在新區的擴散蔓延。
本實施例中所述步驟四中可用性檢測為以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株的染色體DNA為模板進行實時定量螢光PCR的檢測。
本實施例中所述步驟四中特異性檢測為選取獼猴桃潰瘍病菌不同菌株及其近似亞種、近似種、近似屬的菌株進行螢光PCR反應的檢測。
本實施例中所述步驟四中以菌液為模板的靈敏度檢測步驟為：
將獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作為陽性，在NB液體培養基中26℃振蕩培養12h；
將培養好的菌液進行10×濃度梯度稀釋，通過平板計數法計算菌液原始濃度；
以連續稀釋的不同濃度梯度菌液為模板進行螢光PCR檢測。
本實施例中所述步驟四中以DNA為模板的靈敏度檢測步驟為：
將獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作為陽性，在NA液體培養基中26℃振蕩培養12h；
提取培養好的獼猴桃潰瘍病菌菌液的總DNA，通過ND-2000超微量分光光度計測定DNA的濃度，將培養好的菌液進行10×濃度梯度稀釋；
以DNA各濃度梯度為模板進行螢光PCR檢測。
本實施例中所述步驟四中以接種獼猴桃潰瘍病菌的獼猴桃枝條為對象的螢光PCR檢測步驟為：
將獼猴桃潰瘍病菌在NA液體培養基中26℃振蕩培養12h；
通過注射器針刺將培養好的獼猴桃潰瘍病菌菌液接種至健康獼猴桃植株的莖杆上；
通過蘸有無菌水的棉花對接種後的獼猴桃植株進行保溼，觀察獼猴桃發病情況；
在接種獼猴桃植株發病後，提取發病植株有症狀部位及無症狀部位的總DNA；
以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株為陽性對照，進行螢光PCR檢測。
本實施例中所述步驟四中以田間發病樣品為對象的螢光PCR檢測步驟為：
採集田間發病獼猴桃樣品，提取其病健交界處的總DNA；
以獼猴桃潰瘍病菌標準菌株作陽性對照，健康的獼猴桃樣品作陰性對照，進行實時螢光PCR檢測。
本發明依據獼猴桃潰瘍病菌ITS序列的多態性設計TaqMan實時螢光PCR引物和探針，同時建立獼猴桃潰瘍病菌實時定量螢光PCR檢測體系，實現獼猴桃潰瘍病菌的快速、特異、靈敏、定量檢測。
以上所述僅為本發明的實施例，並非因此限制本發明的專利範圍，凡是利用本發明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護範圍內。