一種菸草黑脛病菌接種體的製備方法
2024-03-01 15:42:15
專利名稱：：一種菸草黑脛病菌接種體的製備方法
技術領域：
：本發明屬於農業生物
技術領域：
，具體涉及一種菸草黑脛病菌接種體的製備方法。
背景技術：
：菸草黑脛病(tobaccoblackshank)是世界菸草生產中危害最嚴重的病害之一，特別是在溫帶、亞熱帶和熱帶發生較重，是我國菸草的主要病害。目前，在實驗室、溫室有採用平板菌絲塊、發酵攪碎菌絲液、遊動孢子液等製備菸草黑脛病菌接種體的方法。這幾類方法製備的接種體一般不適用於大田人工接種。在田間菸草黑脛病菌接種體應用較多的是穀物培養接種體，主要供菸草種質資源抗性鑑定或藥劑篩選時人工接種病原物用。這種穀物培養製備方法的培養周期較長，通常需要45~60天；且培養時容易汙染雜菌，導致培養失敗。此外，培養成本相對較高。因此，如何更為有效的製備菸草黑脛病菌接種體，就成為菸草育種、植保工作中亟待解決的技術問題。
發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種經濟有效的菸草黑脛病菌接種體的製備方法。本發明的目的通過以下技術方案予以實現。除非另有說明，本發明所釆用的百分數均為質量百分數。一種菸草黑脛病菌接種體的製備方法，包括以下步驟1、從發病田塊中釆集病株，經過分離、純化、致病力篩選測定，獲得強致病力病菌，菌種釆用菌絲塊水浸法置於1(TC條件下恆溫保存，備用；2、將菸草黑脛病菌菌絲塊移到試管平板培養基上，在28'C下恆溫培養5-6天，選擇菌絲純白色、在平板表面形成一層較緻密菌絲層的培養物，用作液體培養菌種；所述的平板培養基配方為燕麥片30g，瓊脂1720g，蒸餾水1000ml，pH自然；3、用解剖刀切取菸草黑脛病菌菌絲塊置於液體培養基中，每100毫升培養液接種菌絲24塊，150轉/分鐘、28。C恆溫培養78天；所述的液體培養基配方為燕麥片30g,蒸餾水1000ml，pH自然；培養得到的液體菌液要求菌絲白色、菌液不渾濁，菌絲不成團，鏡檢已產生遊動孢子囊，並發現液體中有大量帶有鞭毛的遊動孢子，每毫升孢子含量在105個以上；所述的菌絲塊大小為2-4mmx2~4mm。所述的培養液佔容器容積的30%~50%。4、按3%~5%的體積比將液體菌液置於盛有固體培養基三角瓶中，在28。C下恆溫培養10-12天，所述的固體培養基配方為粒徑1-3mm的粗米糠和粗麥麩以8:2的質量比混勻，加入45%的清水，充分混勻；培養得到的固體培養物要求菌絲長滿整個固體基質，菌絲灰白色，菌絲低溫誘導，鏡檢可產生遊動孢子囊，液體中有大量帶有鞭毛的遊動孢子，每亳升孢子含量在105個以上；所述的固體培養基佔容器容積的50%~80%。5、將合格的固體培養物破碎成0.5-lcmx0.5-lcm大小的菌絲塊，再加入三分之一質量比的新鮮、乾燥粗米糠、粗麥麩，米糠和麥麩按8:2的質量比混勻，攪碎、混勻，平鋪，通風晾乾2-3天，待水分降至35%~40%時，即為所需的菸草黑脛病菌接種體。本發明相對於現有技術，具有以下優點1、可縮短培養時間10-15天；2、培養獲得的.接種體顆粒比通常用的穀粒小，顆粒大小為2~3毫米，接種體容易分散；3、接種體有效侵染數量大，具有擴大培養的潛力，汙染雜菌少。具體實施例方式通過下面給出的實施例和應用實施例，可以進一步清楚地了解本發明,但它們不是對本發明的限定。實施例l製備菸草黑脛病菌接種體，首先需要通過分離、培養、致病力測定獲得強致病力病菌。通常可釆用菌絲塊貼接法、遊動孢子灌根法接種病菌，測定發病情況，發病嚴重的菌株致病力強一些，以保證接種的有效性、可比性。然後培養製備接種體，培養釆用平板、液體、固體3級培養的方式進行，再進行製備，本例採用遊動孢子灌根法接種篩選獲得的強致病力菌株98Pn022實施，具體如下①平板培養平板培養基配方為CA:燕麥片30g,瓊脂1720g,蒸餾水1000ml，pH自然。將4塊菸草黑脛病菌98Pn022的菌絲塊移到試管平板培養基上，在28。C恆溫培養56天，選擇菌絲純白色、在平板表面形成一層較緻密菌絲層的培養物，用作液體培養菌種。②液體培養液體培養基配方為CA:燕麥片30g,蒸餾水1000ml，pH自然。用解剖刀切取薄薄的一層菸草黑脛病菌98Pn022的菌絲塊，菌絲塊大小約為4mmx4mm,移到盛有250毫升培養液的500毫升三角瓶中，每瓶接種菌絲68塊，150轉/分鐘、28。C恆溫培養78天。選擇菌絲白色、菌液不渾濁，菌絲不成團，鏡檢已產生遊動袍子囊，並發現液體中有大量帶有鞭毛的遊動孢子，每毫升孢子含量在105個.以上，作為固體培養的菌種。③固體培養固體培養基配方為l亳米篩不能通過的粗米糠、粗麥麩以8:2的質量比混勻，按質量45%的比例加自來水，充分混勻。用10毫升移液槍移取1520亳升液體菌液到盛有固體培養基(至400毫升刻度處)的500毫升三角瓶，28。C恆溫培養1(K12天。選擇菌絲長滿整個固體基質，菌絲灰白色，菌絲低溫誘導，鏡檢可產生遊動孢子囊，並發現液體中有大量帶有鞭毛的遊動孢子(每毫升105個以上)，即為合格的固體培養物。④接種體的製備將封閉長滿菌絲的固體培養物用25cm的鑷子扳成0.5-lcmx0.5-lcm大小的菌絲塊，再加入三分之一質量比的新鮮、乾燥粗米糠、粗麥麩(8:2的質量比混勻)，攪碎、混勻，平鋪，通風晾乾23天，待水分降至35%~40%，即為所需的菸草黑脛病菌接種體，分裝有孔塑膠袋中，室溫保存，備用。應用實施例l品種抗性評價1.1材料與方法l丄l材料供試接種病原為強致病力菸草疫黴98Pn022。供試品種為紅花大金元、K326、雲煙97、NC89。1.1.2方法1丄2.1供試病原接種體的製備菸草黑脛病菌接種體的製備強致病力菸草疫黴98Pn022菌株固體接種體按實施例l進行。U.2.2抗性測定品種的小區布置試驗處理為4個處理，待測定的4個品種，每個品種為l個處理。每處理植煙20株，3次重複。小區隨機排列。管理與種植同優質烤菸模式。試驗用地約0.5畝。L1.2.3病菌人工接種移栽後的第四天在煙株根脛部周圍株施菸草黑脛病菌固體接種體(本發明製備的接種體)3g，澆水後，培土。U.2.4病情調查在菸草黑脛病菌接種前一天，進行一次病情基數調查，接種後的第80天調查一次病情。調查各處理的全部植株，調査記載釆用YC/T39-1996"菸草病害分級及調查方法"中菸草根莖病害的行業標準。1.2結果與分析品種抗性測定結果見表1,以病情指數大於30為感病、20《病情指數<30為中度感病、10<病情指數<20為中度抗病、小於10為抗病進行評價，可以看出紅花大金元中度感病，雲煙97、K326、NC89抗病。表l待測抗性品種的測定結果品種病情指數抗性評價紅花大金元27.5MS雲煙978.3RK3266.7RNC897.5R應用實施例2田間小區篩選拮抗菸草黑脛病的生防菌2.1材料與方法2丄1材料供試拮抗菌為溫室盆栽篩選的6個菌株GP1、GP3、GP8、GP13、、GP16、GP20。供試接種病原為強致病力菸草疫黴98Pn022。供試品種為紅花大金元。2丄2方法2丄2.1供試菌株接種體的製備菸草黑脛病菌接種體的製備強致病力菸草疫黴98Pn022菌株固體接種體按實施例l進行。拮抗菌菌懸液的製備挑取活化23次的6個待測菌株各一環，分別接種於300mlNA液體培養基中，28°C、150r/m振蕩培養72小時，用滅菌水配成16々cfu/ml的菌懸液。2丄2.2生防菌劑的小區處理試驗處理為6個篩選菌株處理、甲霜靈錳鋅藥劑對照處理(CK*)、培養液處理(CK)，共8個處理。每處理植煙20株，3次重複。小區隨機排列。管理與種植同優質烤菸模式。試驗用地約0.5畝。2丄2.3生防菌劑的施用生防菌劑的施用釆用灌根的方法，於移栽後的第二天進行，每處理每株灌注0.25升。移栽後的第四天在煙株根脛部周圍株施本發明接種體3g,澆水後，培土。2丄2.4病情調查在菸草黑脛病菌接種前一天，進行一次病情基數調查，接種後的第20天、第40天、第60天、第80天各調查一次病情。每次調查各處理的全部植株，調查記載釆用YC/T39-1996"菸草病害分級及調查方法"中菸草根莖病害的行業標準。2.2結果與分析拮抗菌的田間小區防治試驗結果(表2)表明，溫室篩選的6個菌株在大田中對黑脛病均具有一定的防治效果，其中GP13防治效果較顯著，與對照的化學藥劑甲霜靈錳鋅效果接近，防效穩定在77.53%-93.33%。表2拮抗菌防治黑脛病的田間小區試驗結果tableseeoriginaldocumentpage10注CK+為甲霜靈錳鋅藥劑對照，表中的數字為三個重複處理的平均值。權利要求1、一種菸草黑脛病菌接種體的製備方法，包括以下步驟:(1)從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力篩選測定，獲得強致病力病菌，菌種採用菌絲塊水浸法置於10℃條件下恆溫保存，備用；(2)將菸草黑脛病菌菌絲塊移到試管平板培養基上，在28℃下恆溫培養5～6天，選擇菌絲純白色、在平板表面形成一層較緻密菌絲層的培養物，用作液體培養菌種；所述的平板培養基配方為:燕麥片30g，瓊脂17～20g，蒸餾水1000ml，pH自然；(3)用解剖刀切取菸草黑脛病菌菌絲塊置於液體培養基中，每100毫升培養液接種菌絲2～4塊，150轉/分鐘、28℃恆溫培養7～8天；所述的液體培養基配方為:燕麥片30g，蒸餾水1000ml，pH自然；培養得到的液體菌液要求:菌絲白色、菌液不渾濁，菌絲不成團，鏡檢已產生遊動孢子囊，並發現液體中有大量帶有鞭毛的遊動孢子，每毫升孢子含量在105個以上；(4)按3％～5％的體積比將液體菌液置於盛有固體培養基三角瓶中，在28℃下恆溫培養10～12天，所述的固體培養基配方為:粒徑1～3mm的粗米糠和粗麥麩以8:2的質量比混勻，加入45％的清水，充分混勻；培養得到的固體培養物要求:菌絲長滿整個固體基質，菌絲灰白色，菌絲低溫誘導，鏡檢可產生遊動孢子囊，液體中有大量帶有鞭毛的遊動孢子，每毫升孢子含量在105個以上；(5)將合格的固體培養物破碎成0.5～1cm×0.5～1cm大小的菌絲塊，再加入三分之一質量比的新鮮、乾燥粗米糠、粗麥麩；米糠和麥麩按8:2的質量比混勻，攪碎、混勻，平鋪，通風晾乾2～3天，待水分降至35％～40％時，即為所需的菸草黑脛病菌接種體。2、根據權力要求l所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)所述的菌絲塊大小為2~4mmx2—4mm。3、根據權力要求l所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)所述的培養液佔容器容積的30%~50%。4、根據權力要求l所述的製備方法，其特徵在於步驟(4)所述的所述的固體培養基佔容器容積的50%~80%。全文摘要本發明公開了一種菸草黑脛病菌接種體的製備方法。菸草黑脛病菌菌絲塊在28℃下恆溫培養5～6天，培養物置於液體培養基中，150轉/分鐘、28℃恆溫培養7～8天，按3％～5％的體積比將液體菌液置於固體培養基中，在28℃下恆溫培養10～12天，合格的固體培養物破碎成菌絲塊，再與粗米糠、粗麥麩混勻，平鋪，通風晾乾，待水分降至35％～40％時，即為所需的菸草黑脛病菌接種體。運用該技術可縮短培養時間10～15天，培養獲得的接種體容易分散，且有效侵染數量大，具有擴大培養的潛力，汙染雜菌少。本發明操作簡便，成本低廉，具有良好的應用前景。文檔編號C12R1/645GK101381685SQ200810233499公開日2009年3月11日申請日期2008年10月28日優先權日2008年10月28日發明者盧秀萍,宋春滿,方敦煌,李永平申請人:雲南省菸草科學研究所