短小芽孢桿菌及其在防控水產霍亂弧菌中的應用的製作方法

2024-04-07 09:37:05

專利名稱：短小芽孢桿菌及其在防控水產霍亂弧菌中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株短小芽孢桿菌、其製劑及其在防控水產霍亂弧菌中的應用，屬於漁業生態安全和水產品衛生安全領域，用於改善漁業水質，抑殺水產養殖系統中的霍亂弧菌。
背景技術：
霍亂弧菌(VC)是引起人烈性傳染 病霍亂的病原體，在我國被列為甲類傳染病，國際上被列為檢疫傳染病。霍亂弧菌的自然棲息地是水體生態系統，它是在水環境中土生土長的，是水生動物、浮遊生物的共棲體。它以水生動物的甲殼質為營養基質，具嗜溫、嗜鹼、嗜營養鹽的特性，能產生毒素使人致霍亂病；能分泌甲殼質酶腐蝕某些水生動物(甲魚、蝦、蟹、貝及浮遊甲殼類等)的甲殼，破壞其保護層，引發疾病；能轉化硝酸鹽為有毒的亞硝酸鹽使水質敗壞，危害養殖對象。人類霍亂是經口感染的腸道傳染病，主要經水、食物等而傳播，正常人食入霍亂弧菌量超過108—9均可發病；霍亂自流行區向外擴散，主是通過水體與食品的汙染以及病人與帶菌者的擴散而實現，隨著安全飲用水的普及，食物型(主要是水產品，尤其是甲魚產品)傳播日趨突出。目前，國內外對甲魚等水產品攜帶霍亂弧菌的防疫尚處於對其苗種和產品檢疫防疫階段，但往往防不勝防。因為其養殖水體中滋生的病菌，不僅汙染水產品，也對周圍環境造成汙染，擴大傳播途徑，增加霍亂流行風險。而且，一旦發現養殖水體或水產品霍亂弧菌檢測陽性，政府需要立即採取緊急措施予以控制，一般採用化學藥物對染疫水體及周邊環境進行全面徹底消毒，撲殺、銷毀染疫水體中所有水產品，同時需支付巨額疫病防控補償。這樣不僅造成極大的經濟損失，也會對環境造成嚴重的藥物汙染或次生災害。因此，能否在水產品上市之前，通過無公害的生物預防方法，在養殖生產環節使霍亂弧菌得到消除，切斷其傳播源，是杜絕水產品衛生安全隱患的關鍵所在和理想途徑，也是國內外亟需攻克的重要課題。通過尋求拮抗菌以消除水產養殖系統中的霍亂弧菌，目前國內外尚未見有關研究報導。

發明內容
本發明目的在於提供一種短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3),該菌株可以以拮抗菌的作用有效的消除水產養殖系統中的霍亂弧菌，解決了現有技術中水產品攜帶霍亂弧菌的防疫問題。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是一種短小芽孢桿菌 AB3 (Bacillus pumilus AB3)，其保藏編號為 CGMCCN0:6408，其具有抑制霍亂弧菌生長或繁殖的能力。本發明的另一目的在於提供一種霍亂弧菌拮抗菌製劑，其特徵在於所述製劑包括藥學上有效量的所述的短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3)。
本發明的又一目的在於提供一種所述的微生態霍亂弧菌抑菌製劑在水產品養殖系統中霍亂弧菌抑制方面的應用。所述的霍亂弧菌選自人類霍亂以及甲魚、蝦類、蟹類和貝類的甲殼腐爛症的病原菌。使用的微生物使用的短小芽孢桿菌菌株，自市場購買的漁用微生態製劑，經分離培養和抑菌篩選得到，菌株代號為AB3。此菌經鑑定,其屬於短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的成員，命名為短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3),簡稱BPAB3,現在已經保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0:6408，保藏日期為2012年8月10日，為霍亂弧菌拮抗菌菌株。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)是一種飼用微生物菌種,適用於豬、禽類、反芻動物和魚、奸等水產動物，可用於防治小麥根腐病、草莓灰黴病。
短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3)的生物學特性短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3),菌體呈杆狀，圓末端,單個或呈短鏈排列，寬X長為(0.6、.7) X (3-4)微米。能運動，革蘭氏陽性，芽孢橢圓形，中生或次端生。該菌存在半透明型和不透明型兩種不同的菌落形態，對兩種菌落分別進行傳代，半透明菌落能產生半透明和不透明型菌落，且基本各佔一半。而不透明菌落在傳代過程中只產生少許的半透明菌落，且傳至第4代時半透明型菌落消失。該菌能水解澱粉，降解甘露聚糖、木聚糖、纖維素等。微生物的培養篩選方法通過在瓊脂培養基上打孔抑菌試驗，從分離菌株中篩選出對霍亂弧菌抑制作用較強的拮抗菌。相對於現有技術中的方案，本發明的優點是本發明的目的在於提供一種霍亂弧菌拮抗菌製劑及其在水產養殖中的應用技術。該霍亂弧菌拮抗菌製劑可作為替代化學消毒劑的有益微生物製劑，用於改善漁業水質，清除水產品養殖系統中的霍亂弧菌，從而預防霍亂弧菌對水產養殖對象的危害，促進水產養殖業的發展；避免水產品攜帶霍亂弧菌，保障人類健康安全。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用於說明本發明而不限於限制本發明的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1霍亂弧菌拮抗菌尋找、篩選、鑑定(I)霍亂弧菌拮抗菌尋找、篩選A)原料霍亂弧菌菌種從溫室甲魚養殖水體分離獲得，經鑑定確定為霍亂弧菌，其血清型為 0139。漁用微生態製劑選用光合細菌類、芽孢桿菌類、乳酸菌類、硝化細菌類、酵母菌類、複合菌類六大類，共計28個品種，從漁藥店市售採購。培養基試劑包括胰酪腖大豆瓊脂培養基、營養肉湯培養基，從試劑公司米購。胰酪腖大豆瓊脂培養基(TSA)的製備稱取42g，溶於IOOOml蒸餾水的三角瓶中，攪拌溶解後，121°C高壓蒸汽滅菌15min，然後在培養皿中傾注平板，4°C保存備用。營養肉湯培養基(NB)的製備稱取18g，溶於IOOOml蒸餾水的三角瓶中，攪拌溶解後，用試管分裝，121°C高壓蒸汽滅菌15min，4°C保存備用。B)霍亂弧菌液的製備通過無菌操作，用接種環將霍亂弧菌接種到營養肉湯培養基試管中，放於36°C培養箱中培養18-20h,4°C保存備用。C)霍亂弧菌拮抗菌分離篩選 I)細菌分離通過無菌操作，用無菌生理水將28種漁用微生態製劑分別稀釋成菌胞濃度為1000-3000cfu/ml,然後分別取各種稀釋菌液O.1ml,各加入到一個胰酪腖大豆瓊脂培養基培養皿中，並用無菌三角玻璃棒將各種菌液平鋪於瓊脂培養基表面,再將培養皿置於36°C培養箱中培養48h。根據培養皿中培養菌落的大小、形狀、顏色、光澤等培養特徵,將菌落區分為若干類。用接種環分別挑取每一類的單個菌落接種在營養肉湯培養基試管中，36°C下培養48h，製成若干種單個分離菌株的純培養液，並通過比濁儀測試，用無菌生理鹽水將各種細菌純培養液的含菌量調整到基本相同。通過細菌分離培養,根據培養皿中胰酪腖大豆瓊脂培養基上培養菌落的大小、形狀、顏色、光澤等培養特徵，從28種漁用微生物製劑中分離出36類菌株，並通過純培養和濃度調試，獲得36種含菌量相同的細菌純培養液。2)拮抗菌的篩選通過無菌操作，在若干培養皿胰酪腖大豆瓊脂培養基培養基表面均勻塗抹霍亂弧菌液，之後用打孔器在每個培養皿瓊脂培養基上均勻打4個直徑為9_左右的園孔，然後分別吸取若干種分離菌的純培養液各O.1ml,各入到一個瓊脂培養基的孔中，其培養皿於36°C下培養24h，觀察瓊脂培養基打孔周圍抑菌圈的大小，檢驗每一類菌落的純培養物對霍亂弧菌的抑制效果。通過在胰酪腖大豆瓊脂培養基培養皿上打孔抑菌試驗，從36種分離細菌純培養液中找到3對霍亂弧菌有抑制作用的拮抗菌株，取代號為AB3、AB21、AB32，其中AB3純培養液對霍亂弧菌的抑制效果最明顯。拮抗菌AB3、AB21、AB32的培養特徵及其對霍亂弧菌的抑制效果見表I。表1AB3、AB2UAB32培養特徵及其對霍亂弧菌的抑制
菌株號菌體大小菌體形態菌落大小菌落顏色培養液pH 抑菌效果 (寬 μηι X 長mm
__μπι)______
"ΑΒ3(0.6-0.7) X 杆狀SI 42非常顯著~
__(3-4)______
4B21 (0.6-0.7) X 杆狀 2^5 ^ KM _ (3-5)______
權利要求
1.一種短小芽孢桿菌AB3,該菌株保藏名稱為Bacillus pumilus AB3,其保藏編號為 CGMCC NO:6408，其具有抑制霍亂弧菌生長或繁殖的能力。
2.一種霍亂弧菌抑菌製劑，其特徵在於，所述製劑包括藥學上有效量的權利要求1所述的短小芽抱桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3)。
3.—種權利要求2所述的霍亂弧菌抑菌製劑在抑制水產品養殖系統中霍亂弧菌方面的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述的霍亂弧菌選自人類霍亂以及甲魚、 蝦類、蟹類和貝類的甲殼腐爛症的病原菌。
全文摘要
本發明公開了一種短小芽孢桿菌AB3，該菌株保藏名稱為Bacillus pumilus AB3，其保藏編號為CGMCC NO.6408，其具有抑制霍亂弧菌生長或繁殖的能力。該菌作為霍亂弧菌拮抗菌可以製成抗菌製劑在水產養殖中進行應用，可作為替代化學消毒劑的有益微生物製劑，用於改善漁業水質，清除水產品養殖系統中的霍亂弧菌，從而預防霍亂弧菌對水產養殖對象的危害，促進水產養殖業的發展；避免水產品攜帶霍亂弧菌，保障人類健康安全。
文檔編號C02F3/34GK102994417SQ20121039369
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月17日 優先權日2012年10月17日
發明者陳文怡, 張元柱 申請人:蘇州市水生動物疫病預防控制中心