一種柑橘潰瘍病菌的dna水浴沉澱提取方法
2024-04-02 18:04:05 3
專利名稱：一種柑橘潰瘍病菌的dna水浴沉澱提取方法
技術領域：
本發明涉及DNA提取方法，尤其是一種柑橘潰瘍病菌的DNA水浴沉澱提取方法。
背景技術：
柑橘潰瘍病是由地毪草黃單胞桿菌柑橘致病變種、Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的一種國內外檢疫性病害，嚴重影響柑橘安全生產和對外貿易，被列入2007年公布的《中國人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。該病害可通過帶菌的種苗、接穗和果實等柑橘材料遠距離傳播，雪柑、甜橙、臍橙和四季柚等品種發生較為嚴重。引起該病害的病菌在葉、枝梢及果實的病斑中越冬，翌年春條件適宜時從病部溢出，借風雨、昆蟲傳播，經寄主的氣孔、皮孔和傷口侵入。使葉片、嫩梢和果實發病，目前國內外除挖除病樹燒毀外，尚無更好的根除辦法。 目前柑橘潰瘍病的檢疫大多數以田間診斷為主，在一般情況下完全可憑肉眼判斷，但症狀不明顯或未顯現症狀的帶菌植株判斷比較困難，易與其他病害混淆，同時由於黃單胞菌的種類及變種繁多，針對柑橘潰瘍病的生化鑑定十分繁雜和困難。目前人們常用的柑橘潰瘍病菌檢測方法包括致病性、噬菌體檢測法和血清學檢測法等。隨著分子生物學的發展，基於DNA的分子標記開始應用於不同病害的檢測，由於該法直接以DNA的形式出現，可以較其他的田間診斷更為準確。因此，建立一種柑橘潰瘍病菌DNA提取的方法，不僅能用於柑橘潰瘍病菌的分子鑑定，還可以用於柑橘潰瘍病菌基因的特異擴增，為其功能基因組研究奠定基礎。
發明內容
本發明的目的在於解決上述現有技術的不足，提供了一種可以快速抽提柑橘潰瘍病菌的DNA的方法，以全面了解柑橘潰瘍病菌的生物多樣性，從而更好的為柑橘潰瘍病的防控提供依據。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是按以下步驟進行
(a)將新鮮菌體加入洗滌緩衝液充分混合，使細菌細胞沉澱，棄上清液；
(b)往步驟(a)製得的沉澱中加入裂解緩衝液，振蕩懸浮，並於65°C水浴，完全反應；
(c)加入65°C預熱的抽提緩衝液，充分混合，加入等體積飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液抽提，離心使變性的蛋白沉澱，取上清液；
(d)按照體積比為1:2的比例往步驟(c)製得的上清液中加入無水乙醇，-20°C放置待充分反應後，再高速離心至沉澱完全去上清液，加入體積濃度為70 %的乙醇洗滌沉澱，晾乾後加入滅菌ddH20溶解沉澱，-20°C保存備用。步驟(a)中，每0. 12 g樣品中加入洗滌緩衝液I mL ;所述洗滌緩衝液組成為50 mmol/L Tris，即三羥甲基氨基甲烷，pH 7. 7 ；25 mmol/L EDTA，S卩乙二胺四乙酸；0. I %PVP，即聚乙烯吡咯烷酮。步驟(b)中，每0. 12 g樣品中加入裂解緩衝液50 u L ;所述裂解緩衝液組成為50mmol/L Tris，pH 8. 0 ；25 mmol/L EDTA ；3. 0 % SDS,即十二烷基硫酸鈉；1. 2 % PVP。水浴時間 5-10 min。步驟(c)中，每0. 12 g樣品中加入抽提緩衝液400 U L ;所述抽提緩衝液組成為50 mmol/L Tris, pH 8. 0 ；25 mmol/L EDTA ；3.0 % SDS ；1.2 % PVP。步驟(c)中，飽和酚氯仿異戊醇體積比為25:24:1。本發明的效果是，本發明使用水浴法能夠快速有效地提取到柑橘潰瘍病菌的模板DNA，簡捷快速。此外本法不需要特別的儀器，實驗成本相對較低。使用本發明方法製備的DNA樣品能夠滿足PCR方法對柑橘潰瘍病菌進行分子診斷的需要。因此本發明建立了用水浴法快速抽提柑橘潰瘍病菌的模板DNA的方法，為應用PCR技術進行早期診斷和預知檢測提供基礎和技術儲備。
圖I :柑橘潰瘍病菌DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。·圖中，Marker從生物公司購買的DNA分子量標準(DL 2000 DNA ladder)，1、2分別代表平行樣，數字為DNA的大小，單位為bp。圖2 :PCR擴增柑橘潰瘍病菌DNA的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中，Marker從生物公司購買的DNA分子量標準(IOObp DNA ladder), 1、2分別代表柑橘潰瘍病菌DNA的PCR產物平行樣，數字為DNA的大小，單位為bp。
具體實施例方式下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。實施例I :使用本發明所述的方法對柑橘潰瘍病菌DNA的提取
I、稱取0.12 g新鮮菌體加入I. 5 mL離心管中，加入洗滌緩衝液I mL，在混合器上振蕩30 S，然後6，000 rpm離心2 min使細菌細胞沉澱，棄上清液。所述洗滌緩衝液組成為50mmol/L Tris, pH 7. 7，25 mmol/L EDTA，0. I % PVP。2、在洗滌過的樣品中加入裂解緩衝液50 UL，振蕩懸浮，並於65 °C水浴中處理
5-10 min，完全反應。所述裂解緩衝液組成為50mmol/L Tris, pH 8. 0,25 mmol/L EDTA, 3. 0 % SDS,
I.2 % PVP。3、加入400 UL 65 °C預熱的抽提緩衝液，振蕩充分混勻，加入等體積飽和酚氯仿異戊醇(25:24:1)溶液抽提，10，000 rpm離心5 min使變性的蛋白沉澱，取上清液。所述抽提緩衝液組成為50mmol/T, Tris, pH 8.0,1 mmol/L EDTA,0. 3% mol/LNaCl，0. I % PVP04、另取上清液400 y L與1.5 mL離心管中，並加入800 UL預冷的無水乙醇，置-20 箱中冷凍30 min - 60 min促使沉澱形成；12，000 rpm離心10 min沉澱DNA,並棄去上清液；用I mL 70 % (V/V)乙醇洗滌沉澱，然後儘量棄去乙醇，自然晾乾,使乙醇揮發完全，但不能使沉澱過於乾燥，否則很難溶解；加入30 UL滅菌ddH20溶解沉澱，-20 V保存備用。
5、DNA片段大小的瓊脂糖凝膠電泳檢測
取5 UL DNA核酸用I. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用2 U L核酸染料Goldview I進行染色檢測，所用的DNA分子量標準(Marker)為北京天根生化有限公司的DL 2000 DNAladder，所用的電泳緩衝液為I X TAE電泳緩衝液，以120 V的電壓預電泳5 min，然後100V電壓預電泳50 min。電泳結束以後的凝膠在美國BIORAD公司的Gel Doc 2000凝膠成像系統拍照檢測，結果見圖I。其中I X TAE 電泳緩衝液40 mmol /T, Tris, 20 mmol/L 乙酸,2 mmol/L EDTA ;所述I. 2 %的瓊脂糖凝膠0. 36 g瓊脂糖，加入30 mL I X TAE加熱溶解，待冷卻以後加入2U L核酸染料Goldview I。6、柑橘潰瘍病菌的模板DNA的PCR擴增及產物檢測
(I)選擇柑橘潰瘍病菌的特異性引物對P I ( 5』TGCGGGCGTCCTCACAAAT 3』)和P 2(5』 C CCGCCTTAGCCTACACGAC 3』 )作為擴增引物，目的片段長度為373 bp。25 mL PCR 反應體系ddH20 18.85 uL,2. 5 uL 10 X Buffer 含 Mg2+，10 mM dNTP0.5 uL, 1.0 y L 上遊引物 Pl (10 pmole/10uL),1.0 U L 下遊引物 P3 (10 pmole/10U L),0. 15 u L Taq DNA 聚合酶(5 U/y L);引物擴增的 PCR 循環為94 V 4 min, 94 V30 s，60 °C I min, 72 °C I min，30 個循環；72 °C 10 min, 4 °C保存。PCR擴增產物用I. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，除所用DNA分子量標準為北京天根生化有限公司的100 bp DNA ladder Marker以外,其餘同方法5。結果見圖2,從圖中可以 看出，柑橘潰瘍病菌的特異性引物對能PCR出目的條帶，且擴增特異性強，說明此法能得到高產量的DNA。
權利要求
1.ー種柑橘潰瘍病菌的DNA水浴沉澱提取方法，其特徵在於包括以下步驟 (a)將新鮮菌體加入洗滌緩衝液充分混合，使細菌細胞沉澱，棄上清液； (b)往步驟(a)製得的沉澱中加入裂解緩衝液，振蕩懸浮，並於65で水浴，完全反應； (c)加入65で預熱的抽提緩衝液，充分混合，加入等體積飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液抽提，離心使變性的蛋白沉澱，取上清液； (d)按照體積比為1:2的比例往步驟(c)製得的上清液中加入無水こ醇，-20°C放置待充分反應後，再高速離心至沉澱完全去上清液，加入體積濃度為70 %的こ醇洗滌沉澱，晾乾後加入滅菌ddH20溶解沉澱，-20°C保存備用。
2.根據權利要求I所述的柑橘潰瘍病菌的DNA水浴沉澱提取方法，其特徵在於所述步驟(a)中，每O. 12 g樣品中加入洗滌緩衝液I mL ;所述洗滌緩衝液組成為50 mmol/LTris, pH 7. 7 ；25 mmol/L EDTA ；0.I % PVP。
3.根據權利要求I所述的柑橘潰瘍病菌DNA提取方法，其特徵在於所述步驟(b)中，水浴過程中，水浴時間5-10 min。
4.根據權利要求I所述的柑橘潰瘍病菌DNA提取方法，其特徵在於所述步驟(b)中，每O. 12 g樣品中加入裂解緩衝液50 μ L ;所述裂解緩衝液組成為50 mmol/L Tris,pH 8. O ；25 mmol/L EDTA ；3.0 % SDS ；1.2 % PVP。
5.根據權利要求I所述的柑橘潰瘍病菌DNA提取方法，其特徵在於所述步驟(c)中，每O.12 g樣品中加入抽提緩衝液400 μ L ;所述抽提緩衝液組成為50 mmol/L Tris,pH 8. O ；25 mmol/L EDTA ；3.0 % SDS ；1.2 % PVP。
6.根據權利要求I所述的柑橘潰瘍病菌DNA提取方法，其特徵在於所述步驟(c)中，飽和酚氯仿異戊醇體積比為25:24:1。
全文摘要
本發明一種柑橘潰瘍病菌的DNA水浴沉澱提取方法。本發明方法將新鮮菌體加入洗滌緩衝液洗滌、再經裂解緩衝液水浴，抽提緩衝液及飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液抽提，乙醇洗滌沉澱後，晾乾加入滅菌ddH2O溶解沉澱，在﹣20℃保存即可。本發明能夠快速有效地提取到柑橘潰瘍病菌的模板DNA，簡捷快速。本法不需要特別的儀器，實驗成本相對較低。使用本發明方法製備的DNA樣品能夠滿足PCR方法對柑橘潰瘍病菌進行分子診斷的需要。因此本發明建立了用水浴法快速抽提柑橘潰瘍病菌的模板DNA的方法，為應用PCR技術進行早期診斷和預知檢測提供基礎和技術儲備。
文檔編號C12N15/10GK102703436SQ201210196969
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者盧佔軍, 易龍, 陶珍珍 申請人:贛南師範學院