用於防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌的製作方法
2024-04-05 00:04:05
用於防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌BS04(Bacillus subtilis BS04)，屬農業病害生物防治【技術領域】，其特徵在於分離自辣椒根際土壤中，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC NO:M 2014294。本發明的枯草芽孢桿菌BS04對辣椒疫病菌、菸草黑脛病菌、棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和萵苣灰黴病菌的病原真菌具有抑菌作用，對原菌抑菌率在40％-80％之間，對辣椒疫病菌的抑菌率達80％以上。本發明的枯草芽孢桿菌BS04從健康植物根際的土壤中分離獲得，無生態毒性，安全性高，抑菌譜廣，且培養簡單，周期短，在植物病害的生物防治中具有十分廣泛的應用前景。
CCTCC NO：M2014294
2014.06.26
【專利說明】用於防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及一種用於防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌，屬農業病害生物防治技術領 域。
【背景技術】：
[0002] 辣椒疫病俗稱"死秧病"，由辣椒疫黴菌（Phytophthora capsici)引起，是主要的 辣椒根莖病害之一，在我國及世界其他國家的辣椒生產區都嚴重發生，給辣椒生產造成巨 大的經濟損失。
[0003] 辣椒疫黴菌通常分布在土壤中，致病性變異強，易產生抗藥性。目前，對於辣椒疫 病的防治大多採用化學防治，而大量使用化學藥劑導致了環境的嚴重汙染，破壞了農業的 生態平衡，對人類的身體健康產生了不利影響。同時，由於辣椒抗疫病品種較少，且多為中 抗或耐病品種，難以有效地控制辣椒疫病。因此，尋找安全有效的防治措施成為控制辣椒疫 病的一個亟待解決的問題。
[0004] 在採用化學防治和培育抗病品種難以有效控制辣椒疫病發生的情況下，生物防治 是目前辣椒疫病防治中重要的途徑。在植物病害的防治上，生物防治具有對人畜安全，不汙 染環境，不產生抗性，以及由於僅殺傷或抑制防治對象，能參與生態環境調控，保持生態平 衡，起到長效的作用，具有廣闊的發展前景。
[0005] 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)作為目前應用較為普遍的生防菌，具有顯著 的生防能力，又是自然界中廣泛存在的非致病細菌，且對人畜無害、不汙染環境，備受各國 研究工作者的青睞。
【發明內容】
：
[0006] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種用於防治辣椒疫病的枯草 芽孢桿菌，從健康植物根際的土壤中分離獲得，對辣椒疫病具有較高的防治效果，同時也對 棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、菸草黑脛病菌等多種病原菌具有拮抗作用，無生態毒性，安 全性高，抑菌譜廣。
[0007] 本發明的技術方案如下：
[0008] 本發明的一種用於防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌BS04(Bacillus subtilis BS04)，分離自湖北省荊州市辣椒根際土壤中，已於2014年6月26日送交湖北省武漢市武 漢大學內的中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，其保藏編號為CCTCC N0:M2014294。
[0009] 本發明採用平板稀釋法從辣椒根際土壤中分離得到若干株根際細菌，並測定了對 辣椒疫病菌的拮抗作用，篩選得到拮抗作用較強的BS04菌株，根據其菌落形態特徵、生理 生化特性及16S rDNA的序列測定，確定BS04菌株為枯草芽孢桿菌。
[0010] 本發明採用平板對峙法測定了 BS04菌株對辣椒疫病菌、菸草黑脛病菌、棉花黃 萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和萵苣灰黴病菌等病原真菌的拮抗作用，抑菌率在 40% -80%之間，其中對辣椒疫病菌的抑菌率達80%以上。
[0011] 本發明提供了 BS04菌株培養液處理辣椒疫病菌後，辣椒病原菌的菌絲分支增多， 頂端出現畸形，生長緩慢，還出現了細胞壁加厚，原生質濃縮呈球形或橢圓形的現象，表明 BS04菌株對辣椒疫病菌的菌絲生長具有明顯的抑制作用。
[0012] 本發明還通過對BS04菌株抗性的篩選，獲得了卡那黴素抗性BS04突變株。將6 葉期的辣椒幼苗在濃度為2X 108cfu/mL的菌懸液中浸根處理，檢測BS04菌株在辣椒根際 的定殖規律。結果表明BS04菌株能夠在辣椒根際定殖，處理後35天內定殖密度比較穩定。
[0013] 本發明還測定了 BS04菌株對辣椒疫病的應用防治效果，對辣椒疫病的防治效果 可以達到85. 81%。
[0014] 中國典型培養物保藏中心用於專利程序的培養物保藏受理通知書（收據）
[0015] 分類命名枯草芽孢桿菌BS04
[0016] 保藏日期2014年6月26日
[0017] 保藏單位中國典型培養物保藏中心地址：中國.武漢.武漢大學
[0018] 保藏編號 CCTCC NO :M2014294
[0019] 本發明與現有的技術相比具有如下有益效果：
[0020] 1、本發明的枯草芽孢桿菌BS04從健康植物根際的土壤中分離獲得，無生態毒性， 安全性高。
[0021] 2、本發明的枯草芽孢桿菌BS04具有較廣的抑菌譜，對常見的土傳病原真菌（辣椒 疫病菌、菸草黑脛病菌、棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌）及萵苣灰黴病菌等 具有較好的抑制效果。
[0022] 3、本發明的枯草芽孢桿菌BS04菌株對辣椒疫病具有較高的防治效果，且培養簡 單，周期短，在植物病害的生物防治中具有十分廣泛的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明的BS04菌株的16S rDNA擴增電泳圖。
[0024] 圖2為本發明的BS04菌株的16S rDNA的系統進化樹圖。
[0025] 圖3為本發明的BS04菌株處理辣椒疫病菌後的菌絲形態圖。
[0026] 圖a :無菌水處理後辣椒疫病菌的菌絲形態圖；
[0027] 圖b_d :BS04菌株處理後辣椒疫病菌的菌絲形態圖。
[0028] 圖4為本發明的BS04菌株對不同病原真菌的抑制作用圖。
[0029] 圖A :辣椒疫病菌；圖B :菸草黑脛病菌；圖C :棉花黃萎病菌；圖D :棉花枯萎病菌； 圖E :油菜菌核病菌；圖F :萵苣灰黴病菌。
【具體實施方式】：
[0030] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0031] 實施例1 :枯草芽孢桿菌BS04的分離、篩選與鑑定
[0032] (1)分離與篩選：從湖北武漢、荊州、宜昌和荊門等辣椒種植區疫病發生嚴重的田 地，利用五點採樣法從健康辣椒根際採集土樣。採樣時鏟去表層5cm的土層，取新鮮土樣 500g，用保鮮袋帶回。
[0033] 稱取土樣10g加入裝有90mL無菌水的三角瓶中，三角瓶中裝有玻璃珠若干，28°C、 120r/min振蕩30min,靜止後獲得土壤懸液。
[0034] 將土壤懸液稀釋成1(Γ5、10'10'吸取不同稀釋度的土壤懸液100 μ L塗布於NA 培養基上，置於28°C培養48小時，挑取顏色、形態等不同的細菌單菌落並純化、保存。
[0035] 採用平板對峙法測定分離到的細菌對辣椒疫病菌的抑菌活性。將辣椒疫病菌在 PDA平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊（直徑5_)，接種到PDA平板中央。培養1 天后，在距離辣椒疫病菌塊2cm處的4個對接點接種待測細菌，28°C培養，5天後觀察抑菌結 果，每個處理重複3次。試驗結果表明，BS04菌株對辣椒疫病菌的拮抗作用較強。
[0036] (2)鑑定：將篩選到的抑菌效果較好的BS04菌株進行形態學、生理生化特徵和16S rDNA序列測定鑑定。
[0037] 形態學觀察：將BS04菌株在NA培養基平板上劃線接種，28°C培養1-3天，觀察菌 落特徵。菌落初為圓形，邊緣整齊，白色不透明，隆起。隨著培養時間延長，菌落邊緣不整齊， 出現褶皺狀；菌體為杆狀，有芽孢。
[0038] 生理生化特徵：菌株BS04的生理生化特徵見表1。
[0039] 表1 :BS04菌株的生理生化特徵
[0040]
【權利要求】
1. 一種用於防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌BS04(Bacillus subtilis BS04)，其特徵在 於分離自辣椒根際土壤中，保藏在中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，其保藏編號為CCTCC N0:M2014294〇
2. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌BS04,其特徵在於對辣椒疫病菌、菸草黑脛病菌、棉 花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和萵苣灰黴病菌的病原真菌的抑菌應用，對原菌 抑菌率在40% -80%之間，對辣椒疫病菌的抑菌率達80%以上。
【文檔編號】C12R1/125GK104232511SQ201410382695
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月6日 優先權日:2014年8月6日
【發明者】孫文秀, 李偉 申請人:長江大學