誘導馬鈴薯晚疫病菌產生致病性分泌蛋白的方法
2024-04-05 06:14:05 1
專利名稱：誘導馬鈴薯晚疫病菌產生致病性分泌蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及植物保護技術領域，具體地說是一種誘導馬鈴薯晚疫病菌致病性分泌蛋白 的方法。
技術背景由屍AK邵力Mo/"a眾/e"a/7引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產中最嚴重的真菌性病 害，世界各地的馬鈴薯產區均有發生，每年可造成數十億美元的損失，因此受到世界各國 馬鈴薯育種學家、植物病理學家、遺傳學家的廣泛關注。馬鈴薯晚疫病菌同時還是經典遺 傳學和分子遺傳學的良好實驗材料，該病害系統是真菌-植物互作研究的模式系統，近年 來的研究獲得了許多與侵染相關的形態分化和致病因子的遺傳資源與信息，為馬鈴薯晚疫 病菌基因組學研究打下了良好基礎。通過致病相關基因的功能研究，可深入了解馬鈴薯晚疫病菌的致病機制、並以此為途 徑尋找馬鈴薯中與該病原菌致病基因相對應的抗性基因，研究寄主-病原物互作機制和抗 病機制，預測晚疫病菌群體中致病基因分布、多樣性栽培條件下致病基因的表達和變化、 誘導過敏反應的功能域與致病功能域的關係，預測馬鈴薯中相應抗病基因的抗性持久性。 通過鑑定致病基因控制的致病相關因子，可以尋找殺菌劑的作用靶點，最終為有效控制馬 鈴薯晚疫病提出新的策略。但是多年研究結果表明，目前還沒有能夠誘導馬鈴薯晚疫病菌 產生致病性分泌蛋白的方法，從而無法確定其致病相關因子，限制了對其致病機理的深入 研究。 發明內容本發明的目的是克服馬鈴薯晚疫病菌在固體培養條件下無法產生致病性分泌蛋白的不 足，提供一種能夠誘導馬鈴薯晚疫病菌產生致病性分泌蛋白的方法。本發明的誘導馬鈴薯晚疫病菌產生致病性分泌蛋白的方法是按以下步驟進行(1) 將馬鈴薯晚疫病病樣置於普通水瓊脂培養基，16 18T:黑暗保溼培養2 3天；普通水瓊脂培養基由以下部分組成瓊脂粉10g/L、 H20 1L;(2) 待病樣葉片上長出灰白色黴層，用接種針挑取少量菌絲接種到普通固體培養基， 16 18。C暗培養8 10天，形成較大菌落；普通固體培養基由以下部分組成黑麥浸出液450ml 、番茄汁150ml 、瓊脂粉10g/L、 CaC03 1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯 30mg/L、利福平10mg/L、制黴菌素10rag/L、 H20 1L;(3) 用手術刀切取5塊約0.5cm2長滿菌絲的瓊脂塊，轉接到100mL致病性分泌蛋白液體 誘導培養基中，18°C， 150rpm振蕩培養14 16天；致病性分泌蛋白液體誘導培養基由以下 部分組成黑麥浸出液450ml、 CaC03 1. 2g/L、 KH2P04 0. 5g/L、 MgS04 7H20 0. 25g/L、 天門冬醯胺lg/L、 VB1 lmg/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、 制黴菌素10mg/L、 H20 1L;(4) 用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經4000rpm離心10min，上清液加入100%硫酸銨 (697g/L) ， 10000 rpm離心20min，沉澱經透析處理，凍幹後獲得馬鈴薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-2(TC保存；(5) 將得到的蛋白提取物用100W除離子水溶解後，在成株期馬鈴薯葉片上進行接種 實驗，驗證所提取蛋白的致病性。本發明的有益效果是解決了馬鈴薯晚疫病菌在人工培養條件下不產生致病性相關蛋 白的問題，通過對液體培養基配方調整，加入少量無機鹽及胺基酸，從而誘導馬鈴薯晚疫 病菌大量產生致病性分泌蛋白。通過對這些分泌蛋白的分離和提純，可以深入研究晚疫病 菌與馬鈴薯之間在蛋白質水平上的相互作用，最終揭示二者在基因水平上的相互識別、信 號傳導等機理，對於馬鈴薯晚疫病致病機理的研究具有重要意義。
具體實施方式
具體實施方式
是將分離得到的馬鈴薯晚疫病菌在普通固體培養基上培養，然後轉入致 病性分泌蛋白液體誘導培養基中培養，最後提取馬鈴薯晚疫病菌分泌蛋白，蛋白提取物在 馬鈴薯葉片上接種，調査壞死斑。實施例1:將馬鈴薯晚疫病病樣置於普通水瓊脂培養基，16 18。C黑暗保溼培養2 3天；普通水瓊脂培養基由以下部分組成瓊脂粉10g/L、 H20 1L;將分離獲得的馬鈴薯晚疫病菌弱致病性菌株Al接種到由黑麥浸出液450ml、番菊汁 150ral、瓊脂粉10g/L、 CaC03 1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平 10mg/L、制黴菌素10rag/L、 H20 1L組成的普通固體培養基上，16 18。C暗培養8 10天； 形成較大菌落後，用接種針挑取5塊約0.5cm2的菌絲塊轉接到100mL由黑麥浸出液450ml、 CaC03 1.2g/L、 KH2P04 0. 5g/L、 MgS04 7H20 0. 25g/L、天門冬醯胺lg/L、 VB1 lmg/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制黴菌素10mg/L、 H20 IL組成 的致病性分泌蛋白液體誘導培養基中，18°C， 150rpm振蕩培養14 16天；用雙層滅菌濾紙 濾去菌絲體，濾液經4000rpm離心10min，上清液在0。C加入10(F。硫酸銨(697g/L) ， lOOOOrpm 離心20min，沉澱經透析處理，透析帶截流範圍為1KD，凍幹後獲得馬鈴薯晚疫病菌致病性 分泌蛋白提取物，-2(TC保存。 實施例2:將分離獲得的馬鈴薯晚疫病菌強致病性菌株A2、 A3接種到由黑麥浸出液450ml、番茄 汁150ml、瓊脂粉10g/L、 CaC03 1. 2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利 福平10mg/L 、制黴菌素10mg/L 、 H20 1L組成的普通固體培養基上，16 18。C暗培養8 IO天；形成較大菌落後，用接種針挑取5塊約0.5cm2的菌絲塊轉接到100mL由黑麥浸出液 450ml、 CaC031. 2g/L、 KH2P04 0. 5g/L、 MgS04 '7貼0. 25g/L 、天門冬醯胺lg/L、 VB1 lrag/L、 阿莫西林100mg/L 、五氯硝基苯30mg/L 、利福平10rag/L、制黴菌素10rag/L、 H20 1L 組成的致病性分泌蛋白液體誘導培養基中，1S。C， 150rpm振蕩培養14 16天。用雙層滅菌 濾紙濾去菌絲體，濾液經4000rpm離心10min，上清液加入100%硫酸銨(697g/L) ， 10000rpm 離心20min，沉澱經透析處理，透析帶截流範圍為1KD，凍幹後獲得馬鈴薯晚疫病菌致病性 分泌蛋白提取物，-2(TC保存。將上述實施例l、實施例2所提取、保存的分泌蛋白接種到廣泛種植的抗性標準品種合 作88上，接種5天後調査壞死斑大小，結果表明壞死病斑由內至外，依次形成灰白斑、水 漬圈和褐斑圈的感病症狀，而且菌株致病性越強，誘導蛋白致病性也越強。壞死斑大小見 下表馬鈴薯晚疫病菌株壞死斑大小(毫米)Al3. 24±0. 11 3. 89±0. 19A2、 A35. 12±0. 25 5. 98±0. 31上述結果表明，通過本方法誘導不同致病性的馬鈴薯晚疫病菌株產生的分泌蛋白，對廣泛種植的馬鈴薯抗性標準品種合作88均有致病作用，這對馬鈴薯晚疫病致病性分泌蛋白 的研究具有重要作用。
權利要求
1、誘導馬鈴薯晚疫病菌產生致病性分泌蛋白的方法，其步驟為(1)將馬鈴薯晚疫病病樣置於普通水瓊脂培養基，16～18℃黑暗保溼培養2～3天；普通水瓊脂培養基由以下部分組成瓊脂粉10g/L、H2O 1L；(2)葉片上長出灰白色黴層，用接種針挑取少量菌絲接種到普通固體培養基，16～18℃暗培養8～10天，形成較大菌落；普通固體培養基由以下部分組成黑麥浸出液450ml、番茄汁150ml、瓊脂粉10g/L、CaCO3 1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制黴菌素10mg/L、H2O 1L；(3)用接種針挑取5塊約0.5cm2的菌絲塊轉接到100mL致病性分泌蛋白液體誘導培養基中，18℃，150rpm振蕩培養14～16天；致病性分泌蛋白液體誘導培養基由以下部分組成黑麥浸出液450ml、CaCO3 1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制黴菌素10mg/L、H2O 1L；(4)用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經4000rpm離心10min，上清液加入硫酸銨697g/L，10000rpm離心20min，沉澱經透析處理，凍幹後獲得馬鈴薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存。
2、 根據權利要求l所述的誘導馬鈴薯晚疫病菌產生致病性分泌蛋白的方法，其特徵是 步驟(3)中致病性分泌蛋白液體誘導培養基還包含以下成分KH2P04 0. 5g/L、 MgS04 '7H20 0.25g/L、天門冬醯胺lg/L、額lmg/L。
3、 根據權利要求l所述的誘導馬鈴薯晚疫病菌產生致病性分泌蛋白的方法，其特徵是 步驟(4)中所用硫酸銨濃度為100%，透析帶截流範圍為1KD。
全文摘要
本發明涉及一種誘導馬鈴薯晚疫病菌產生致病性分泌蛋白的方法。其方法是將馬鈴薯晚疫病病樣置於普通水瓊脂培養基進行保溼培養，待葉片上長出灰白色黴層，用接種針挑取少量菌絲接種到普通固體培養基，16～18℃暗培養；形成較大的菌落後，將菌絲塊轉接到100mL致病性分泌蛋白液體誘導培養基中，於18℃，150rpm振蕩培養14～16天後，用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經4000rpm離心10min，上清液加入硫酸銨(697g/L)，10000rpm離心20min，沉澱經透析處理，凍幹後獲得馬鈴薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存。此方法可以誘導馬鈴薯晚疫病菌大量產生致病性分泌蛋白，填補了國內外馬鈴薯晚疫病菌致病機理研究中不能獲得致病性分泌蛋白的空白，具有重大意義。
文檔編號C12R1/645GK101250573SQ20081005827
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月11日 優先權日2008年4月11日
發明者丁玉梅, 周曉罡, 孫茂林, 張紹松 申請人:雲南省農業科學院生物技術與種質資源研究所