預防或治療豬鏈球菌病的藥物組合物的製作方法

2023-06-03 14:52:11

專利名稱：預防或治療豬鏈球菌病的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療動物細菌感染的藥物組合物，尤其涉及一種預防或治療豬鏈球菌病的藥物組合物，屬於動物細菌病的防治領域。

背景技術：
豬鏈球菌病是由多種不同群的致病性鏈球菌引起的動物和人類共患的一種多型傳染病。因為豬鏈球菌的血清群眾多，給其防制帶來了困難，所以在臨床上普遍採用藥物進行預防和治療。
但是在藥物選擇壓力下，豬鏈球菌可以形成生物被膜(biofilm，BF)，抵抗抗菌藥物對其作用。生物被膜是細菌在不良生存環境中生長的一種保護性模式，生物被膜中的細菌無論在形態結構、生理生化特性及致病特點等都與浮遊生長的細菌顯著不同，生物被膜可以保護細菌逃避宿主免疫和抗菌藥物的殺傷作用。生物被膜相關感染的治療過程中，抗生素可迅速地殺滅浮遊細菌和生物被膜表層的細菌，而生物被膜深層的細菌則持續存在，能夠使浮遊細菌致死的抗生素劑量往往對生物被膜內細菌無效，同時應用低於致死劑量的抗生素又易使細菌產生耐藥性，使治療非常棘手，從而導致生物被膜相關感染難以治癒。因此，尋找抑制、消除生物被膜形成的藥物和方法具有重要意義。細菌生物被膜相關感染的治療非常棘手，目前還沒有找到能完全控制這種感染的藥物和方法。
基於豬鏈球菌病的危害和防治現狀，國內外均在尋找對豬鏈球菌高效的藥物，通過篩選、研發高效的藥物，用於免疫失敗的豬群治療。但是由於新的、作用強的畜禽專用抗菌藥物進入市場的數量較少，跟不上獸醫臨床需要。因此，如何合理使用及開發現有的抗菌藥物，減少和延緩細菌耐藥性的產生，篩選出對豬鏈球菌有效的同時又能消除豬鏈球菌的菌膜的複方藥物，就顯得十分重要。


發明內容
本發明目的是克服現有技術的不足，提供一種對於豬鏈球菌敏感且能消除豬鏈球菌的菌膜從而有效殺滅包被在生物被膜內的豬鏈球菌的藥物組合物。
本發明目的是通過以下技術方案來實現的 一種治療豬鏈球菌病的藥物組合物，由治療上有效量的β-內醯胺類抗生素和大環內酯類抗生素組成； 其中，所述的β-內醯胺類抗生素包括青黴素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林或氨苄西林，優選為阿莫西林(阿莫西林是廣譜氨基青黴素，是β-內醯胺類藥物的代表藥物)； 所述的大環內酯類抗生素包括紅黴素、泰樂菌素、麥迪黴素、螺旋菌素、乙醯螺旋菌素或酒黴素等，優選為泰樂菌素(泰樂菌素是畜禽專用的大環內酯類藥物)或紅黴素，最優選為泰樂菌素。
本發明通過試驗發現，將β-內醯胺類抗生素和大環內酯類抗生素按照1:20的重量比例組成得到的複方藥物具有最佳的治療效果。此外，本發明還發現，當泰樂菌素的濃度為640μg/ml時，其消除豬鏈球菌被膜形成的作用最強。
傳統的觀點認為，快效抑菌劑(包括四環素類、氯黴素類、大環內脂類等)能迅速阻斷細菌蛋白質的合成，導致細菌生長處於靜止狀態細菌合成細胞壁的過程停止，而快速殺菌劑(包括β-內醯胺類、先鋒黴素族)的作用原理就是影響細菌細胞壁的合成而起殺菌作用的，故兩者合用快效抑菌劑可能降低快速殺菌劑的療效。據此認為這兩種抗生素不能聯合應用。
抗菌藥物要對生物膜中細菌及其組分產生作用，首先必須要能滲透進入生物膜。抗菌藥物對生物膜的滲透作用受到很多因素的影響，其中基質和抗菌藥物的量對抗菌藥物的滲透有較大的影響。藥物對生物膜的殺傷主要表現為生物膜內的細菌數目減少或是對細菌的殺傷。本發明建立了豬鏈球菌的體外BF模型，通過實驗發現，大環內酯類抗生素能有效的破壞或清除豬鏈球菌的菌膜，具有強大殺菌作用的β-內醯胺類抗生素得以進入到菌膜內從而徹底殺滅隱藏於菌膜內的豬鏈球菌，實驗證明，將大環內酯類抗生素和β-內醯胺類抗生素兩者連用，不僅沒有拮抗作用，反而具有良好的協同增效作用，能有效清除菌膜內的豬鏈球菌。本發明進一步發現，將泰樂菌素和阿莫西林相配伍時殺滅豬鏈球菌的協同效應為最好(協同效應高達77.22％)。
本發明藥物組合物可以按照常規的藥物製劑方法製備成口服製劑(例如散劑)。
本發明藥物組合物的用法和參考用量保健用藥一次量將本發明藥物組合物100g與豬飼料300斤混合均勻後，飼餵豬只；母豬產前用7天、產後用7天，仔豬斷奶後用7天，小豬轉群後用7天。治療用藥一次量將本發明藥物組合物100g與豬飼料200斤混合均勻後，飼餵發病豬1周。

具體實施例方式 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
試驗例1 β-內醯胺類抗生素和大環內酯類抗生素MIC值的測定 一、試驗方法 採用微量肉湯稀釋法測定單藥的最低抑菌濃度。分別測定了21株豬鏈球菌和1株質控菌株對β-內醯胺類抗生素(青黴素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林)和大環內酯類抗生素(紅黴素、泰樂菌素)的MIC值。
具體試驗方法如下 1、將豬鏈球菌分離株及標準株的凍存菌株接種至腦心浸液瓊脂平板(其配方組成如下3號腖10g、麥芽糖20g、乳糖1g、酵母浸粉10g、氯化鈉5g、疊氮化鈉0.4g、甘油磷酸鈉10g、瓊脂15g、氯化三苯基四氮唑0.1g、溴甲酚紫0.015g、PH7.2)，37℃孵育過夜。取菌落製成0.5麥氏管鹽水懸液，然後稀釋為約5×106CFU/ml； 2、取凍存的抗菌藥貯存液溶化後，以腦心浸液培養基分別進行系列二倍稀釋，依次加入無菌96孔微孔板每排1-11孔中，每孔100μl，藥物濃度從512μg/ml至0.5μg/ml，最後一孔(第12孔)未加抗生素作為對照； 3、每孔加入菌懸液0.01ml，使菌終濃度約為5×105CFU/ml，混勻後蓋好，於37℃孵育24h； 4、以肉眼觀察，藥物最低濃度孔無細菌生長者(細菌生長完全抑制)，即為受試菌的MIC。讀取菌株的MIC前，應檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，質控菌株的MIC值是否處於質控範圍。
二、試驗結果 101株豬鏈球菌對紅黴素、泰樂菌素，青黴素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林的耐藥率分別為58.12％、35.12％、45.171％、22.18％、54.29％、67.14％和78.24％。
試驗例2 紅黴素、泰樂菌素聯合β-內醯胺類抗生素對豬鏈球菌的聯合抑菌效果試驗 1、試驗方法 1.1初測MIC 將實驗室中保存的101株豬鏈球菌分別用液體培養基(其配方組成如下3號腖10g、麥芽糖20g、乳糖1g、酵母浸粉10g、氯化鈉5g、疊氮化鈉0.4g、甘油磷酸鈉10g、氯化三苯基四氮唑0.1g、溴甲酚紫0.015g、pH7.2)做1:1000稀釋。在第一孔加入108μl菌液，其餘各孔均加60μl菌液。然後在第一孔加入12μl紅黴素原液，混勻後吸取60μl加入第二孔，同法依次稀釋至第十一孔棄去60μl，第十二孔為陽性對照。用同樣方法稀釋阿莫西林；37℃培養18h；按相同的方法對泰樂菌素，青黴素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林的MIC進行測定。以無細菌生長的最低藥物濃度為紅黴素、泰樂菌素，青黴素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林的MIC。
1.2棋盤法測定紅黴素、泰樂菌素聯合β-內醯胺類抗生素的藥物敏感性測定 根據測定的MIC值，分別以紅黴素、泰樂菌素，青黴素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林的4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍MIC濃度分別進行聯合。用無菌蒸餾水把β-內醯胺類抗生素和大環內酯類抗生素儲備液稀釋至4MIC。在微孔板上設橫豎各5排孔為一方陣，第一方陣內第一列加入用液體培養基稀釋1000倍(1.5×104cfu/ml)的復甦菌液108μl，其餘各列均加60μl。然後在第一列加入稀釋的4MIC大環內酯類抗生素12μl，用排槍混勻後吸取60μl加入第二列，同法依次稀釋至第5列棄去60μl，使大環內酯類抗生素的濃度為4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍MIC。用同樣方法稀釋β-內醯胺類抗生素。然後將β-內醯胺類抗生素的豎排加到大環內酯類抗生素的橫排中進行聯合。用2的方法測相應大環內酯類抗生素和相應β-內醯胺類抗生素的MIC為對照，37℃培養16-24h。
1.3判斷標準 以部分抑菌濃度指數(FIC)的計算結果判定聯合藥敏試驗的結果。
FIC指數＝聯合用藥時β-內醯胺類抗生素的MIC/β-內醯胺類抗生素單劑的MIC+聯合用藥時大環內酯類抗生素的MIC/大環內酯類抗生素單劑的MIC； 判斷標準FIC指數≦0.5為協同作用；0.5-1為累加作用；1-2為無關作用；大於2為拮抗作用。
2、試驗結果 各種抗生素組合的聯合抑菌效果見表1。紅黴素組和泰樂菌素組均以協同和相加作用為主，在紅黴素組中為86.53％，在泰樂菌素組中為90.49％，但泰樂菌素組的協同效應為60％，高於紅黴素組15.84％。7種抗生素的10個組合對101株被測菌的FIC範圍分別為紅黴素+青黴素(0.125～1.063)、紅黴素+阿莫西林(0.314～1.031)、紅黴素+苯唑西林(0.125～1.016)、紅黴素+氯唑西林(0.125～1.125)、紅黴素+氨苄西林(0.1875～1.75)，泰樂菌素+青黴素(0.1875～1.063)、泰樂菌素+阿莫西林(0.125～1.063)、泰樂菌素+苯唑西林(0.1875～1.1625)、泰樂菌素+氯唑西林(0.125～1.625)、泰樂菌素+氨苄西林(0.125～1.75)。在紅黴素組中，協同現象發生率最高的組合為紅黴素+阿莫西林，為55.4％。在泰樂菌素組，協同現象發生率最高的組合為泰樂菌素+阿莫西林，為77.22％。
表1 紅黴素或泰樂菌素聯合5種β-內醯胺類藥物對101株豬鏈球菌的體外聯合效應(株)
聯合後紅黴素的MIC50和MIC90分別降為≤2mg/L和4mg/L，泰樂菌素的MIC50和MIC90分別降為≤4mg/L和≤8mg/L。測試的5種β-內醯胺類抗生素聯合後的MIC50和MIC90也分別比單用藥時降低了1～2個對倍稀釋度。值得一提的是，泰樂菌素與阿莫西林聯用後MIC50和MIC90均比單用時降低了3個對倍稀釋度。
試驗例3 泰樂菌素對阿莫西林透過豬鏈球菌菌膜的影響 1.體外豬鏈球菌生物菌膜(BF)模型建立 1.1建立規範標準的生物被膜模型是進行生物被膜藥物作用研究的關鍵，本試驗通過96孔板，用含有0.5％葡萄糖、2％蛋白腖、0.3％ K2HPO4、0.2％KH2PO4、0.01％人纖維蛋白原、0.01％MgSO4.7H2O、0.002％MnSO4.6H2O及0.5％NaCl的肉湯培養基成功的製備了豬鏈球菌生物菌膜。具體試驗方法如下 培養18小時的2型豬鏈球菌用含有0.5％葡萄糖、2％蛋白腖、0.3％K2HPO4、0.2％KH2PO4、0.01％人纖維蛋白原、0.01％MgSO4.7H2O、0.002％MnSO4.6H2O及0.5％Na Cl的肉湯培養基稀釋至吸光度值為0.2(OD655)，將稀釋後的豬鏈球菌加到96孔板，每孔加100μl。37℃孵育18小時後，將懸浮的細菌及培養基除去，用銀染法染色。銀染法具體步驟如下用滅菌生理鹽水多次充分漂洗，去掉浮遊菌；在2.5％戊二醛PBS溶液中固定1小時；蒸溜水清洗1分鐘；飽和CaCl2溶液結合15分鐘；蒸溜水清洗1分鐘；5％Ag NO3溶液反應15分鐘；1％對苯二酚溶液顯色2分鐘；蒸溜水漂洗1分鐘；5％NaS2O3溶液固定2分鐘；蒸溜水漂洗1分鐘。銀染後行普通光學顯微鏡觀察，並以空白矽膠膜銀染後普通光學顯微鏡觀察結果作陰性對照。
1.2試驗結果(BF銀染結果)菌膜經銀染後，肉眼可見膜表面呈灰黑色著色，色澤均勻、緻密，表明有豬鏈球菌菌膜形成。
2、測定菌膜中藥物含量 2.1試驗方法 將上述形成菌膜的96孔板中，分別加入已預熱至37°C的以下3組藥物第1組藥物32μg/ml阿莫西林；第2組藥物640μg/ml泰樂菌素；第3組藥物32μg/ml阿莫西林+640μg/ml泰樂菌素；每組加入12個孔中，放入培養箱中培養，培養4小時後，取出。將藥液全部傾去，超聲脫膜，用500μl滅菌生理鹽水稀釋成懸濁液，分別測定阿莫西林及泰樂菌素的含量。
阿莫西林含量測定方法如下儀器用Agilent1200帶二極體陣列檢測器色譜柱ODS-3C18柱250×4.6(ID)，粒徑5um或相當者。用十八烷基矽烷鍵和矽膠為填充劑，以0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液-乙腈(97.5:2.5)為流動相；檢測波長為254nm。理論塔板數按阿莫西林計算不低於2000。
泰樂菌素的含量測定應用Agilent1200帶二極體陣列檢測器。色譜柱為XDBC18柱150×4.6(ID)，粒徑5um或相當者。流動相0.05mol/L(pH＝2.8)高氯酸鈉乙腈＝6535。流速1.0mL/min。
2.2試驗結果 第1組BF阿莫西林含量為0.988±2.45μg/ml；第2組BF泰樂菌素含量為600.88±10.32μg/ml。第3組BF泰樂菌素含量為55.88±9.46μg/ml，阿莫西林含量為28.42±12.60μg/ml。
3.MTT比色法測定BF中活菌數 3.1 試驗方法 3.1.1 標準曲線 新鮮培養的受試菌通過比濁儀用MH肉湯調至以下濃度1.5×108、3.0×107、6.0×106、1.2×106、2.4×105、4.8×104CFU/ml。在無菌96孔板中精確加入各濃度的細菌稀釋液190μl及20μl MTT試劑，混勻後於37℃培養2h後加入裂解液90μl，待其充分裂解後，於酶標儀上測定595nm處取吸收度，以細菌濃度(C)和吸收度(A)進行直線回歸，求得標準曲線。
3.1.2 BF中活菌數測定 將上述形成菌膜的96孔板中，分別加入已預熱至37°C的以下3組藥物第1組藥物32μg/ml阿莫西林；第2組藥物640μg/ml泰樂菌素；第3組藥物32μg/ml阿莫西林+640μg/ml泰樂菌素；第4組為對照組(不加入任何抗生素)；每組加入12個孔中。放入培養箱中培養。培養4小時後，取出。傾去藥液。超聲脫膜所得菌懸液按標準曲線向上方法操作，計算菌液濃度。
3.2 試驗結果 BF中活菌數法的測定MTT比色法測得4組BF中豬鏈球菌濃度。4組BF中豬鏈球菌濃度分別如下第1組藥物3.21×107CFU/ml；第2組藥物1.25×103CFU/ml；第3組藥物46.2CFU/ml；第4組(對照組)6.68×107CFU/ml。
從試驗結果可見，相比於對照組，第2組和第3組能顯著降低BF中豬鏈球菌濃度，尤其將阿莫西林和泰樂菌素聯合使用時，能有效清除BF中的豬鏈球菌，說明將大環內酯類抗生素和β-內醯胺類抗生素二者連用具有良好的協同增效作用，能有效清除菌膜內的豬鏈球菌。
權利要求
1、一種預防或治療豬鏈球菌病的藥物組合物，由治療上有效量的β-內醯胺類抗生素和大環內酯類抗生素組成。
2、按照權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於所述的β-內醯胺類抗生素包括青黴素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林或氨苄西林；所述的大環內酯類抗生素包括紅黴素、泰樂菌素、麥迪黴素、螺旋菌素、乙醯螺旋菌素或酒黴素。
3、按照權利要求2所述的藥物組合物，其特徵在於所述的β-內醯胺類抗生素是阿莫西林。
4、按照權利要求2所述的藥物組合物，其特徵在於所述的大環內酯類抗生素是紅黴素或泰樂菌素。
5、按照權利要求4所述的藥物組合物，其特徵在於所述的大環內酯類抗生素是泰樂菌素。
6、按照權利要求1-5任何一項所述的藥物組合物，其特徵在於所述的β-內醯胺類抗生素和大環內酯類抗生素按照1∶20的重量比例組成。
7、按照權利要求1-5任何一項所述的藥物組合物，其特徵在於按照常規藥物製劑方法製備成口服製劑或注射劑。
8、權利要求1-5任何一項所述的藥物組合物在製備治療豬鏈球菌病藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種預防或治療豬鏈球菌病的藥物組合物，屬於動物疾病的防治領域。該藥物組合物由治療上有效量的β-內醯胺類抗生素和大環內酯類抗生素聯合組成。其中，所述的β-內醯胺類抗生素優選為阿莫西林，所述的大環內酯類抗生素優選為紅黴素或泰樂菌素。本發明建立豬鏈球菌的體外BF模型，實驗發現，將大環內酯類抗生素和β-內醯胺類抗生素兩者連用後具有良好的協同增效作用，能有效清除菌膜內的豬鏈球菌。本發明進一步發現，將泰樂菌素和阿莫西林相配伍時，二者殺滅生物被膜內豬鏈球菌的協同效應為最好(協同效應高達77.22％)。
文檔編號A61K31/429GK101502653SQ20091011815
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月4日 優先權日2009年3月4日
發明者李豔華, 閆清波, 剛 徐, 洋 劉, 敏 王, 李曉雲, 陽 崔, 趙志慧, 棟 邊 申請人:李豔華