一種用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑及其應用的製作方法

2023-12-02 05:45:31 1

專利名稱：一種用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫佐劑，具體地，涉及一種用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑及其應用。
背景技術：
弓形蟲廣泛寄生於多種哺乳動物的有核細胞內，是一種重要的人獸共患性寄生蟲病病原，具有發病率高、危害嚴重的流行病學特點。嬰幼兒、孕婦或免疫低下者感染，可引發流產、畸胎或急性獲得性弓形蟲病等。愛滋病又名獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)，研究發現10% 30%愛滋病患者並發弓形蟲腦炎，是愛滋病患者死亡的主要原因之一。鑑於藥物治療弓形蟲病能力有限且毒副作用大的特點，研製疫苗尤其是DNA疫苗已逐漸成為一種較為有效的舉措。從1990年WolfT等發現小鼠肌注外源性重組質粒，質粒被攝取並表達出編碼蛋白時起，重組質粒的數量和種類已舉不勝舉，其中近些年，弓形蟲重組質粒包括R0P13，ROP16, R0P18，MIC6，MIC8等先後被評價。結果發現，除少數個別基因(如R0P18等)免疫效果較好外，其他重組疫苗均有不理想的特徵。為了增強免疫效果，提高免疫保護率，免疫佐劑的研製將成為一個重要的研究課題。按照是否具有免疫原性，免疫佐劑可分為兩大類，即具備免疫原性的佐劑如卡介苗，細胞因子等，和不具備免疫原性的佐劑如鋁鹽佐劑等，或兩者的混合形式。其中，白細胞介素(IL)是一種常見的免疫佐劑。IL15是Grabstein於1994年從猿腎上皮細胞系CV-1/EBNA的培養上清液中發現的，它是一種重要的免疫調節因子，屬於IL2家族，主要由單核細胞、吞噬細胞和樹突狀細胞等白細胞產生，能維持依賴IL-2的CTLL細胞系的增殖，同時對⑶8+ T細胞、NK細胞、巨噬細胞等免疫細胞的發育及內環境穩態至關重要。IL15分子包含Cys-35-Cys-85和Cys-42-Cys-88兩個二硫鍵，三級結構含有4個螺旋和3個連接環。IL15受體(IL15R)由3個亞基組成，β、Y亞基與IL2R相同，α亞基為IL15獨有。在慢性淋巴細胞白血病(CLL)中，IL15引起由IgM交叉耦合 誘導的細胞增殖並抑制細胞凋亡，還可增加Shc和ERK1/2的磷酸化作用，而IL21促進細胞凋亡且不能引起CLL細胞的增殖。IL21是Parrish-Novak首次發現的,屬於I型細胞因子,亦是IL-2家族成員。人IL21基因與IL2、IL15定位於同一條染色體上，位於4q26_q27，距IL-2基因大約180 kb,相距IL15則較遠，與IL2、IL4、IL15有較高的同源性，鼠IL21與人的IL21有57%的同源性。IL21包含4個螺旋，與IL15有兩對相同的Cys位點殘基:一對是在IL21和IL15中特有的，另一對在IL2、IL4和GM-CSF中也有表達。IL21具有很強的免疫刺激作用，特別是能夠增強並維持CD8+ T細胞應答，已經被證明是很好的免疫增強因子。IL21的信號傳導是由IL21受體與IL2受體家族共同的Y c受體組成的異二聚體受體介導的。IL21是啟動先天性和適應性免疫應答的輔助細胞因子，並導致免疫應答進一步放大。IL21對機體的細胞免疫和體液免疫具有廣泛的調節作用，它可調節T細胞、B細胞、NK細胞和DC細胞的分化和增殖，其中最顯著的特徵是能持續增強效應T細胞及活化NK細胞的功能，在促進機體由先天性免疫向獲得性免疫的轉變中起著關鍵作用。IL21對B細胞的調節主要表現為促進B細胞向漿細胞分化，調節免疫球蛋白的產生。IL21具有增強免疫激活、促進CTL應答和維持記憶性T細胞應答的能力，使其成為癌症免疫治療最具潛力的候選藥物之一。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供了一種用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑及其應用。為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案:
一種用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑，它是以PVAXl質粒作為載體、融合白細胞介素IL21和IL15的重組質粒pVAX-1L21-1L15，其鹼基序列如SEQ ID NO:1所示。本發明的用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑在提升MIC8基因免疫效果中的應用。本發明的用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑在增強弓形蟲免疫預防疫苗效果中的應用。本發明的用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑在製備弓形蟲免疫預防疫苗中的應用。以下為本發明的實驗內容:
參照弓形蟲MIC8基因序列，設計了擴增弓形蟲MIC8基因的引物序列。包括:
Fmic8:5/ -CGCGGATCCATGAAGGCCAATCGAATATGGTG-3'；
Rmic8:5/ -CCGCTCGAGTTAGGACCAGATACCGCCCGAA-3'；
參照小家鼠(ifes musculus) IL15基因序列，設計了 IL15基因引物序列。包括:
F15b:5/ -AACTGCAGATGAACTGGATAGATGTAAGATATG-3,；
R15b:5/ -TGCTCTAGATCAGGACGTGTTGATGAAC-3/ ；
參照小家鼠(ifes musculus、IL21基因序列，設計了 IL21基因引物序列。包括:
F21:5/ -CGGGGTACCATGCATAAATCAAGCCCCCAAG-3'；
R21:5/ -AACTGCAGCTAGGAGAGATGCTGATGAATC-3,；
弓形蟲RH株pVAX-MIC8疫苗的製備；
KM鼠pVAX-1L21-1L15免疫佐劑的構建；
KM鼠免疫與分組。(一)弓形蟲RH株PVAX-MIC8疫苗的製備包括如下順序的步驟:
1.蟲體基因組DNA的提取:弓形蟲RH株腹腔接種KM鼠96 h後，經頸椎脫臼致死，無菌收集小鼠腹水1.0mL, IOOOOrpm離心3 5min，棄上清，備用。弓形蟲RH株DNA提取的具體方法和步驟參照 Promega 公司試劑盒 Wizard SV Genomic DNA Purification System 使用說明進行。擴增:以所提取的弓形蟲RH株基因組DNA為模板，進行MIC8基因的PCR擴增。MIC8基因PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性 lmin，62°C復性Imin ;72°C延伸2min ；35個循環。純化產物的連接:MIC8 基因PCR純化產物的連接反應參照TaKaRa公司pMD18_TVector使用說明進行。16°C反應2 4h或4°C連接過夜，連接產物標記為pMD18_MIC8。的序列測定:將經菌液PCR和酶切鑑定均為陽性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司測序。質粒的小量提取:按天根生化科技(北京)有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用說明進行。載體(圖6所示)及MIC8目的片段的回收:用BamHI和XhoI分別雙酶切pVAXl質粒及pMD18-MIC8重組質粒，按照天根生化科技(北京)有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的使用說明回收載體及目的片段。載體及MIC8目的片段的連接:將經切膠回收純化得到的MIC8基因片段定向亞克隆至pVAXl載體中。16°C反應4 6h或4°C連接過夜，產物標記為pVAX_MIC8。連接產物的轉化與鑑定:將連接產物10 μ L轉化大腸桿菌DH5a中，挑取若干單菌落作菌液PCR鑑定。pVAX-MIC8構建路線參照

圖1。(二)KM 鼠 pVAX-1L21-1L15 重組質粒的構建
1.KM鼠脾臟總RNA的提取:弓形蟲RH株腹腔接種KM鼠72 h後，將其經頸椎脫臼致死，並將其置75%乙醇溶液中浸泡2 3min，無菌取出脾臟。將脾臟裝入一個RNase-Free離心管，後續實驗按天根生化科技(北京)有限公司試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit使用說明進行；
2.RT-PCR擴增目的片段:以KM鼠脾臟總RNA為模板，進行IL21和IL15基因序列的RT-PCR擴增，實驗步驟參考大連寶生物工程公司PrimeScript One Step RT-PCR KitVer.2試劑盒的使用說明進行 。純化產物的連接:RT-PCR純化產物的連接反應參照TaKaRa公司pMD18_T Vector簡易操作說明進行；16°C反應2 4h或4°C連接過夜，產物依次標記為pMD18-1L21和PMD18-1L15 ;pMD18_T 載體如圖 5 所示。和pMD18-1L15重組質粒的小量提取:按天根生化科技(北京)有限公司TIANprepMini Plasmid Kit使用說明進行。和IL15的序列測定:將經菌液PCR和雙酶切鑑定均為陽性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司測序。及目的片段IL15的回收與連接:用PstI和XbaI雙酶切pVAXl質粒和pMD18_IL15重組質粒，按照天根生化科技(北京)有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的使用說明分別回收載體及目的片段。然後將經切膠回收純化得到的IL21、IL15基因片段定向亞克隆到相應pVAXl載體中。16°C反應4 6h或4°C連接過夜，產物標記為pVAX_IL15。和pMD18-1L21重組質粒的小量提取:按天根生化科技(北京)有限公司TIANpr印Mini Plasmid Kit使用說明進行。及目的片段IL21的回收與連接:用KpnI和PstI雙酶切pVAX_IL15和pMD18_IL21重組質粒。按照天根生化科技(北京)有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的指導說明回收線性載體PVAX-1L15及目的片段IL21，將經切膠回收純化得到的IL21基因片段定向亞克隆到pVAX-1L15載體中。16°C反應4 6h或4°C連接過夜，產物標記為pVAX_IL21_IL15。PVAX-1L21-1L15構建路線參照圖2。(三)大量製備質粒
1.挑取含有目的質粒(pVAXl，pVAX-1L21-1L15和pVAX-MIC8)的陽性菌液於LB (含1000U/mL Kan+，下同)固體選擇培養基上劃線，37°C培養過夜。挑取板上的一個單菌落置於12mL LB液體選擇培養基中，搖床37°C，180 220rpm培養12 16h。將上述培養菌液以I: 100的比例接種到裝有400mL LB培養基的IOOOmL錐形瓶中，搖床37°C，180 220rpm培養過夜。2.將細菌培養物置於冰中或4°C冰箱數分鐘，4°C，9000rpm離心5min，收集細菌培養物沉澱，棄上清，倒置離心管使上清儘量流出。IOmL預冷的Solution I重懸菌體,旋潤振蕩，使細菌在Solution I中完全分散。加入ImL新配製的10mg/mL溶菌酶溶液(pH8.0)，震蕩混勻，此步可省略。3.加入20mL新配製的Solution II,輕搖並上下顛倒混勻2 4次。再加入15mL預冷的Solution III，立即輕搖混勻，以免產生局部沉澱。冰上或_20°C冰箱放置lOmin。加Solution II和Solution III的時間間隔控制在5min以內，以免過分裂解。4°C或室溫，IlOOOrpm離心IOmin,利用4層紗布將上清過濾,轉移到兩個新50mL離心管中。4.上清與0.6倍體積異丙醇(15mL)混勻，室溫放置lOmin。室溫下，IlOOOrpm離心IOmin,棄上清,將空管倒置於濾紙上數分鐘數分鐘，除去殘餘。加入3mL ddH20充分溶解(很重要)，再加入3mL預冷的5M LiCl溶液，充分混勻(不可吹打)。兩隻離心管合併為一管，冰中或_20°C冰箱放置lOmin。4°C或室溫，IlOOOrpm離心lOmin，將上清分別轉移到一新50mL離心管中，加入等體積(12mL)預冷的異丙醇,充分混勻，室溫放置lOmin。4°C或室溫，IlOOOrpm離心IOmin,小心棄上清,倒置控幹管內液體,一般倒置10 15min即可。此時管壁會出現白色沉澱物即質粒。5.力卩Λ 3mL ddH20或TE溶液(ρΗ8.0) 溶解沉澱，並力卩Λ 30
LlL 10mg/mL RNase A，37°C水浴Ih除去RNA。加入2倍體積(8mL)無水乙醇和1/10體積
(300 p.L)3M NaAc溶液，充分混勻，冰中或_201:冰箱放置201^11。41:，11000印111離心IOmin，
小心將上清吸出(勿倒)，並將離心管倒置於濾紙上控幹(非常重要)。加入100>UL CldH2O或
TE溶液(pH8.0)，充分洗脫質粒沉澱。利用分光光度計測量所得質粒的濃度並記錄，分裝封口後於-20°C保存備用。(四)質粒DNA的純度檢測
以ddH20或TE (ρΗ8.0)為空白對照，用分光光度計測定波長260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。雙鏈DNA純品的OD26tZOD28tl值為1.8，若樣品0D26(l/0D28(l值低於1.8，說明樣品可能被蛋白質汙染，需進一步純化。(五)重組質粒的免疫效果評價
1.KM鼠免疫與分組:為了降低應激反應，KM鼠買回後需飼養lw，然後將其隨機分為6個組，每組19隻，具體分組見表10。表10免疫實驗分組情況
權利要求
1.一種用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑，其特徵在於，它是以PVAXl質粒作為載體、融合白細胞介素IL21和IL15的重組質粒PVAX-1L21-1L15，其鹼基序列如SEQ ID NO:1所
2.權利要求1所述的用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑在提升MIC8基因免疫效果中的應用。
3.權利要求1所述的用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑在增強弓形蟲免疫預防疫苗效果中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑，它是以pVAX1質粒作為載體、融合白細胞介素IL21和IL15的重組質粒pVAX-IL21-IL15，其鹼基序列如SEQIDNO:1所示。本發明提供的用於弓形蟲感染預防的免疫佐劑具有顯著提升MIC8基因免疫效果的作用，進而，能夠顯著增強弓形蟲免疫預防疫苗的免疫效果。
文檔編號A61K39/02GK103083660SQ20131002979
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者朱興全, 李中原, 陳佳, 徐民俊, 周東輝, 黃思揚, 宋慧群 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所