一種黏膜免疫疫苗的製作方法
2023-12-10 06:25:02
專利名稱：一種黏膜免疫疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物基因工程技術的疫苗製備，具體說是一種利用減毒的人腸道志賀氏桿菌作為載體製備黏膜免疫疫苗。
背景技術：
由於多數微生物感染發生在黏膜，機體在黏膜免疫組織誘導產生保護性反應和T細胞反應，通過非口服途徑的疫苗難以誘導有效的黏膜免疫反應，理想的黏膜系統保護性抗原運輸載體的研究成為疫苗研究中的重點。本發明前有研究人員利用腸道或和腸道相關組織生長繁殖的細菌和病毒，能夠較有效地刺激局部和系統免疫反應。如應用減毒傷寒沙門氏菌體作為受體菌，表達外源保護性抗原，但尚不足以解決安全性問題。
發明內容
針對上述現有技術部分存在的不足，本發明的目的是提供一種能夠表達外源基因的載體，獲得安全可靠的能夠誘導有效的黏膜免疫反應的疫苗。
本發明的目的是通過以下方法實現的該疫苗由載體分子與抗原分子經基因工程技術按以下步驟製備1).取減毒的福氏志賀氏桿菌培養在含0.01％剛果紅染料的TSA(TrypticSoy agar TSA)培養板上，37℃過夜，挑取紅色菌落，接種於TSB(Tryptic Soybroth TSB)培養基中37℃振搖培養至合適濃度2).取PCVD442載體，目的基因片段，選擇合適的酶切位點，分別經限制性內切酶消化，回收酶切目的基因片段和載體，經T4DNA連接酶在16℃下行連接反應，得到帶有不同目的的基因片段的PCD442質粒；3).取減毒的福氏志賀氏桿菌，經電穿孔將帶有不同目的基因的PCD442質粒分別轉入宿主菌，目的基因經同源重組整合入宿主菌基因組；將基因轉移後的細菌塗布於TSA平板上，37℃培養，將菌落轉移至硝酸纖維素膜上，以目的基因為探針，原位雜交，篩選陽性菌落；4).挑取陽性菌落，接種於TSB培養基中，37℃振搖培養至對數生長中期，收穫細菌，經PAG-SDS電泳後，行Western印跡檢測目的蛋白表達，選取陽性菌落進行在體動物實驗。
目的基因片段為HPV16，18，6，11型的L1、E6、E7基因或HBV表面抗原編碼基因或HIV編碼基因或衣原體編碼主要外膜蛋白的基因和/或淋球菌編碼外膜蛋白的基因片段。
HIV編碼基因是gp120編碼基因。
本發明採用以人減毒志賀氏桿菌為載體，以同源重組技術將目的抗原(如HPV16L1)的編碼基因整合入載體細菌，使其表達目的蛋白，口服帶有目的基因的減毒載體菌，可進入腸上皮細胞、M細胞，表達的目的蛋白可刺激黏膜免疫反應，使免疫細胞產生特異性分泌型IgA，保護黏膜上皮不受相應病毒(如HPV16)的侵襲。
具體實施例方式
發明人給出了以下的實施例，但並不局限於這些實施例。
實施例1HPV—志賀氏菌疫苗本實施例給出了以HPV目的基因片段製成的志賀氏菌疫苗。
採用基因工程技術，用PCVD442自殺克隆載體將HPV基因(如HPV16L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18L1、HPV18E6、HPV18E7、HPV11L1、HPV11E6、HPV11E7、HPV6L1、HPV6E6、HPV6E7)基因經同源重組引入減毒福氐痢疾桿菌如SH42(dsbA突變)以所選取的HPV基因片段為探針，經免疫印跡雜交證實其DNA已整合入細菌基因組中，取選取的HPV基因片段陽性細菌，37℃培養到OD6000.6，離心收菌，經SDS-PAG電泳，電轉移至硝酸纖維素膜上，依次加所選取的兔抗HPV抗體，HRP標記羊抗兔抗體，DAB-H2O2顯色，在57KD處可見陽性條帶。未引入目的基因之陰性對照菌未見相應陽性產物表達。
實施例2B型肝炎預防性疫苗本實施例與實施例1所不同的是，以HBV表面抗原編碼基因替代HPV16L1編碼基因，以HBV表面抗原編碼基因為探針行原位雜交，篩選陽性菌，以針對HBV表面抗原抗體行免疫印跡，檢測抗原表達狀況。其餘均與實施例1同。
實施例3愛滋病預防性疫苗本實施例與實施例1所不同的是，以愛滋病(HIV)編碼基因(gp120)替代HPV16L1編碼基因，以愛滋病(HIV)編碼基因(gp120)為探針行原位雜交，篩選陽性菌落，以針對愛滋病(HIV)抗原的抗體行免疫印跡，檢測抗原表達狀況。其餘均與實施例1同。
實施例4淋病預防性疫苗本實施例與實施例1所不同的是，以衣原體編碼主要外膜蛋白的基因和/或淋球菌編碼外膜蛋白的基因片段，替代HPV編碼基因，以衣原體編碼主要外膜蛋白的基因和/或淋球菌編碼外膜蛋白的基因為探針行原位雜交，篩選陽性菌落，以針對衣原體和/或淋球菌抗原的抗體行免疫印跡，檢測抗原表達狀況。其餘均與實施例1同。
具體應用實例本發明的疫苗能夠達到製備的種類①人乳頭瘤病毒感染；用於預防宮頸癌等與HPV相關腫瘤。
②愛滋病；③B型肝炎；用於預防肝癌。
④淋病；以下用減毒的人志賀氏桿菌作為載體製備人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗為例，進一步對本發明作詳細說明宮頸癌是世界範圍內僅次於乳腺癌的婦女惡性腫瘤、臨床和分子流行病學研究已經證實高危型人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌和宮頸不典型增生的主要始動因子，最少80％以上的宮頸癌標本中可檢出HPV，其中HPV16佔50％以上，其餘部分主要與HPV18、31、45有關；HPV6、11為尖銳溼疣等良性肛生殖區黏膜增生性病變的主要病因，因此，預防HPV感染是降低宮頸癌及其它HPV相關性腫瘤的最為適宜的策略，而應用HPV疫苗是預防HPV感染的最佳途徑。
目前HPV預防性疫苗的研究主要集中於兩個方面，即基因工程重組蛋白疫苗及HPV預防性核酸疫苗，但由於HPV感染是一性傳播疾病，經生殖道黏膜感染，因而保護性免疫在很大程度上取決於生殖道黏膜的免疫狀況。已經證實黏膜免疫系統與全身免疫系統既有聯繫、又有區別，一般來說，為了誘發黏膜免疫反應，經黏膜途徑免疫優於腸外途徑，而現有的策略，無論是蛋白疫苗或核酸疫苗均經腸外途徑，主要誘發全身免疫反應。理想的免疫途徑應是經陰道黏膜免疫以選擇性誘發黏膜保護性免疫反應，問題是HPV疫苗接受對象年齡範圍大(整個性功能活動期)，主要是年輕人，尤其是青春期婦女，包括未婚婦女，HPV致癌潛伏期長，這一免疫途徑難以接受。其次，基因工程蛋白疫苗成本極高，只有在發達國家可行，對發展中國家的病人難以承受；核酸疫苗雖然經濟，且對愛滋病、腫瘤等惡性疾病已進入臨床試驗階段，但對於HPV這種潛在腫瘤病毒感染來說，要付諸實施尚需時日，其效果到底如何，還需要嚴格評價。已有文獻報導，在研中的HPV16蛋白疫苗和DNA疫苗的使用方式是通過直接注射或經陰道免疫。
與已有的技術相比，本發明的突出優點是①、以減毒的人腸道志賀氏桿菌為載體，經腸道免疫，可選擇性誘發黏膜免疫反應，與研製中的HPV16蛋白疫苗、DNA疫苗直接注射或經陰道免疫相比，病人易於接受，製備成本低，特別適合第三世界國家。
②、以往所用的細菌和病毒都能侵入血流，引起菌血症和病毒血症，這對於存在免疫缺陷的受免疫個體也許可帶來致死性災難，因為在發展中國家愛滋病感染已成為疫苗設計中不可忽視的因素，而志賀氐桿菌不侵入血流，不會引起菌血症，更安全。
權利要求
1.一種黏膜免疫疫苗，其特徵在於按以下步驟製備1)取減毒的福氏志賀氏桿菌培養在含0.01％剛果紅染料的TSA培養板上，37℃過夜，挑取紅色菌落，接種於TSB培養基中37℃振搖培養至合適濃度；2)取PCVD442載體，目的基因片段，選擇酶切位點，分別經限制性內切酶消化，回收酶切目的基因片段和載體，經T4DNA連接酶在16℃下行連接反應，得到帶有不同目的基因片段的PCD442質粒；3)取減毒的福氏志賀氏桿菌，經電穿孔將帶有不同目的基因的PCD442質粒分別轉入宿主菌，目的基因經同源重組整合入宿主菌基因組；將基因轉移後的細菌塗布於TSA平板上，37℃培養，將菌落轉移至硝酸纖維素膜上，以目的基因為探針，原位雜交，篩選陽性菌落；4)挑取陽性菌落，接種於TSB培養基中，37℃振搖培養至對數生長中期，收穫細菌，經PAG-SDS電泳後，行Western印跡檢測目的基因蛋白表達，選取陽性菌落進行在體動物實驗。
2.根據權利要求1所述的黏膜免疫疫苗，其特徵在於按以下步驟製備1)取減毒的福氏志賀氏桿菌培養在含0.01％剛果紅染料的TSA培養板上，37℃過夜，挑取紅色菌落，接種於TSB培養基中37℃振搖培養至合適濃度；2)取PCVD442載體，HPV基因片段，如HPV16L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18L1、HPV18E6、HPV18E7、HPV11L1、HPV11E6、HPV11E7、HPV6L1、HPV6E6、HPV6E7，選擇酶切位點，分別經限制性內切酶消化，回收酶切目的基因片段和載體，經T4DNA連接酶在16℃下行連接反應，得到帶有不同HPV基因片段的PCD442質粒；3)取減毒的福氏志賀氏桿菌，經電穿孔將帶有不同目的HPV基因片段的PCD442質粒載體分別轉入宿主菌，目的基因經同源重組整合入宿主菌基因組；將基因轉移後的細菌塗布於TSA平板上，37℃培養，將菌落轉移至硝酸纖維素膜上，以所選取的HPV基因為探針，原位雜交，篩選陽性菌落；4)挑取陽性菌落，接種於TSB培養基中，37℃振搖培養至對數生長中期，收穫細菌，經PAG-SDS電泳後，行Western印跡檢測HPV基因蛋白表達，選取陽性菌落進行在體動物實驗。
3.根據權利要求1所述的黏膜免疫疫苗，其特徵在於按以下步驟製備1)取減毒的福氏志賀氏桿菌培養在含0.01％剛果紅染料的TSA培養板上，37℃過夜，挑取紅色菌落，接種於TSB培養基中37℃振搖培養至合適濃度；2)取PCVD442載體，HBV表面抗原編碼基因片段，選擇酶切位點，分別經限制性內切酶消化，回收酶切HBV表面抗原編碼基因片段和載體，經T4DNA連接酶在16℃下行連接反應，得到帶有HBV表面抗原編碼基因片段的PCD442質粒；3)取減毒的福氏志賀氏桿菌，經電穿孔將帶有HBV表面抗原編碼基因片段的PCD442質粒分別轉入宿主菌，目的基因經同源重組整合入宿主菌基因組；將基因轉移後的細菌塗布於TSA平板上，37℃培養，將菌落轉移至硝酸纖維素膜上，以HBV表面抗原編碼基因為探針，原位雜交，篩選陽性菌落；4)挑取陽性菌落，接種於TSB培養基中，37℃振搖培養至對數生長中期，收穫細菌，經PAG-SDS電泳後，行Western印跡檢測HBV表面抗原編碼基因蛋白表達，選取陽性菌落進行在體動物實驗。
4.根據權利要求1所述的黏膜免疫疫苗，其特徵在於按以下步驟製備1)取減毒的福氏志賀氏桿菌培養在含0.01％剛果紅染料的TSA培養板上，37℃過夜，挑取紅色菌落，接種於TSB培養基中37℃振搖培養至合適濃度；2)取PCVD442載體，HIV編碼基因片段，如gp120編碼基因，選擇酶切位點，分別經限制性內切酶消化，回收酶切目的基因片段和載體，經T4DNA連接酶在16℃下行連接反應，得到帶有HIV編碼基因片段的PCD442質粒；3)取減毒的福氏志賀氏桿菌，經電穿孔將帶有HIV編碼基因片段的PCD442質粒分別轉入宿主菌，目的基因經同源重組整合入宿主菌基因組；將基因轉移後的細菌塗布於TSA平板上，37℃培養，將菌落轉移至硝酸纖維素膜上，以HIV編碼基因為探針，原位雜交，篩選陽性菌落；4)挑取陽性菌落，接種於TSB培養基中，37℃振搖培養至對數生長中期，收穫細菌，經PAG-SDS電泳後，行Western印跡檢測HIV編碼基因蛋白表達，選取陽性菌落進行在體動物實驗。
5.根據權利要求1所述的黏膜免疫疫苗，其特徵在於按以下步驟製備1)取減毒的福氏志賀氏桿菌培養在含0.01％剛果紅染料的TSA培養板上，37℃過夜，挑取紅色菌落，接種於TSB培養基中37℃振搖培養至合適濃度；2)取PCVD442載體，衣原體編碼主要外膜蛋白的基因片段和/或淋球菌編碼外膜蛋白的基因片段，選擇酶切位點，分別經限制性內切酶消化，回收酶切衣原體編碼主要外膜蛋白的基因片段和載體，經T4DNA連接酶在16℃下行連接反應，得到帶有衣原體編碼主要外膜蛋白的基因片段的PCD442質粒；3)取減毒的福氏志賀氏桿菌，經電穿孔將帶有衣原體編碼主要外膜蛋白的基因片段的PCD442質粒自殺載體分別轉入宿主菌，目的基因經同源重組整合入宿主菌基因組；將基因轉移後的細菌塗布於TSA平板上，37℃培養過夜，將菌落轉移至硝酸纖維素膜上，以衣原體編碼主要外膜蛋白的基因為探針，原位雜交，篩選陽性菌落；4)挑取陽性菌落，接種於TSB培養基中，37℃振搖培養至對數生長中期，收穫細菌，經PAG-SDS電泳後，行Western印跡檢測衣原體編碼主要外膜蛋白的基因蛋白表達，選取陽性菌落進行在體動物實驗。
6.根據權利要求1所述的黏膜免疫疫苗，其特徵在於所述目的基因片段為HPV16，18，6，11型的L1、E6、E7基因或HBV表面抗原編碼基因或HIV編碼基因或衣原體編碼主要外膜蛋白的基因或淋球菌編碼外膜蛋白的基因。
7.根據權利要求6所述的黏膜免疫疫苗，其特徵在於所述HIV編碼基因是gp120編碼基因。
全文摘要
本發明涉及一種黏膜免疫疫苗,是利用人減毒志賀氏桿菌為載體,通過基因工程技術將編碼目的抗原的基因整合入載體,其優點在於這種疫苗口服後攜帶目的抗原基因的減毒志賀氏桿菌進入腸黏膜上皮細胞,即可表達目的抗原蛋白,選擇性刺激黏膜免疫反應,可用於預防經黏膜侵入的致病微生物的感染,如人乳頭瘤病毒,愛滋病病毒、B型肝炎病毒、衣原體和淋球菌感染等性傳播疾病。
文檔編號A61P43/00GK1342495SQ01128759
公開日2002年4月3日 申請日期2001年8月20日 優先權日2001年8月20日
發明者王一理, 於軍, 司履生 申請人:西安交通大學