一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法
2023-12-10 03:20:31
專利名稱：一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法
技術領域：
本發明涉及一種多羥基酮糖，尤其是涉及一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法。
技術背景
二羥基丙酮，簡稱DHA，是一種最簡單的多羥基酮糖，分子式為C3H2O3,作為一種重要的化工精細原料廣泛地應用於醫藥、農藥、塗料、染料顏料、香精香料、食品添加劑、飼料添加劑、日用化學品、高分子單體及聚合物、化工助劑、有機化工原料等行業，其中廣泛應用於化妝品中，它可與皮膚表層自由胺基酸結合，在皮膚表面形成一層細密的薄膜，反射太陽光，屏蔽紫外線，阻止水份過度蒸發，起到很好的保溼和防曬作用。目前，二羥基丙酮的合成方法主要有三種，即化學合成法、酶法和發酵法。其中，微生物發酵法製備二羥基丙酮具有原料來源廣泛、生產成本低、產品純度高等優點，是生產二羥基丙酮的主要方法，在全球二羥基丙酮生產中，僅有10 %是由化學合成法生產的，其餘90 %都是由發酵法生產。
新世紀，石油供需矛盾日益尖銳，石油化工及石化燃料燃燒造成的環境問題日益突出，開發新的對環境無害的可再生能源日益得到各國的重視。生物柴油是一種環境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年來，生物柴油產業異軍突起，飛速發展，而廢甘油是生物柴油生產過程中的主要副產物，每生產1噸生物柴油會副產0. 1噸廢甘油。隨著世界範圍內生物柴油需求量和生產量的迅猛增長，廢甘油成為豐富而廉價的原料，對它的有效利用也成為緊迫的課題。基於這一現狀，本發明開發了利用微生物轉化廢甘油製備二羥基丙酮的技術。
目前，以甘油為原料製備二羥基丙酮主要有兩種方法
1.化學法轉化甘油製備二羥基丙酮
中國專利2008100616M公開一種化學法轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，其特點是以甘油為原料，在反應溫度為45 90°C、反應時間為1 30h。該方法需要使用碳負載金屬作為催化劑，生產成本較高，另外反應過程中需要大量使用試劑，會對環境造成汙染。
2.微生物發酵甘油製備二羥基丙酮
中國專利201010271671公開一種微生物發酵甘油製備二羥基丙酮的方法，該方法所使用的菌種為氧化葡萄糖酸桿菌，該菌株存在細胞密度低，培養條件高，發酵時間長， 生產強度低的缺點。發明內容
本發明的目的是提供一種轉化甘油製備二羥基丙酮的新方法。
本發明的具體步驟如下
將嗜鹽黃桿菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l接入種子培養基中培養，然後把種子液加入含甘油的發酵培養基中，進行好氧發酵，流加NaOH溶液，發酵後得二羥基丙酮。
所述菌種為嗜鹽黃桿菌(Flavobacteriumhalmsphilum) ch20-l,已於 2011 年 08月31日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，該保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.5207。
所述種子培養基為陳海水1000ml，蛋白腖5g，酵母膏5g，K2HP042g,山梨醇5g， ρΗ6· 0,0. IMpa 滅菌 20min。
所述接入含有甘油的種子培養基中培養的溫度可為25 40°C，培養的時間可為 16h ；所述含甘油的發酵培養基中的甘油的濃度可為IL發酵培養基中含有50 150g甘油； 所述發酵培養基的組成(g/L)可為蛋白腖5，酵母膏5，K2HP042，廢甘油50 150，MgS04*7H20 0. 2，MnSO4 · H2O 0. 3，pH 6. 0,0. IMPa滅菌20min ；所述進行好氧發酵的條件可為30°C條件下進行好氧發酵，發酵過程中通入2 6vvm空氣，攪拌轉速100 400rpm，控制pH值為6 ； 所述NaOH溶液可採用2 3M的NaOH溶液。
在發酵過程中測定菌體乾重濃度、甘油和二羥基丙酮濃度。
本發明所用甘油為生物柴油生產過程中的副產物甘油。
所述嗜鹽黃桿菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l從紅樹林土壤樣品中篩選得到。
所述嗜鹽黃桿菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l 的 16S rRNA 序列如附錄中序列表所示。
本發明的突出優點在於使用微生物將廉價原料廢甘油轉化為具有高附加值的生物基平臺化合物二羥基丙酮，找到了一條有效利用廢甘油的出路。此外，本發明所用菌種無生物安全性方面的隱患；同時發酵時間短，生產強度高，細菌培養條件低，降低了生產成本。
圖1為二羥基丙酮的標準曲線圖。在圖1中，橫坐標為DHA濃度(g/L)，縱坐標為吸光度；標準方程為1 = 2. 1573X-0. 008，相關係數為R2 = 0. 9989。
圖2為甘油標準品的標準曲線圖。在圖2中，橫坐標為甘油含量(g/L)，縱坐標為吸光度；標準方程為y = -0. 01914+0. 04373x，相關係數為R2 = 0. 9989。
具體實施方式
實施例1
(1)菌種的分離和純化
將新鮮的土壤樣品Ig或水樣Iml置於IOOmL富集培養基中，富集培養3 7d，取富集培養液5ml轉入新的富集培養基中，依次轉接3代。取富集培養液1ml，以10倍梯度連續稀釋，選擇合適稀釋度(10_4，10_5，10_6)的菌懸液0.5ml，與分離培養基混合後倒平板。 30°C下，培養4 後，挑取單菌落。將得到的菌落轉入液體發酵培養基，30°C下振蕩培養30h 後，按下述方法測定發酵液中二羥基丙酮濃度
採用二苯胺顯色法測定二羥丙酮(DHA)標樣0.500g至IOOmL容量瓶中，加水定容至刻度，即得二羥丙酮濃度為5. 00g/L的標準儲備液。移取DHA標準儲備液各1. 0、 2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,8. 0,10. OmL 至 IOOmL 容量瓶中，定容至刻度，即得濃度為 0. 05,0. 1、 0. 15、0. 2、0. 25、0. 3、0. 4,0. 5g/L的標準溶液，取0. 5mL標準溶液與4. 5mL 二羥基丙酮顯色液在試管中混勻，置於沸水浴中反應15min，流動水冷卻後於721分光光度計、620nm處測定吸光值。
利用甘油與Cu2+在鹼性條件下生成深藍色絡合物，通過比色法測定甘油含量。甘油含量的適宜範圍及標準曲線的繪製，當溶液中甘油含量超過10g/L時，吸光度與甘油含量不再呈線性關係，故待測溶液中甘油含量不宜超過10g/L，將甘油含量在2. 5 10g/L的各點作標準曲線。
檢測結果如圖1和2所示，二羥基丙酮的標準曲線為y = 2. 1573X-0. 008，R2 = 0. 9989 ；甘油的標準曲線為 y = 0. 04373χ_0· 01914，R2 = 0. 9989。
最終獲得一株可以轉化甘油高產二羥基丙酮的菌株ch20_l。
菌種的分離和純化過程中所用培養基組成如下
土壤富集培養基(g/L)陳海水1000 (ml)，酵母膏5，蛋白腖5，0. IMpa滅菌20min。
分離培養基(g/L)陳海水1000 (ml)，酵母膏5，K2HP042,廢甘油50， MgSO4 · 7Η200· 2，MnSO4 · H2O 0. 3，瓊脂粉 20，pH 6. 0,0. IMPa 滅菌 20min。
所述發酵培養基(g/L):蛋白腖5，酵母膏5，K2HP042,廢甘油50-150， MgSO4 · 7Η200· 2，MnSO4 · H2O 0. 3，pH 6. 0,0. IMPa 滅菌 20min。
(2)菌種的鑑定
將上述步驟(1)篩選得到的菌株ch20_l進行形態特徵和16S rRNA序列鑑定，具體過程如下
菌株ch20_l為革蘭氏陰性桿菌，短鏈或成排排列，無芽孢，無鞭毛，無莢膜；其單菌落為圓形、直徑約1 2mm、淡黃色、低凸起、邊緣整齊、半透明狀的光滑型菌落。
菌種ch20_l 的 16S rRNA 序列，其與黃桿菌 Flavobacterium sp. WB2. 4-28 的同源性最高，可達99. 867% ο
對菌株ch20_l進行常規的生理生化鑑定試驗，其結果基本與伯傑細菌鑑定手冊中黃桿菌屬中的嗜鹽黃桿菌特徵相同，命名為Flavobacterium halmsphilum ch20_l。
基於以上特徵，將上述步驟(1)篩選得到的菌株ch20_l鑑定為嗜鹽黃桿菌 (Flavobacterium halmsphilum)ch20_l。
實施例2
(1)發酵方式250ml三角瓶，搖床發酵。
(2)菌種嗜鹽黃桿菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l。
(3)培養基
種子培養基(g/L)陳海水1000(ml)，蛋白腖5，酵母膏5，K2HP042，山梨醇5， pH6. 0,0. IMPa 滅菌 20min。
發酵培養基(g/L)陳海水1000(ml)，蛋白腖5，酵母膏5，K2HP042，廢甘油90， MgSO4 · 7H20 0. 2，MnSO4 · H2O 0. 3，pH 6. 0,0. IMPa 滅菌 20min。
(4)發酵過程
種子培養將嗜鹽黃桿菌接到種子培養基中O50ml三角瓶，裝液量50ml)，30°C下培養16h。
發酵培養將種子液按5%接種量轉接到含90g/l廢甘油的發酵培養基O50ml三角瓶，裝液量50ml)中，在30°C下培養30h。
(5)發酵結果
發酵結束時，發酵液中二羥基丙酮濃度60. 3g/L，生產強度2. 01g/L · h。
實施例3
(1)發酵方式5L機械攪拌發酵罐，通空氣分批發酵
(2)菌種同實施例2
(3)培養基
種子培養基(g/L)陳海水1000(ml)，蛋白腖5，酵母膏5，K2HP042，山梨醇5， pH6. 0,0. IMPa 滅菌 20min。
發酵培養基(g/L)陳海水1000(ml)，蛋白腖5，酵母膏5，K2HP042，廢甘油90， MgSO4 · 7Η20 0. 2，MnSO4 · H2O 0. 3，pH 6. 0,0. IMpa 滅菌 20min。
(4)發酵過程
種子培養同實施例2
發酵培養使用5L發酵罐，裝液量2L，發酵溫度控制在30°C，pH用濃度為3mol/L NaOH溶液自動調節維持在6. 0，將種子液按5%接種量轉接到含90g/l廢甘油的發酵培養基，攪拌轉速200rpm，通入空氣量為6vvm，發酵時間為Mh。
(5)發酵結果
發酵結束時，二羥基丙酮濃度達到70. 2g/L，生產強度為2. 93g/L · h。
實施例4
(1)發酵方式500ml三角瓶，全細胞轉化。
(2)菌種同實施例2。
(3)培養基
種子培養基(g/L)陳海水1000(ml)，蛋白腖5，酵母膏5，K2HP042，山梨醇5， pH6. 0,0. IMpa 滅菌 20min。
全細胞培養基(g/L)廢甘油(甘油含量約96% w/w)70，pH 6. O,MgSO4 ·7Η20 0. 2， (NH4)HPO4L 0，MnSO4 · H2O 0. 3。
(4)轉化過程
種子培養同實施例2
轉化過程生長培養16 20h的細胞於6000r/min離心30min，無菌水洗滌2 3 次，用含6%甘油和0.2% WK2HPO4的無菌水溶液洗滌2次，在同樣的溶液中製成懸浮液0 4°C保存。轉接至裝有IOOmL靜止細胞培養液的500mL三角瓶中，搖床上30°C轉化25h。
(5)轉化結果
發酵結束時，發酵液中二羥基丙酮濃度達到60. 2g/L，生產強度達到2. 50g/L · h。權利要求
1.一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，其特徵在於其具體步驟如下將嗜鹽黃桿菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l接入種子培養基中培養，然後把種子液加入含甘油的發酵培養基中，進行好氧發酵，流加NaOH溶液，發酵後得二羥基丙酮； 所述菌種為嗜鹽黃桿菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20-l,已於2011年08月31日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.5207。
2.如權利要求1所述的一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，其特徵在於所述種子培養基為陳海水1000ml，蛋白腖5g，酵母膏5g，K2HP042g,山梨醇5g，pH 6.0,0. IMPa滅菌 20mino
3.如權利要求1所述的一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，其特徵在於所述接入含有甘油的種子培養基中培養的溫度為25 40°C，培養的時間為16h。
4.如權利要求1所述的一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，其特徵在於所述含甘油的發酵培養基中的甘油的濃度為IL發酵培養基中含有50 150g甘油。
5.如權利要求1所述的一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，其特徵在於所述發酵培養基的組成為蛋白腖5g/L，酵母膏5g/L，K2HP042，g/L廢甘油50 150g/L，MgSO4 ·7Η200. 2g/ L, MnSO4 · H2O 0. 3g/L, pH 6. 0,0. IMPa 滅菌 20mino
6.如權利要求1所述的一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，其特徵在於所述進行好氧發酵的條件為30°C條件下進行好氧發酵，發酵過程中通入2 6vvm空氣，攪拌轉速 100 400rpm,控制pH值為6。
7.如權利要求1所述的一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，其特徵在於所述NaOH溶液採用2 3M的NaOH溶液。
全文摘要
一種轉化甘油製備二羥基丙酮的方法，涉及一種多羥基酮糖。將嗜鹽黃桿菌(Flavobacterium halmsphilum)ch20-1接入種子培養基中培養，然後把種子液加入含甘油的發酵培養基中，進行好氧發酵，流加NaOH溶液，發酵後得二羥基丙酮。使用微生物將廉價原料廢甘油轉化為具有高附加值的生物基平臺化合物二羥基丙酮，找到了一條有效利用廢甘油的出路。所用菌種無生物安全性方面的隱患；同時發酵時間短，生產強度高，細菌培養條件低，降低了生產成本。
文檔編號C12P7/26GK102492732SQ201110378229
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者方柏山, 王兆守, 陳喆 申請人:廈門大學