一種硫酸鹽還原菌快速檢測方法及其試劑盒的製作方法
2023-11-11 19:34:42
一種硫酸鹽還原菌快速檢測方法及其試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及油田水樣檢測處理【技術領域】，特別涉及一種硫酸鹽還原菌快速檢測方法及檢測用試劑盒，本發明的方法首先將待測水樣預處理除雜，然後向水樣中加入細菌裂解液使水樣中的APS菌體充分裂解釋放，再加入反應底物，該酶催化反應底物發生氧化還原反應，在反應體系中加入顯色底物，酶催化的反應產物與顯色底物結合，得到有顏色的反應終產物。根據反應顏色的深淺得到待測水樣中SRB的含量。本發明還根據上述檢測方法將SRB檢測用裝置和試劑標準化成試劑盒，以便於各種施工現場的檢測。本發明能夠有效去除油田水樣中雜質幹擾，使檢測周期大大縮短，並大幅度提高檢測的準確性和敏感性。
【專利說明】—種硫酸鹽還原菌快速檢測方法及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及油田水樣檢測處理【技術領域】,特別涉及^-種硫酸鹽還原菌快速檢測方法及檢測用試劑盒。
【背景技術】
[0002] 硫酸鹽還原菌(SRB)廣泛存在於油田的油井和汙水等缺氧環境中。它在缺氧或厭氧條件F能夠利用附著於金屬表面的有機物作為碳源，並利用細菌生物膜內產生的氫將硫酸鹽還原成硫化氫，對金屬設備具有極強的腐蝕作用,造成嚴重損失。
[0003]目前使用的測試瓶法是國內外最為常用SRB檢測方法。這種方法較為簡捷,但也存在一些不足之處,其中最主要的不足是耗時過長,一般需要7天,而且檢測的準確性和靈敏度不高。因此，目前國內外大量開展了 SRB快速檢測技術的研究。研究方向集中三個方面:1、改進工藝,提高測試瓶法的敏感性。2、定量檢測SRB的特定基因的方法，即檢測SRB遺傳標記的分子生物學方法，主要有PCR、PCR-RFLP和原位雜交,常用的遺傳標記主要有SRB16S rRNA基因的特徵序列、亞硫酸鹽異化酶基因和APS基因等。3、基於SRB代謝產物的快速檢測技術。
【發明內容】
[0004]本發明針對現有技術中SRB檢測方法耗時長,檢測的準確性和靈敏度不高的問題提供一種硫酸鹽還原菌快速檢測方法及其試劑盒，以縮短油田採出水樣中種硫酸鹽還原菌的檢測周期，並且提高檢測的準確性和靈敏性。
[0005]本發明的硫酸鹽還原菌快速檢測方法包括如下步驟:
I)取體積為L的待測水樣過濾並結合離心洗滌預處理水樣以去除水樣中幹擾酶活性的雜質，最終將水樣濃縮至L 5ml並收集於離心管中；
(2)向預處理過的水樣中滴入100μ I細菌裂解液,使水樣中的硫酸鹽還原菌充分裂解並釋放,所述細菌裂解液包括 30 mmol/1 Tris-HC1，2 mmol/lEDTA, 100 mmol/1 KaC!,
0.1% Triton X-100, 50 μ g/ml溶菌酶,0.5 μ I/ml苯甲基磺醯氟；本步中使用裂解液可使待測水樣中的細菌充分釋放胞體及膜上的腺苷_5』 -磷酸硫酸鹽還原酶(adenosine-5』-phosphosulfate reductase APS),此種酶為SRB中特有特異性酶，並且本方法中使用的裂解液可以實現溫合裂解決並保持酶的活性；
(3)分別取體積為150μ I硫酸鹽還原菌含量已知並且數量級不同的溶液若干份,再取150 μ I步驟(2)中裂解過的水樣，然後分別向所取的多個所述已知含量的硫酸鹽還原菌溶液及裂解過的水樣中滴入50 μ I的反應底物,並混合均勻避光反應3分鐘，所述反應底物包括 L 5 mmol/L K3Fe (CN) 6> 2.5 mmol/L 腺苷-5'-憐酸、2.5 inmo I /1.Na2S03> 1.5 mmol/L EDTAU00 mmol/L MES緩衝液；本步中，APS還原酶可催化反應底物發生氧化還原反應生成亞鐵離子；
(4)分別向步驟(3)的各溶液中加入50μ I的顯色劑,並混合均勻避光反應3分鐘，使其充分發生顯色反應生成藍色的亞鐵氰化鐵反應液，所述顯色劑為質量濃度的0.5% 3,
3-雙(4-羥基苯基)-1 (3H)-異苯並呋喃酮；本步中，鐵氰化鉀與顯色液混合得到鐵鏽指示劑，並與反應體系中生成的亞鐵離子反應，生成藍色的亞鐵氰化鐵；
(5)將步驟4中各已知含量硫酸鹽還原菌溶液反應液顯色後的顏色作為比對樣本，通過顏色對比法或OD值檢測對比法確定待測水樣的中硫酸鹽還原菌含量；因各已知含量APS溶液經氧化還原和顯色反應後生成的亞鐵氰化鐵溶液的濃度也有所不同，溶液呈現的顏色也不同,本步驟中將待測樣本顯色後的顏色與已知樣本顯色後的顏色對比，以便於能過對比的方法確定待測樣本的的濃度；
(6)再根據步驟(1)中的水樣取量換算原待測水樣中硫酸鹽還原菌含量因上步中檢測的濃度值是步驟(1)中取樣過濾濃縮後的樣本濃度，本步中，將上步中實際測得值與步驟
(I)中體積相除可以確定原待測液中APS的含量。 [0006]為進一步提高檢測的準確度和靈敏性,如果步驟(5)中測得的待測水樣的硫酸鹽還原菌數量小於100個/ml,則取20-50倍大體積的水樣重複步驟(1)_ (6)進行檢測。本步驟中，通過濃縮過濾更大體積的水樣可以進一步精確測定水樣中的APS濃度，提高檢測的靈敏性。
[0007]為準確測定不同濃度範圍內的APS含量並提供對比參考,所述步驟(3)已知含量的硫酸鹽還原菌溶液的含量分別取100個/ml、1000個/ml、10000個/ml、100000個/ml和1000000 個 /ml。
[0008]為便於檢測結果的比對，所述步驟(5)中的顏色對比法指將各已知含量的硫酸鹽還原菌溶液顯色反應後反應液的顏色製成標準比色卡,然後將待測液顯色反應後的顏色與所述標準比色卡比對，以確定待測水樣中硫酸鹽還原菌含量。
[0009]為便於檢測結果的比對，所述步驟(5)中的OD值檢測對比法是指將各已知含量的硫酸鹽還原菌溶液顯色反應後反應液的顏色用化學發光儀分別檢測其0D420值，再用硫酸鹽還原菌溶液含量和0D420值分別作縱作標和橫作標製成SRB含量快速檢測標準曲線,然後將待測液顯色反應後的顏色用化學發光儀檢測其0D420值,再通過所述SRB含量快速檢測標準曲線確定待測水樣中硫酸鹽還原菌的含量。
[0010]為進一步實現本發明，所述步驟(1)中預處理方法為取待測水樣10—30ml,用200目的篩網過濾水樣中的固體微粒雜質,用無菌超純水洗滌篩網及網上測的雜質微粒1-2次,並將過濾後的水樣和清洗濾網後的無菌水一同收集後分裝到若干個離心管中，以2500-3000 rpm進行離心分離,棄去上清液，收集沉澱的菌體，分別用少量無菌超純水懸浮，並用漩渦振蕩器混均，合併各離心管中的菌懸液至一支容積為1.5ml的離心管中，離心收集沉澱的菌體,用無菌超純水洗滌並離心收集沉澱2至3次以去除水樣中可溶性雜質。
為進一步提高檢測精度，所述步驟(3)中的反應底物及各反應液的溫度為25 V —35 °C ,反應底物的PH值為7。
[0011]為進一步實現本發明的快速檢測的目的，以方便在施工現場取樣檢測,本發明根據上述方法還提供一種硫酸鹽還原菌快速檢測試劑盒，包括:
A)200目篩網…一隻；
B)細菌裂解液A和B各一瓶,每瓶25ml，所述A中包括30mmol/1 Tris-HCl, 2 mmol/1EDTA, 100 mmol/1 NaCl),所述 B 中包括 0.1% Triton X-100，50 μ g/ml 溶菌酶,0.5μ I/ml苯甲基磺醯氟；
O陽性對照液和陰性對照液各I瓶，每瓶25 ml,所述陽性對照液為0.8 IU APS還原酶溶液，所述陰性對照液為MES緩衝液；
D)反應底物I瓶25m!,所反應底物包括1.5 inmo!/L K3Fe (CK)6,2.5 mmol/L腺苷-5,-磷酸、2.5 mmol/L Na2SO3U.5 mmol/L EDTAU00 mmol/L MES 緩衝液；
E)顯色劑一瓶25ml,所述顯色劑為質量濃度0.5%的3, 3-雙(4-羥基苯基)_1(3H)_異苯並呋喃酮F)
F)微孔反應板若干個。
[0012]本發明的試劑盒,將檢測用試劑及測試關鍵裝置標準化後製成試劑盒,可以方便在各種施工現場取樣採集後測試，並且試劑盒中還同時配備了濃度已知的APS陽極對照液和無APS的陰極對照液，以便於判定測試結果的準確性和靈敏性。
[0013]本發明的有益效果在於:
1)快速得到檢測結果。通過將測試使用的試劑和裝置標準化成試劑盒，並且對比測試時使用的標準比色卡或SRB含量快速檢測標準曲線只需事先按本發明的方法製作好，在測試中可直接使用。經多次測試統計，採用本發明的試劑盒和方法實際檢測中可在I h內得到檢測結果，比傳統方法大大縮短檢測時間；
2)去除幹擾。預處理能夠有效去除水樣中各種雜質幹擾，以提高檢測精度；
3)簡便易行，便於現場檢測。使用裂解液得到APS，僅需要小型離心機，無需特殊的儀器設備即可進行，適合油田現場使用；
4)增加靈敏性。採集大體積水樣,通過濃縮,增加了檢測的靈敏性,可測到1-10個/ml
SRB ；
5)特異性強。APS只有在SRB中存在，其他細菌中不含有該酶，因而，該方法反應的只能是樣品中SRB的含量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為採用本發明的方法製作的SRB含量快速檢測標準曲線圖。
[0015]圖2為採用本發明的方法製作的標準比色卡的示意圖。
【具體實施方式】
[0016]下面以具體實施例詳細說明採用本發明的試劑盒及其測試方法。
[0017]測試水樣前，取APS含量分別為100個/ml、1000個/ml、10000個/ml、100000個/ml和1000000個/ml的已知溶液,按本發明的方法經反應底物催化和顯色劑反應後溶液顯
示的顏色通過化學發光儀檢測其OD值,再製成如圖1所示的SRB含量快速檢測標準曲線圖和圖2所示的標準比色 卡。
[0018]待測水樣通過如下方法測試:
(I)取待測的油田採出水樣15ml,用200目的篩網過濾並且篩網下側放置燒杯承接濾後水樣，用無菌超純水洗滌篩網及網上測的雜質微粒1-2次,並將過濾後的水樣和清洗濾網後的無菌水一同收集後分裝到10個1.Sm I離心管中，以2500-3000 rpm進行離心分離，棄去上清液，收集沉澱的菌體,分別用少量無菌超純水懸浮，並用鏇渦振蕩器混均，合併各離心管中的菌懸液至一支離心管中，離心收集沉澱的菌體,用無菌超純水洗滌並離心收集沉澱2至3次以去除水樣中可溶性雜質；(2)向洗滌後的溶液中分別滴入50 μ I的裂解液A和裂解液B，混合均勻裂解後取三份150 μ I裂解後的溶液分別轉入三個微量反應板的小孔中；
(3)取陽性對照液和陰性對照液各150μ I,分別加入另外的微量反應板的小孔中；
(4)分別向裝有待測樣品、取陽性對照液和陰性對照液的各微量反應板中加入50μ I的反應底物，輕輕搖晃30秒以混勻，並且避光反應3分鐘；
(5)再向各微量反應板小孔中加入50μ I顯色劑，25°C避光反應3min ；
(6)反應後觀察微量反應板中反應液的顏色,陰性對照管中無顏色變化，陽性對照管中出現藍色時觀察各待測樣品的顏色變化，並用化學發光儀檢測____t述溶液的OD值，然後參照圖1或圖2對比得出溶液的SRB含量值,取三次測量結果的平均值，然後用此值除以原始取樣體積既得出待測水樣中的SRB含量。
[0019]實施中，共抽取了六個不同的採出水水樣採用本發明的試劑盒進行測試,測試結果如表1所示。表中，樣品編號I和2為陰性對照液和標準的陽性對照液，樣品編號3— 8為從不同的施工現場取樣的待測水樣。同時為便於測試結果的對比，測試時還採用了現有技術中的測試瓶絕跡稀釋法對8個樣品進行測試。
[0020]表1
【權利要求】
1.一種硫酸鹽還原菌快速檢測方法，包括如下過程， (1)取體積為L的待測水樣過濾並結合離心洗滌預處理水樣以去除水樣中幹擾酶活性的雜質，最終將水樣濃縮至L 5ml並收集於離心管中； (2)向預處理過的水樣中滴入100μ I細菌裂解液，使水樣中的硫酸鹽還原菌充分裂解並釋放,所述細菌裂解液包括30 mmol/1 Tris-HCl, 2 mtnol/lEDTA, 100 mmol/1 NaCl, 0.1%Triton X-100, 50 μ g/ml 溶菌酶，0.5 μ I/ml 苯甲基磺醯氟； (3)分別取體積為150μ I硫酸鹽還原菌含量已知並且數量級不同的溶液若千份,再取150 μ I步驟(2)中裂解過的水樣，然後分別向所取的多個所述已知含量的硫酸鹽還原菌溶液及裂解過的水樣中滴入50 μ I的反應底物,並混合均勻避光反應3分鐘,所述反應底物包括 1.5 mmol/L K3Fe (CN)6、2.5 mmol/L 腺昔-5'-憐酸、2.5 mmol /I, Na2SO3λ 1.5 mmol/L EDTA、100 mmol/L MES 緩衝液； (4)分別向步驟(3)的各溶液中加入50μ I的顯色劑，並混合均勻避光反應3分鐘，使其充分發生顯色反應生成藍色的亞鐵氰化鐵反應液,所述顯色劑為質量濃度的0.5% 3，3-雙(4-羥基苯基)-1 (3Η)-異苯並呋喃酮； (5)將步驟4中各已知含量硫酸鹽還原菌溶液反應液顯色後的顏色作為比對樣本，通過顏色對比法或OD值檢測對比法確定待測水樣的中硫酸鹽還原菌含量； (6)再根據步驟(1)中的水樣取量換算原待測水樣中硫酸鹽還原菌含量； 根據權利要求1所述的硫酸鹽還原菌快速檢測方法，其特徵在於，如果步驟(5)中測得的待測水樣的硫酸鹽還原菌數量小於100個/ml，則取20-50倍大體積的水樣重複步驟(O- (6)進行檢測。
2.根據權利要求1所述的硫酸鹽還原菌快速檢測方法，其特徵在於,所述步驟(3)中已知含量的硫酸鹽還原菌溶液的含量分別取100個/ml、1000個/ml、10000個/ml、100000個/ml 和 1000000 個/ml。
3.根據權利要求1所述的硫酸鹽還原菌快速檢測方法，其特徵在於,所述步驟(5)中的顏色對比法指將各已知含量的硫酸鹽還原菌溶液顯色反應後反應液的顏色製成標準比色卡，然後將待測液顯色反應後的顏色與所述標準比色卡比對，以確定待測水樣的中硫酸鹽還原菌含量。
4.根據權利要求1所述的硫酸鹽還原菌快速檢測方法,其特徵在於,所述步驟(5)中的OD值檢測對比法是指將各已知含量的硫酸鹽還原菌溶液顯色反應後反應液的顏色用化學發光儀分別檢測其0D420值,再用硫酸鹽還原菌溶液含量和0D420值分別作縱作標和橫作標製成SRB含量快速檢測標準曲線，然後將待測液顯色反應後的顏色用化學發光儀檢測其0D420值，再通過所述SRB含量快速檢測標準曲線確定待測水樣中硫酸鹽還原菌的含量。
5.根據權利要求1所述的硫酸鹽還原菌快速檢測方法,其特徵在於,所述步驟(1)中預處理方法為取待測水樣10 — 30ml,用200目的篩網過濾水樣中的固體微粒雜質,用無菌超純水洗滌篩網及網上側的雜質微粒1-2次，並將過濾後的水樣和清洗濾網後的無菌水一同收集後分裝到若干個離心管中，以2500-3000 rpm進行離心分離，棄去上清液，收集沉澱的菌體，分別用少量無菌超純水懸浮,並用漩渦振蕩器混均，合併各離心管中的菌懸液至一支離心管中，離心收集沉澱的菌體,用無菌超純水洗滌並離心收集沉澱2至3次以去除水樣中可溶性雜質。
6.根據權利要求1所述的硫酸鹽還原菌快速檢測方法,其特徵在於,所述步驟(3)中的反應底物及各反應液的溫度為25°C—35°C，反應底物的PH值為7。
7.一種硫酸鹽還原菌快速檢測試劑盒，其特徵在於，包括 A)200目篩網一隻； B)細菌裂解液A和B各一瓶,每瓶25ml,所述A中包括30mmol/1 Tris-HCl, 2 mmol/1EDTA, 100 mmol/1 NaCl),所述 B 中包括 0.1% Triton X-100, 50 μ g/ml 溶菌酶,0.5μ 1/ml苯甲基磺醯氟； C)陽性對照液和陰性對照液各I瓶,每瓶25ml,所述陽性對照液為0.8 IU APS還原酶溶液，所述陰性對照液為MES緩衝液； D)反應底物I瓶25ml，所反應底物包括1.5 mmol/L K3Fe (CN)6,2.5 mmol/L腺苷-5'-磷酸、2.5 mmol/L Na2SO3U.5 mmol/L EDTA,100 mmol/L MES 緩衝液； E)顯色劑一瓶25ml，所述顯色劑為質量濃度0.5%的3, 3-雙(4-羥基苯基)-1(3H)-異苯並呋喃酮F) F)微孔反應板若千個。
【文檔編號】G01N21/78GK103983636SQ201410213154
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】楊帆, 王彪, 孟章進, 林晶晶, 姚峰, 吳偉林 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司江蘇油田分公司