分離的編碼t細胞誘導因子或白介素－21的核酸分子,其編碼的蛋白和其應用的製作方法

2023-12-08 22:17:26 1

專利名稱：分離的編碼t細胞誘導因子或白介素－21的核酸分子,其編碼的蛋白和其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及新分離的核酸分子及其應用。該核酸分子顯示可被白介素-9(「IL-9」)上調。本文還公開了這些核酸分子所編碼的蛋白。這些分子曾被稱為「T細胞衍生的誘導因子」或「TIFs」；但是現在它們被稱為「白介素-21」或「IL-21」，也叫做「IL-TIF」。為此，這些術語在本文中是可以相互替換的。這些核酸分子編碼的蛋白可誘導細胞中STAT活化。它們可用於如刺激靶組織再生。而且，它們的抑制劑或拮抗劑(antagonist)可用於延遲、阻滯或抑制其它組織的分化。
背景技術：
和現有技術在過去十年中，對免疫系統及其調節作用的了解不斷深入。其中一個倍受矚目的領域是對調節免疫系統的蛋白和糖蛋白的研究。這些分子中最了解的家族之一是細胞因子。這些分子參與細胞間「通信」。細胞因子家族的個別成員參與了更廣泛的病理過程，如癌症和過敏症。一方面細胞因子參與病理過程，另一方面它們也具有治療價值。
白介素是其中一類細胞因子。有關白介素的文獻很多。不可能窮舉本領域的全部專利，僅示範性地舉例包括Mertelsmann等的U.S.Patent No.4,778,879；Stern的U.S.Patent No.4,490,289；Mark等的U.S.PatentNo.4,518,584；以及Miyaji等的U.S.Patent No.4,851,512，它們都涉及白介素-2或「IL-2」。涉及白介素-1(「IL-1」)的其它專利，如Cosman的U.S.Patent No.4,808,611。所有這些專利均全文引入作為參考。涉及不同白介素的更近期專利包括U.S.Patent No.5,694,234(IL-13)；5,650,492(IL-12)；5,700,664；5,371,193和5,215,895(IL-11)；5,728,377；5,710,251；5,328,989(IL-10)；5,580,753，5,587,302，5,157,112，5,208,218(IL-9)；5,194,375，4,965,195(IL-7)；5,723,120，5,178,856(IL-6)和5,017,691(IL-4)。對專利文獻的粗略回顧顯示，白介素家族成員的特定多樣。可以設想更大的細胞因子家族將顯示更多的多樣性。參見，如Aggarwal等的Human CytokinesHandbook For Basic AndClinical Research(Blackwell Scientific Publications，1992)，Paul編，Fundamental Immunology(Raven Press，1993)，763-836頁，「T-CellDerived Cytokines And Their Receptors」，以及「ProinflammatoryCytokines and Immunity」。所有引用的文獻均全文引入作為參考。
各種細胞因子之間的關係很複雜。從引用的文獻可見，特定細胞因子水平的增高或降低可以直接或間接影響受試者所產生的其它分子的水平。受影響的分子有些是其它細胞因子。
白介素-9，曾被稱為「P40」，是T細胞衍生的分子，最初被鑑定為支持T4細胞系的持久抗原非依賴性生長的因子。見如Uyttenhove等，Proc.Natl.Acad.Sci.856934(1988)，和Van Snick等，J.Exp.Med.169363(1989)，以及Simpson等，Eur.J.Biochem.183715(1989)，均引入作為參考。
首先觀察到IL-9對限制性T4細胞系的活性，但未觀察到對CTL或新分離的T細胞的活性。見如Uyttenhove等，同上，和Schmitt等，Eur.J.Immunol.1921679(1989)。當實驗確定IL-9和稱作T細胞生長因子III(「TCGF III」)的分子與MEA(肥大細胞生長增強活性)作用相同時，其活性範圍擴大了，其中MEA是可增強骨髓來源的肥大細胞對IL-3的增殖應答的因子，可見於Hültner等，Eur.J.Immunol.和U.S.Patent No.5,164,317，這兩篇文獻均引入作為參考。還發現人型IL-9刺激成巨核細胞白血病的增殖。可參見Yang等，Blood741880(1989)。對IL-9的研究顯示其還可以支持紅細胞集落形成(Donahue等，Blood 75(12)2271-2275(6-15-90))；促進髓系紅細胞爆發形成的增殖(Williams等，Blood 78(8)306-311(9-1-90))；支持成人和胎兒來源的BFU-E’s的克隆成熟(Holbrook等，Blood 77(10)2129-2134(5-15-91))。IL-9的表達還與霍奇金病和大細胞退行性淋巴瘤有關(Merz等，Blood 78(8)1311-1317(9-1-90))。對易患或不易患支氣管過度反應的小鼠的遺傳分析揭示，這一模型與IL-9基因的聯繫，及IL-9產量與易感性的關係(Nicolaides等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9413175-13180，1997)。人類遺傳學研究也指出IL-9和IL-9R基因是哮喘的候選基因(Doull等，Am.J.Respir.Crit.CaTe Meded.，153，1280-1284，1996；Horoyd等，Genomics52，233-235，1998)。同樣，對IL-9轉基因小鼠的研究證實IL-9表達增加導致肺肥大細胞增生病，嗜酸細胞增多症，支氣管過度反應和高水平的IGE(Temann等，J.Exp.Med.188，1307-1320，1998；Godfraind 等，J.Immunol.160，3989-3996，1998；McLane等，Am.J.Resp.Cell.Mol.19713-720(1999))。綜上所述，這些觀察有力地說明IL-9在該疾病中發揮重要作用。另有研究表明IL-9及其突變蛋白與哮喘和過敏有關。見PCT申請US96/12757(Levitt等)和PCT US97/21992(Levitt等)，均引入作為參考。
已知IL-9能夠影響受試者體內其它分子的水平。參見Louahed等，J.Immunol.1545061-5070(1995)；Demoulin等，Mol.Cell.Biol.164710-4716(1996)，均引入作為參考。還認識到受影響的分子在生物系統中具有自己的功能。例如，Demoulin等顯示IL-9的眾多已知活性由STAT轉錄因子的活化介導。因此，一直在嘗試對其存在和/或水平受其它分子如細胞因子影響的分子進行鑑定。
以下內容將描述這類分子。發現編碼本發明蛋白的核酸分子在IL-9存在時表達，缺乏IL-9時不表達。因此，這些分子尤其是受試者中IL-9的表達或效應的「標誌」。這些曾被稱為T細胞衍生的誘導因子或「TIF」的分子現在被稱為白介素-21，或「IL-21」。下面的描述將顯示本發明的這些及其它特點。
優選實施例詳述實施例1已知小鼠淋巴細胞系BW5147可在體外生長，且其培養基中不需加入任何細胞因子。為確定經IL-9誘導的基因，BW5147樣品用或不用IL-9(200U/ml)培養24小時。然後，用異硫氰酸胍裂解，CsCl梯度離心，分離總RNA。這些是本領域公知技術。之後，用oligo(dT)纖維素柱從總RNA中純化多聚腺苷化RNA。然後用分離的polyA RNA生成雙鏈cDNA。使用商業可獲得的oligo(dT)引物。3-5μg polyA RNA的任意部位與1μg寡聚dT加熱至70℃，10分鐘，然後與5x第一鏈緩衝液(250mM HCl(pH8.3)，375mMKCl，15mM MgCl2)，10mM二硫蘇糖醇，500μM脫氧核苷三磷酸，和800U逆轉錄酶一起孵育。反應總體積是20μl，37℃反應1小時。由此合成第一條cDNA鏈。加入30μl的5x第二鏈緩衝液(100mM Tris-HCl(pH6.9))，450mM KCl，23mM MgCl2，0.75mMβ-NAD+，50mM(NH4)2SO4，60U大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶，2U的大腸桿菌RNase H，10U的大腸桿菌DNA連接酶，和250μM脫氧核苷三磷酸，終體積150μl，來實現第二鏈的合成。混合物在16℃孵育2小時。
產物用酚-氯仿抽提，乙醇沉澱。cDNA終產物重懸於200μl TE。
對接受刺激的BW5147細胞(下文中稱為「試驗物」(tester))，和平行的未受刺激的BW5147(下文中稱為「對照物」(driver))進行這些步驟。實施例2根據已知的方法將實施例1中製備的cDNA進行扣除克隆(sub tractloncloning)。為此，製備了6個寡核苷酸5′-AGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA-3(SEQ ID NO1)；5′-GATCTGCGGT GA-3′(SEQ ID NO2)；5′-ACCGACGTCG ACTATCCATG AACA-3′(SEQ ID NO3)；5′-GATCTGTTCA TG-3′(SEQ ID NO4)；5′-AGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA-3′(SEQ ID NO5)；和5′-GATCTTCCCT CG-3′(SEQ ID NO6).
這些序列作如下使用。雙鏈cDNA(2μg)用限制性內切酶DpnII消化，用酚-氯仿抽提，乙醇沉澱，重懸於20μl TE(100mM Tris-HCl(pH7.5)；1mM EDTA)中。12μl酶切的cDNA(1.2μg)與4μl脫鹽的SEQ ID NO1(2mg/ml)，4μl脫鹽的SEQ ID NO2(1mg/ml)，10μl 5x銜接子緩衝液(330mM Tris-HCl，pH7.6，50mM MgCl2，5mM ATP，7μl DDT(100mM)，和28μl水混合，使所述cDNA連接到雙鏈SEQ ID NO1和2。加熱該混合物到50℃，使寡核苷酸之間及與樣品DNA間退火，然後冷卻到10℃ 1小時以上，再加入5μl T4 DNA連接酶，在12-16℃孵育12-14小時。加入140μl TE稀釋。然後用200μl樣品以如下方式進行PCR。實施例3為進行PCR，取200μl樣品與2μg SEQ ID NO1在72℃加熱3分鐘，去除與實施例2中產物雜交的SEQ ID NO2，其中所述樣品是含有2μl連接產物的66mM Tris-HCl，pH8.8，4mM MgCl2，16mM(NH4)2SO4，33μg/ml BSA，0.3mM各種dNTP(濃度500μM)的緩衝液。用5U的Taq聚合酶(72℃，5分鐘)填平3』端。擴增20個循環(每個循環95℃ 1分鐘，72℃ 3分鐘)，將產物匯總後，酚抽提，乙醇沉澱，重懸於TE緩衝液，使其濃度為0.5μg/μl。下文中將其稱為代表產物(representation)。實施例4然後代表產物經DpnII消化，去除其中的SEQ ID NO1，準備扣除雜交。消化產物經酚抽提，乙醇沉澱。所用為未刺激的樣品時即產生對照物，所用為刺激的樣品時則產生試驗物。部分試驗物(20μg)經1.2％瓊脂糖凝膠純化和分離。用上述連接SEQ ID NO1和SEQ ID NO2同樣的方法，將樣品(2μg)與SEQ ID NO3和SEQ ID NO4連接起來。
在扣除雜交的首次循環中，將0.4μg已連接了SEQ ID NO3和4的試驗物樣品與40μg對照物cDNA混合。混合物經酚抽提，乙醇沉澱，溶於2μl3xEE緩衝液(30mM EEPS pH8.0)，3mM EDTA；pH8.0，3mM EDTA。加蓋30μl礦物油，在98℃變性5分鐘。加入5M NaCl(0.5μl)，然後，DNA在67℃雜交20小時。用TE和tRNA載體稀釋反應混合物到200μl。樣品72℃孵育3分鐘，使SEQ ID NO4解鏈，然後進行4個PCR反應(200μl)。這包括20μl經稀釋的無引物的雜交混合物，用於填平重新退火的試驗物末端，加入SEQID NO3樣品後，進行10個擴增循環(每個循環95℃ 1分鐘，70℃ 3分鐘)，將產品匯總後，酚抽提，乙醇沉澱，重懸於40μl 0.2x TE緩衝液。將20μl該材料用20U綠豆核酸酶處理30分鐘以降解單鏈DNA，此步驟的總體積為40μl。用50mM Tris-HCl，pH8.9稀釋樣品(1∶5)，然後98℃加熱5分鐘使酶失活。用20μl上述產物，2μl SEQ ID NO3(1mg/ml)，和1μl(5U)Taq DNA聚合酶進行第二輪PCR。共進行18輪循環(每個循環95℃ 1分鐘，70℃ 3分鐘)。將產物匯總，酚抽提，乙醇沉澱，重懸至0.5-1μg/μl。該產物稱為「DP1」，或第一個示差產物(difference product)。實施例5
DP1如上述用內切酶DphII消化，與SEQ ID NO5和6連接，過程同SEQ ID NO1，2，3和4的描述。重複實施例4描述的扣除雜交和選擇性擴增，則產生了第二個示差產物，或「DP2」。這些實驗中50ng的DP1是試驗物。對照物(40μg)如上所述。重複上述過程，用SEQ ID NO3和4作接合物，產生第三個示差產物。為產生第三個示差產物，將100pg的試驗物與40μg對照物混合。重複上述所有實驗步驟，但最後擴增22輪循環，其中每個循環為95℃1分鐘，70℃3分鐘。如此產生最終示差產物。實施例6用DpnII消化最終示差產物。克隆到商業可獲得載體pTZ19R的BamHI位點。製備雙鏈DNA質粒，然後用常規方法測序。其序列用BLAST檢索程序與GenBank和EMBL資料庫的已知序列進行比較。
在扣除過程的最後，確定了一段短cDNA片段，即，約200個鹼基對長度的片段。這個片段用於篩選BW5147細胞的cDNA文庫。對最大的克隆進行測序。下面將對其進行討論。其不與任何已知序列相符。
核苷酸序列(SEQ ID NO7)長1119個鹼基對，包括537個鹼基對的開放閱讀框，其編碼長179個胺基酸的蛋白質。該蛋白的預計分子量是20,093。另有兩個ATG密碼子，假如作為起始密碼子，將分別產生長172和167個胺基酸的蛋白，分子量分別為19,335和18,770道爾頓。該蛋白的每中形式的特徵在於有一段疏水胺基酸序列，該序列在穿過內質網時被切除，從而產生成熟蛋白。
對該序列的分析顯示具有三個富含AT的基序(TTATTTAT)。常在細胞因子和癌基因的5』非翻譯區發現這些基序。Kruys等，Science 245852(1989)顯示這些重複區可以調整mRNA的穩定性。實施例7以上述實施例6中分離和分析的cDNA作探針，鑑定TIFα的基因組DNA。
採用標準方法用SEQ ID NO7篩選小鼠品系129的基因組文庫。將一個陽性克隆的EcoRI片段亞克隆到pZERO質粒中，並部分測序。這部分序列稱為SEQ ID NO8。實施例8上面實施例7中所述陽性克隆的第二個EcoRI片段也被亞克隆。同源性很高，但序列不相同。具體而言，這個序列的內含子1與SEQ ID NO8有98％相同，內含子2有100％相同，內含子3有92％相同。
令人驚訝的時，該序列中的啟動子均無同源性，說明其調節是獨立的。5』非翻譯區有92％相同。TIFα的第一外顯子分為外顯子1α和外顯子1β。第一編碼外顯子(TIFα外顯子1b和TIFβ外顯子1)有99.5％相同，第二外顯子100％相同，第三外顯子97％相同，第四外顯子98.5％相同，第五外顯子是96％相同。非翻譯區中的同源性為96％。實施例9用上述實施例8中的信息，推測出所述第二個克隆的cDNA序列，稱為TIFβ，如SEQ ID NOSEQ ID NO9所示。還用上述同樣的方法確定了基因組DNA序列，如SEQ ID NO42所示。其胺基酸序列如SEQ ID NO41所示。
與TIFα相比，TIFβ的編碼區有6個沉默改變。有兩個改變導致不連續的胺基酸改變(在36位和113位，TIFα的Val變為TIFβ的Ile)。在112位有一個更顯著的改變，由Gln變為Arg。實施例10用實驗研究TIF的表達。用重組小鼠IL-9(200U/ml)刺激BW5147細胞達不同時長(0.2，0.5，1，2和24小時)。用標準方法和試劑分離總RNA。使用5μg總RNA和oligo(dT)引物進行逆轉錄。對應於20ng總RNA的cDNA樣品用不同引物擴增25個循環。(每個循環94℃ 4分鐘，57℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘)。TIF引物為5』-CTGCCTGCTT CTCATTGCCC T-3』(SEQ ID NO10)和5』-CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T-3』(SEQ ID NO11)(分別是有義鏈和反義鏈)它們分別對應於SEQ ID NO7的107-127和766-786核苷酸。B-肌動蛋白作為對照也進行擴增，擴增18個循環(第一個循環94℃ 4分鐘，60℃1分鐘，72℃2分鐘。後續循環是94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃2分鐘)。
擴增後，PCR產物經1％瓊脂糖凝膠分析，用放射標記的內部探針印記證實特異性擴增。TIF探針為5』-GACGCAAGCA TTTCTCAGAG-3』(SEQ ID NO12)所示條件和探針並非特異於TIF的某一種形式；然而，TIFα的擴增產物包含一個KpmI限制位點，而TIFβ無此限制位點。用KpnI消化擴增產物顯示，IL-9誘導的主要(如果不是全部)TIF mRNA是TIFα，說明經IL-9迅速誘導TIFα的表達。刺激30分鐘後可以檢出TIFα的mRNA，在1-24小時內達到平臺期。實施例11進行實驗，該實驗顯示上述IL-9對TIF mRNA的誘導不需要合成蛋白。在這些實驗中，如實施例10所述，從刺激24小時的細胞中抽提總RNA，用或不用10μg/ml的蛋白合成抑制劑放線菌酮作用4.5小時。在一組平行實驗中，細胞未受刺激。如實施例10所述抽提總RNA並進行RT-PCR擴增。用EB染色的1％瓊脂糖凝膠分析PCR後的產物。結果發現當蛋白合成被阻斷時，IL-9的誘導仍會發生。因此IL-9的作用是直接作用，不需要蛋白介導物的合成。實施例12在這些實驗中，用BW5147細胞系的衍生物來研究STAT蛋白對TIF mRNA的誘導作用。第一個細胞系，BWh9R，表達野生型人IL-9受體。BW-Phe116細胞系是具有單個突變(在116位)的轉染子，它使受體不能活化STAT轉錄因子。另一個細胞系BW-mut6，具有一個突變，它使受體不能活化STAT5，但仍有活化STAT1和STAT3的能力。最後，細胞系BW-mut7具有一個突變，它使IL-9受體不能活化STAT1和STAT3，但仍有活化STAT5的能力。
如實施例10所述，刺激細胞，分離總RNA，逆轉錄並擴增cDNA(細胞被刺激24小時，使用人和鼠重組IL-9)。如上所述，PCR產物在EB染色的1％瓊脂糖凝膠上分析。
分析顯示，人IL-9不能誘導BW-Phe116的表達，說明其涉及STAT轉錄因子。已發現IL-9在BW-mut6突變體中可誘導TIF表達，但在mut7變異體中不能誘導，說明其與STAT1或STAT3有關，而不涉及STAT5。實施例13研究正常小鼠脾細胞中TIF mRNA的表達。
培養來自10-12周齡的Balb/c小數的脾細胞24小時，所用培養基為對照培養基或補充有20μg/ml LPS(其可活化B淋巴細胞和巨噬細胞)，或ConA(其可活化T細胞)，或ConA加1％抗小鼠IL-9的阻斷抗血清的對照培養基，以β-肌動蛋白作為對照。如上純化RNA，進行RT-PCR分析。
數據顯示，TIF在休眠的脾細胞中表達很弱，不受LPS誘導，但受ConA的強烈誘導。抗IL-9的抗血清不能影響ConA的誘導作用，說明該效應不經IL-9介導，或經其它細胞因子介導。
用RT-PCR產物的序列分析ConA活化的脾細胞，發現這些細胞主要表達TIFα，或排它性地表達TIFα。實施例14進一步的研究顯示，即使在缺乏IL-9誘導時，TIF mRNA仍能表達。用尼龍毛(wool)柱從來自5周齡FVB小鼠的脾細胞中富集T細胞。然後在補充有ConA(一種T細胞活化物)或PMA(其能夠在大多數細胞中激活PKC)的培養基中，加入或不加入IL-9的情況下，刺激所述細胞24小時。
用標準技術分離總RNA，10μg樣品在含有2.2M甲醛的1.3％瓊脂糖凝膠上電泳分離，轉至硝酸纖維素膜上，標記，按Van Snick等，J.Exp.Med.，169363(1989)的雜交實驗進行分析，該文獻引入作為參考。
結果顯示，ConA對TIF的誘導不能被修飾，而IL-9在PMA活化的脾細胞中不能誘導TIF RNA。實施例15檢測各種細胞系中TIF mRNA的表達。在這些實驗中，用特定的細胞因子刺激小鼠細胞系至少一天。具體為，9T7是一種T細胞淋巴瘤，其可對IL-2，IL-4或IL-9產生應答。TS3和TS6細胞系是來自T輔助細胞克隆，並在IL-2或IL-9存在下增殖。MC9和LI38是肥大細胞系，其在IL-3或IL-9存在下增殖。
刺激後，用常規的異硫氰酸胍裂解和CsCl梯度離心製備總RNA。
然後用Northern印記分析9T7細胞系，用上述RT-PCR方法分析其它細胞系。
發現IL-9可上調T輔助細胞和肥大細胞中TIF的表達。IL-2和IL-3則不能。然而，無論是否存在細胞因子，9T7細胞系中顯示大致相同的表達水平，說明IL-9對於TIF的表達不是必須的。實施例16然後研究B細胞系中TIF mRNA的表達。A20，70Z/3和BCL-1是B細胞白血病細胞系，它們體外生長不需要細胞因子。這些細胞用IL-4和IL-9刺激24小時，用標準方法分離總RNA。如上述經RT-PCR擴增35個循環，然後經印記和雜交來分析其表達。
結果顯示，在B細胞中檢出TIF的表達，IL-9和IL-4存在時最多僅有很弱的上調。實施例17研究本發明分子在T輔助細胞系中的表達。TS2和TS1是已知的T輔助細胞系，它們來自T輔助細胞克隆，在IL-9或IL-2(TS2)和IL-9或IL-4(TS1)存在下增殖。具體為，存在列出的細胞因子時，TS2或TS1細胞可生長至少10天，然後用已知方法抽提RNA。用上述的實驗方法，經RT-PCR(35個循環)研究這些分子的表達。IL-4和IL-9均可誘導TS1細胞TIF的表達，IL-2不能誘導TS2表達TIF。實施例18研究不同小鼠器官TIF mRNA的表達。用標準的異硫氰酸胍方法和CsCl梯度離心，從肝，腎，心，腦，腸，脾，胸腺，肺，肌肉和骨髓中製備總RNA。用上述方案進行40個循環的RT-PCR。在胸腺組織者發現最強表達，腦組織中發現次強的信號，在其它組織者表達比這兩者弱。實施例19以下實驗描述了293-EBNA細胞中產生TIFα。
TIFα的互補DNA如上所述。將其亞克隆到商業可獲得的pCEP-4表達載體並與CMV啟動子操縱性連接。用標準脂轉染胺(lipofectamine)方法將所獲的質粒轉染到293-EBNA細胞。轉染後，細胞在不含蛋氨酸但補充了35S標記蛋氨酸的培養基中孵育24小時。收集上清，進行丙烯醯胺凝膠電泳。膠乾燥後放射自顯影1天。將cDNA以反義方向克隆到相同質粒後，轉染細胞作為對照。
發現用TIF正向轉染的細胞有一條大約25-30kd的異質性帶。在本系統中，預測分子量與實際分子量之間的偏差以及異質性均歸因於糖基化。在一組平行實驗中，編碼人TIF的cDNA的表達方式與小鼠cDNA的表達方式相同。除了cDNA的改變，所以實驗參數均相同。實施例20進一步進行實驗來研究COS細胞中TIFα的產生。具體為，將TIFα的cDNA亞克隆到上述Demoulin等描述的質粒pEF-BOS.puro中，與EF-1α啟動子操縱性連接。採用上述同樣的脂轉染胺方法將質粒cDNA轉染到COS細胞。細胞在不含蛋氨酸但補充了35S標記蛋氨酸的培養基中孵育24小時，之後用上面實施例19所述方法處理上清。再次觀察到一條25-30kd的異質性帶，還有一條18kd的帶，其很可能代表該分子的非糖基化形式。實施例21從以下實驗發現TIF能夠誘導腎小球膜細胞、神經元黑色素瘤細胞和肝癌細胞中STAT的活化。已知當細胞因子活化STAT因子時，這些因子形成二聚體，從胞漿移至核內，與啟動子的靶序列結合。實驗細節如下。
如上述轉染的293-EBNA細胞在正常培養基中孵育48小時備用，對照上清也如上述處理。使用小鼠腎小球膜細胞系(下文中稱為「MES13」)樣品，大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系(下文中稱「PC12」)，4種不同的人黑色素瘤細胞(SK23，AUMA，NA-8mel和MULL)，人肝癌細胞(HepG3)和大鼠肝癌細胞(H-4-II-K)。在1％的上清存在下，刺激細胞樣品(0.5×106)5-10分鐘。根據已引入作為參考的Demoulin等，Mol.Cell.Biol.164710(1996)製備核提取物。簡言之，用PBS洗滌細胞，然後重懸於冰冷卻的1ml低滲緩衝液15分鐘。(緩衝液是10mM HEPES緩衝液，pH7.5，10mM KCl，1mM MgCl2，5％甘油，0.5mM EDTA，0.1mM EGTA，0.5mM二硫蘇糖醇和1mM Pefabloc，1mMNa3V4，和5mM NaF)。加入65μl的NP-40裂解細胞，然後離心。14000rpm離心30秒沉澱核，用補充有HEPES(20mM)，甘油(20％)和NaCl(420mM)的緩衝液抽提。離心2分鐘除去核碎片。根據上述Demoulin等的方法確定DNA結合活性，使用稱為「GRR」的32P標記雙鏈寡核苷酸，它包含FcγRI基因啟動子的STAT結合位點，即5』-ATGTATTTCCCAGAAA-3』(SEQ ID NO13)和5』-CCTTTTCTGGGAAATAC-3』(SEQ ID NO14)其對應於GRR探針中結合位點的上鏈和下鏈。簡言之，5μl的核提取物在結合緩衝液(12mM HEPES，pH7.6，10mM KCl，0.5mM EDTA，2.5％甘油，0.1mg poly(dI-dC)/ml)中孵育5分鐘。加入放射標記的GRR探針(105cpm；約0.5ng)，繼續孵育25分鐘，然後上樣至非變性聚丙烯醯胺凝膠。
還注意到上述MES13細胞中發現的複合物在凝膠中的遷移被抗STAT5和抗STAT3抗體導致部分改變(overshift)，這表明(i)所檢測的細胞是TIF的靶目標，(ii)STAT5和STAT3是TIF活化的複合物中重要成分。與上述實施例12比較，STAT圖譜的差異歸因於細胞來源的不同(人和小鼠相比)。還觀察到人TIF可在小鼠細胞中起作用，反之亦然。實施例22本實施例詳述編碼人TIF的核酸分子的分離和克隆。首先，用標準的密度梯度離心製備人外周血單核細胞。隨後，以3×106個細胞/ml的密度培養24小時，其間加入或不加抗CD3單抗(該抗體是商業可獲得的OKT3單抗，為1/500稀釋的腹水)。使用該抗體是因為T細胞來源的細胞因子通常只在CD3特異性抗體的活化下表達。
採用標準異硫氰酸胍/CsCl超速離心技術從這些細胞中分離總RNA。用oligo(dT)引物逆轉錄10μg的RNA樣品。
如上述方法製備cDNA，用PCR擴增與100ng總RNA相當的cDNA，所用引物如下5』-AGGTGCTGAACTTCACCCTGGA-3』(SEQ ID NO15)5』-CCACTCTCTCCAAGCTTTTTCA-3』(SEQ ID NO16)它們均基於小鼠cDNA序列(即SEQ ID NO7)。進行30個循環的PCR，每個循環是94℃ 1分鐘，42℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘。用標準方法經瓊脂糖凝膠分離擴增產物，然後測序。結果顯示擴增的是cDNA片段。從而進行第二個反應，除用SEQ ID NO17替換SEQ ID NO16外，其餘物質相同，SEQID NO17為；5』-CAAGTCTACCTCTGGTCTCAT-3』第二個PCR反應進行25個循環，每個循環為94℃ 1分鐘，45℃ 1分鐘，72℃2分鐘。擴增產物的處理同第一個反應。418個核苷酸的片段被擴增，該片段被發現於抗CD-3刺激的細胞中，但未見於休眠的(resting)PBMCs中。該片段的核苷酸序列如SEQ ID NO18所示。實施例23製備擴增產物後，用標準的5』-RACE技術分離5』端cDNA。簡言之，以SEQ ID NO19(如下)作為引物製備cDNA第一鏈5』-TGGCCAGGAAGGGCACCACCT-3』這個引物基於實施例22的序列信息。簡言之，5』-RACE法實施如下將上述製備的1μg總RNA，2.5pM的SEQ ID NO19，逆轉錄酶，逆轉錄緩衝液，2.5μl的dNTP混合物(10mM)，2.5μl MgCl2(25mM)，和2.5μl DDT(0.1M)混合。反應完成後，加入RnaseH和RnaseT1除去原始RNA。還除去未摻入的dNTP，引物和蛋白。用末端轉移酶，或「TdT」給cDNA加尾。如下所述，該酶為縮短的錨定引物產生3』結合位點。通過加入純化的cDNA第一鏈，TdT，緩衝液(10mM Tris-HCl，25mM KCl，1.5mM MgCl2)和200μM dCTP進行加尾。
下面是加尾反應，用下述引物進行PCR反應5′-CCTATCAGAT TGAGGGAACA G-3′(SEQ ID NO20)和5』-RACE縮短的錨定引物5′-GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGIIGGGIIGGGIIG-3′(SEQ ID NO21)。
擴增35個循環(每個循環為94℃ 1分鐘，56℃1分鐘，72℃2分鐘)。隨後對1/100稀釋的擴增產物5μl，以SEQ ID NO20和縮短的通用擴增引物進行巢式擴增(nested amplification)5』-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3』(SEQ ID NO22)擴增30個循環(每個循環為94℃1分鐘，56℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘)。用標準方法克隆PCR產物，並測序。
這三個實驗，即上述兩個產生片段的實驗，和上述5』-RACE PCR可使擴增產物已測序的序列進行對比排列，以產生完全的序列。
排列後得到推測的開放閱讀框側翼的寡核苷酸序列5』-CCTTCCCCAGTCACCAGTTG-3』(SEQ ID NO23)和5』-TAATTGTTATTCTTAGCAGG-3』(SEQ ID NO24)。
這些引物用於擴增完整開放閱讀框，所用mRNA來自上述CD3特異性單抗刺激的細胞。擴增25個循環，(每個循環為94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃2分鐘)。
人cNDA的完整序列見SEQ ID NO25。其含有537個鹼基對的ORF，該ORF編碼179個胺基酸的蛋白。與鼠蛋白的長度相同。人蛋白與鼠蛋白具有79％的胺基酸同一性，而IL-10具有25％同一性。人和鼠蛋白分別如SEQID NO43和40所列。實施例24這些實驗詳細描述與上述cDNA對應的人基因組DNA。
根據該cDNA序列，將引物設計為與SEQ ID NO25的51-70位核苷酸和631-650位核苷酸相對應。用標準方法進行PCR。具體為，以來自CESS細胞(EBV轉染，類淋巴母細胞細胞系)的100ng的基因組DNA作模板，擴增33個循環(每個循環為94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 5分鐘)。分離序列並測序，將其示於SEQ ID NO26。該序列長約4.8Kb，被認為包含編碼TIF分子的完整基因組序列，僅缺少5』側翼區，啟動子區和3』末端。分析顯示其含有6個外顯子和5個內含子，與小鼠的基因組序列相同。
使用標準方法進行Southern印記雜交。顯示基因組只含有TIF基因的單一拷貝。實施例25有必要確定上述基因組DNA是否位於人基因組中。為此採用兩種不同的方法。在第一個方法中，用螢光標記上述SEQ ID NO26序列作為探針，採用標準的原位雜交(「FISH」)探查人的基因組。
第二個方法中，用SEQ ID NO25的51-70位核苷酸以及5』-ATCAGATGGATTACTGAATG-3』(SEQ ID NO27)作探針篩選一組放射性雜合克隆。用25ng的基因組DNA作模板進行PCR，擴增35個循環，每個循環為94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘。
兩種方法均顯示該基因位於染色體12q15。一些研究發現，哮喘相關疾病與該位點有關。參見Nat.Genet.15398-392(1997)；Ober等，Hum.MolGenet.7(9)1393-1398(1998)；Nickel等，Genomic 46(1)159-162(1997)；Takahashi等，Genomics 44(1)1502(1997)；Barnes等，Genomics 37(1)41-50(1996)，均引入作為參考。
訪問公共資料庫，確定該序列是否已存在於其中。在BAC克隆中發現了TIF的末尾的一個外顯子，其衍生自染色體12q15。(序列號AC007458；191，111鹼基對，BAC RDCI11-444B24)。在該克隆中鑑定到這個末尾的外顯子說明TIF基因位於距IFN基因約90Kb鹼基處，距AK155基因不超過30Kb鹼基，該AK155是IL-10相關的細胞因子(Knappe等，J.Virol 743881-3887(2000))。實施例26這些實驗描述與TIF蛋白結合的抗體的製備。為此，用標準方法將SEQID NO7編碼的胺基酸40-61組成的肽與KLH載體蛋白偶聯，比例為1mg肽比1mg載體蛋白。用150μg該複合物以兩周的間隔免受試動物(兔)3次。第一次注射時，免疫原經完全弗氏佐劑乳化，後二次用不完全弗氏佐劑。
末次注射後1個月第一次放血，用已知方法製備血清。
用標準Western印跡檢測血清。簡言之，從轉染SEQ ID NO7或SEQ IDNO25的細胞取上清10μl，經SDS-PAGE電泳分離，然後印跡至PVDF膜。抗血清1∶500稀釋，在標準Western印記方案中使用，還用到抗兔抗體作為二抗，用市售的檢測試劑盒。
發現該血清確實可以識別TIF蛋白。實施例27本實施例描述為鑑定可與人TIF反應的細胞系所進行的實驗。在轉染前，以3×105個細胞/孔每天的量將如上所述HEK293-EBNA人胚胎腎細胞接種到6孔板。用2μg含有人TIF cDNA的pCEP-4質粒轉染這些細胞，該質粒是在CMV啟動子的調控下。轉染後細胞在1.5ml正常培養基中培養3天，為使重組人TIF的產量達到最大。
可以假定，人TIF能夠以與小鼠因子相同的方式誘導STAT轉錄因子的激活。接下來進行上述實施例21的方案。向核提取物的混合物中加入抗-STAT抗體(0.75μg抗-STAT1，1μg抗-STAT3，或1μl抗-STAT5b)以及標記探針，並孵育，進行遷移率的實驗。
當使用肝細胞系HepG2時，可以觀察到TIF誘導的帶遷移。上述的抗體用於進一步突出該反應的特點。抗-STAT-3抗體最大程度地改變了複合物的滯後，而抗-STAT-1抗體則改變了較弱的其餘複合物的遷移率。抗-STAT-5抗體沒有任何作用。這說明STAT-3以及，更小範圍而言，抗-STAT-1是TIF激活的主要轉錄因子。使用人肝細胞系HepG3以及肝細胞系H4IIE也得到這些結果。實施例28本實施例描述通過報導基因測定STAT激活而設計的實驗。報導基因是「pGRR5」，其含有實施例21中所列序列的5個拷貝，TK啟動子調控下的螢光素酶基因的上遊。對照是pRL-TK載體，其含有在TK啟動子調控下的remilla螢光素酶基因。
將106HepG2細胞與15μg pGRR5，1μg Pr1-TK(250V，74Ω，1,200μF)混合，進行該試驗。將轉染株匯集物分到24孔板中(42,000細胞/孔)。
1小時後，用人TIF(1％HEK293細胞上清)，與300U/ml人IL-6，來自假轉染HEK239細胞的1％上清一起，或者僅僅用培養基，刺激細胞。
2小時後，將細胞製成球狀，並溶解。使用標準方法監測螢光素酶活性。結果說明用本發明的分子進行刺激可以提高含有STAT結合位點的啟動子轉染活性。實施例29已知IL-6這樣的細胞因子激活STAT-3可導致肝細胞中急性期蛋白的誘導。為測定TIF是否也具有相同活性，用來自瞬間轉染的HEK293-EBNA細胞的1％上清，刺激5×106HepG2細胞2，13或24小時。在一些試驗中使用10μg/ml的蛋白合成抑制劑放線菌酮，與細胞和上清共同孵育。刺激後，使用標準方法分離總RNA，使用oligo(dT)引物，用10μg總RNA樣品進行逆轉錄。然後，相應於20ng RNA的cDNA，與人血清澱粉狀蛋白A(「SAA」)特異性的引物一起，被擴增18個循環，引物為agctcagcta cagcacagat(有義鏈，SEQ ID NO28)cctgccccat ttattggcag(反義鏈，SEQ ID NO29)人α1抗胰凝乳蛋白酶tgtcctctgc caccctaaca(有義鏈，SEQ ID NO30)taattcacca ggaccatcat(反義鏈，SEQ ID NO31)人結合珠蛋白的gtggactcag gcaatgatgt(有義鏈，SEQ ID NO32)acatagagtgt taaagtggg(反義鏈，SEQ ID NO33)人β-肌動蛋白的gctggaaggt ggacagcgag(有義鏈，SEQ ID NO34)tggcatcgtg atggactccg(反義鏈，SEQ ID NO35)對於SAA，Tm為54℃，而對於人α1抗胰凝乳蛋白酶和結合珠蛋白是52℃，β-肌動蛋白是56℃。使用標準方法用溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠分析PCR產物。
結果顯示TIF強有力地誘導SAA和α1抗胰凝乳蛋白酶以及，更小範圍的說，結合珠蛋白。為檢測TIF是否直接上調SAA或是否需要蛋白合成，在放線菌酮存在下，如上所述刺激HEPG2細胞。SAA的表達未受影響，說明蛋白合成對於TIF的活性而言並不是必須的。實施例30上述的結果顯示TIF和IL-6對於急性期蛋白反應物顯示出類似的活性。由於IL-6的活性是通過gp130介導，所以進行試驗來檢測是否TIF的活性也是通過gp130介導。
為檢測是否如此，如上所述，用螢光素酶報導基因轉染HepG2細胞，然後在多克隆，抗gp130抗體的存在下，用TIF或IL-6刺激，這些抗體已預先被鑑定為可以阻斷gp130相互作用的細胞因子的活性。
結果顯示多克隆僅能夠阻斷IL-6的活性。
進行平行試驗來檢測IL-10Rβ鏈是否相關。在-IL-10Rβ抗體的存在下，TIF的活性被徹底阻斷，而IL-6的活性不受影響。對於SAA表達進行的試驗中也觀察到相同的效果。實施例31這些實驗是為檢測TIF體內調節急性期蛋白的能力而設計。
將各種劑量的重組鼠TIF(50，12.5，3.2，0.8，或0.2μg)腹膜注射到內毒素抗性的雌性小鼠C3H/HeJ(10-12周齡)內。注射6小時後，處死小鼠，接受了50μg TIF的小鼠除外，該小鼠在1，3，6，12或24小時後被處死。取出肝臟並直接冷凍在液氮中。然後使用標準方法分離總RNA，之後在含有2.2ml/升甲醛的1.3％瓊脂糖凝膠中分離10μg總RNA樣品。然後樣品被轉移到硝酸纖維素膜上。
使用商業可獲得的標記試劑盒製備鼠SAA探針。根據Van Snick等，J.Exp.Med 169363-368(1989)進行雜交實驗，將其併入作參考。探針本身是如上所述，使用如上述的來自小鼠肝臟的cDNA，通過PCR製備。製備探針所用的引物為tctgctccct gctcctggga(有義鏈SEQ ID NO36)以及tccaggaggt ctgtagtaat(反義鏈SEQ ID NO37)結果顯示最高劑量的小鼠TIF(50μg)在短至腹膜注射後1小時後，即誘導了SAA的表達。最長的作用時期可達到6小時。在注射後24小時，SAA的表達水平降低。
使用各種劑量TIF的實驗數據說明使用3.2μg劑量時，仍可獲得最大程度的SAA誘導。當使用低至0.8μg劑量時，仍可檢測到SAA信使(message)。實施例32起初，TIF被鑑定為一種T細胞衍生的細胞因子。多數調節肝臟急性期蛋白的細胞因子主要在炎症期間產生。為鑑定TIF能否在炎症刺激中體內產生，將2μg E.coli脂多糖抗原腹膜注射到12周齡的雌性BALB/c小鼠中。2小時後處死小鼠，器官被冷凍在液氮中。使用標準方法分離總RNA，使用oligo(dT)引物對10μg總RNA進行逆轉錄。逆轉錄後，相應於20ng總RNA的cDNA，與TIF特異性的引物一起，被擴增25個循環，引物為ctgcctgctt ctcattgccc t(有義鏈SEQ ID NO38)以及caagtctacc tctggtctca t(反義鏈SEQ ID NO39)其Tm為55℃。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。
結果說明LPS在所有受檢測的器官中都誘導TIF表達，說明TIF與炎症過程相關。
以上實施例描述了本發明，其中一方面是分離的核酸分子，其編碼TIF蛋白如具有核苷酸序列SEQ ID NO7，25或26所編碼胺基酸序列的蛋白。本領域技術人員將認同，遺傳密碼的簡併性有利於製備可能與SEQ ID NO7，25或26的核苷酸序列不同，但編碼相同蛋白的核酸分子。當然，SEQ ID NO7，25或26是本發明的優選實施方案，但其它實施方案也是本發明的一部分。基因組DNA，互補DNA和RNA，如mRNA均包括在內。從其它動物物種，包括其它哺乳動物分離的核酸分子也是本發明的一部分。本發明的一個優選方面為分離的核酸分子，其互補物可在嚴謹條件下與SEQ ID NO7，SEQ IDNO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO25或SEQ ID NO26雜交。使用的「嚴謹條件」如在緩衝液(3.5×SSC)，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，25mM NaH2PO4(pH7)，0.1％SDS，2mM EDTA中65℃雜交，然後室溫2×SSC洗滌，然後在如65℃的高溫下0.1×SSC/0.2×SSC中洗滌。也可使用更嚴謹的條件，如0.1×SSC。這些核酸分子編碼約17-22kD的蛋白，如SDS-PAGE所測，它們可活化STAT蛋白，如STAT1，STAT3和/或STAT5。經SDS-PAGE測定，這些蛋白的糖基化形式約為17到30kD。本發明另一部分是分離的核酸分子，其編碼蛋白與SEQ ID NO7，25或26，所編碼的蛋白具有至少30％，優選至少45％，更優選至少60％，最優選90％的胺基酸同一性例如SEQ ID NO42。
本發明另一方面為包含本發明核酸分子的表達載體，所述核酸分子與啟動子操縱性連接，從而可促進所述DNA的表達。製備這類載體是本領域技術人員公知的。
所述載體及核酸分子本身均可用於製備原核或真核的重組細胞，這些重組細胞中摻入了所述表達載體，或是核酸分子本身。根據本發明這一方面可使用的細胞類型有E.coli細胞，COS細胞，CHO細胞等。
本發明另一方面為上述核酸分子所編碼的蛋白，優選其分離的形式。「蛋白」指核酸分子表達的直接產物，其糖基化形式，和多聚體形式，如二聚體，三聚體等。本發明還有一個部分是多聚體，如二聚體，其至少包含本發明的一個蛋白分子，和至少一個不同的蛋白分子。優選該不同的蛋白分子是細胞因子，如IL-10。本發明還有一個方面的構建體，如融合蛋白，其中上述蛋白的全部或一部分以某種形式，如融合蛋白的形式，與至少一種其它蛋白或多肽，或胺基酸序列相連。例如，「融合配對物」可以是直接或間接提供識別信號的分子，如FLAG肽，β-半乳糖苷酶，螢光素酶等。這些融合配對物優選與上述位於蛋白N端和/或C端的分子連接；但應理解已知有許多的技術可將分子與胺基酸連接，這些方法中任一個或全部均可嘗試屬於本發明的一部分的構建體。
如上所述，本發明的每個蛋白分子優選經SDS-PAGE測定分子量約17-30kD。當然在多聚體形式中，複合物的分子量會有變化，但其中所含TIF分子的分子量經SDS-PAGE測定均應為17-30kD。
這些蛋白優選包含至少約120個胺基酸，不超過約200個胺基酸。優選這些胺基酸序列由SEQ ID NO7，8，9，25或26編碼的胺基酸序列組成，或包括其全部或部分。更優選該胺基酸序列包含上述各序列所編碼的除約前40個胺基酸以外的所有胺基酸。甚至更優選它包含這些序列所編碼的除約前20個胺基酸以外的所有胺基酸。最優選地，該蛋白包含SEQ ID NO40或41所示的胺基酸，以及上述這些胺基酸所定義的蛋白。
本領域技術人員將認同，上述核苷酸分子所編碼蛋白的是本發明的特徵，並可用於根據標準方法產生抗體。這些單克隆或多克隆形式的抗體，以及所述抗體的片段、嵌合形式、人源化形式、重組形式等均構成了本發明的另一方面。本發明的特徵還有免疫原，其包含本發明蛋白分子的全部或部分胺基酸序列，優選與佐劑，如完全或不完全弗氏佐劑組合。這些蛋白序列的部分可與其它分子如匙孔血藍蛋白連接，以增加其免疫原性。這些抗體可用於如確定是否有本發明蛋白存在。這是本發明的另一特徵。現進行描述。實施例中已顯示，存在IL-9時本發明核酸分子表達。因此本發明的另一特徵是確定IL-9是否存在或已經存在的一種方法，其中可用抗體檢測本發明蛋白，或用本發明核酸分子作探針檢測mRNA。可直接測定mRNA，或其cDNA形式。這些探針可標記或不標記，取決於使用者。因此，可通過測定本發明核酸分子的存在來確定給予IL-9後細胞因子是否仍有效。這類試驗可用於如定量研究，其中可確定細胞是否對IL-9敏感，如果是，敏感程度如何。還可利用本發明的蛋白使STAT蛋白，如STAT1，STAT3和/或STAT5磷酸化。這樣可使STAT蛋白形成二聚體，然後移至細胞核，從而激活這些STAT蛋白對細胞的作用。
可將這些分子施用於受試者，如患淋巴瘤，免疫系統疾病如過敏，獲得性免疫缺陷綜合症，自身免疫性糖尿病，甲狀腺炎或任何其他疾病的受試者，從而檢驗IL-9激動劑(agonist)或拮抗劑的效力，所述疾病可參見U.S.Patent No.5,830,454；5,824,551，以及1997年9月8日提交，現在被批准的申請08/925348，均引入作為參考。這些分子也可用於介導IL-9在這些或其它疾病中的作用。由於IL-9誘導TIF，所以TIF是IL-9活性的有效介導物。因此，本發明另一方面是在如哮喘，過敏和淋巴瘤等與IL-9活性過度有關的情況下，測定內源性IL-9活性的方法。還可使用例如反義分子，與TIF結合的抗體或這些分子的其它拮抗劑，通過阻斷或抑制TIF或TIF活性來阻斷或抑制IL-9活性，例如TIF突變蛋白可與TIF受體結合但不能活化該受體，因此可抑制IL-9誘導的活性，它是本發明的又一特徵。可用這類TIF突變蛋白治療的疾病有過敏，哮喘等。本發明的突變蛋白可根據Weigel等，Eur.J.Biochem180(2)295-300(1989)和Epps等，Cytokine 9(3)149-156(1997)所述製備，均引入作為參考。這類突變蛋白可用於治療哮喘，過敏或二者。此外，本領域技術人員很清楚，上述分子還可用於篩選合適的突變蛋白。調節IL-9活性的能力對於上述疾病，以及凋亡，包括可地松誘導的凋亡，涉及BCL-3的核表達等疾病(condition)很重要，因為已知IL-9誘導這種表達。本文中「抗體」是指於TIF結合的抗體的任何部分，包括嵌合抗體和人源化抗體。
本發明的另一特徵涉及本發明TIF型分子在其效應組織上刺激再生或抑制分化的能力。如上已示，TIF可靶向多種腫瘤和正常細胞系(即腎小球膜細胞，神經元細胞，以及黑色素瘤細胞和肝癌細胞)。因此可在需要通過TIF分子的作用使組織再生的樣品中，加入一定量的TIF型分子，從而刺激組織再生。該方法在體內，體外均可使用。同樣，需要抑制特定組織，如黑色素瘤細胞或肝癌細胞分化時，可加入TIF拮抗劑。
如實施例25所述，編碼TIF的基因定位於12號染色體。已知這一染色體與哮喘有關。還公知12q15區域與其它炎症疾病相關。因此，本發明另一實施方案是測定疾病，如哮喘或與哮喘有關的疾病易感性的方法，其是通過確定TIF基因位點是否存在畸變，如多態性，缺失，添加等。這類畸變可以指示哮喘，過敏性疾病，或一或多種相關疾病的易感性或存在。檢測DNA序列中的異常是本領域已知的，在此不再贅述。優選用標準技術，如PCR，並用上述方法和引物檢測所述異常。
以上所列數據，特別是LPS對本發明分子表達的誘導，以及該分子對急性期蛋白的調節，都指示著本發明的分子與炎症反應十分相關。因此本發明的另一特徵涉及使用IL-TIF/IL-21來鑑定促炎症以及抗炎症試劑。本領域技術人員公知IL-TIF/IL-21能夠調節炎症反應。該調節的一個優選方面是，通過施用IL-TIF/IL-21或其拮抗劑來調節器官，例如肝臟所產生的急性期蛋白。參見如Janeway等，Immunobiology(4th版)，併入作為參考。Janeway解釋了各種細胞因子如IL-1，IL-6和TNF-α激活肝細胞合成急性相蛋白，如c-反應蛋白，甘露聚糖結合凝集素，以及上面實施例描述的那些。
IL-TIF/IL-21激活急性期蛋白的功能還可通過測定在推定的激動劑或拮抗劑以及IL-TIF/IL-21存在下，急性期蛋白產量的改變，用於鑑定IL-TIF/IL-21激動劑或拮抗劑的方法。
本發明的另一部分是鑑於IL-TIF/IL-21與白介素-10受體的關係來調節其活性的方法。如上所示，IL-10Rβ拮抗劑，如抗體，能夠抑制IL-TIF/IL-21活性。因此，本發明的另一特徵是應用IL-10受體的激動劑和拮抗劑，如IL-10Rβ激動劑和拮抗劑，來調節IL-TIF/IL-21的產量。
本發明的其它特徵對於本領域技術人員是顯而易見的，無需贅述。
所用術語和表達方式旨在說明，並非限制，無意用這些術語和表達排除本發明所示和所述特徵或其部分的任何等價體，應理解各種修改均包括在本發明的範圍內。
序列表序列表110勞爾.杜穆蒂爾(Dumoutier，Laure)瓊-克里斯多福.雷諾爾德(Renauld，Jean-Christophe)120分離的編碼T細胞誘導因子或白介素-21的核酸分子，其編碼的蛋白和其應用130LUD 5664 PCT140141150US09/419,5681511999-10-18150US09/354,2431511999-07-16150US09/178,9731511998-10-2616043210121124212DNA213小鼠(Mus musculus)2204001agcactctcc agcctctcac cgca24210221112212DNA213小鼠(Mus musculus)2204002gatctgcggt ga12210321124212DNA213小鼠(Mus musculus)2204003accgacgtcg actatccatg aaca24210421112212DNA213小鼠(Mus musculus)2204004gatctgttca tg12210521124212DNA213小鼠(Mus musculus)2204005aggcaactgt gctatccgag ggaa24210621112212DNA213小鼠(Mus musculus)2204006gatcttccct cg1221072111119212DNA213小鼠(Mus musculus)2204007taaacaggct ctcctctcac ttatcaactg ttgacacttg tgcgatctct gatggctgtc60ctgcagaaat ctatgagttt ttcccttatg gggactttgg ccgccagctg cctgcttctc120attgccctgt gggcccagga ggcaaatgcg ctgcccgtca acacccggtg caagcttgag180gtgtccaact tccagcagcc gtacatcgtc aaccgcacct ttatgctggc caaggaggcc240agccttgcag ataacaacac agacgtccgg ctcatcgggg agaaactgtt ccgaggagtc300agtgctaaag atcagtgcta 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tcaggccagc cttgcagata acaacacaga cgtccggctc atcggggaga2700aactgttccg aggagtcagt gtaagtcctc actgtgatga gcagggctag ctgcgggagc2760tggtggaccc tctgggatag tctgacgtat gacccctgct gcttcttgtc tacctgcagg2820ctaaagatca gtgctacctg atgaagcagg tgctcaactt caccctggaa gacgttctgc2880tcccccagtc agacaggttc cagccctaca tgcaggaggt ggtacctttc ctgaccaaac2940tcagcaatca gctcagctcc tgtgtaagtc tgactctggc tacctatgct cctctctctt3000cctcttctat tccagtaaga acccgaggtc ctgccctctc tctcttcaca agagtgagga3060gggcctcagc accaccacca tcataggcca cttgaaatag gtcacaaagg ctttggcttc3120aattgagtaa tactttgagt ttgtatgagt gaagctttat ttgttttatc catggaaaga3180aatcaactca aattctgtag gatgagaaag atgttgggaa cgaaaaaagg cctagataga3240gaaacagatc tgctgagtat agtacttatg gggggagcag ggggcgatat ccactgagta3300caagtacttg tggggagaga aatccactga gtacaagtac ttgttggcat ggagatccac3360tgagtacaag tacttgtggg gggagggaat ggcacagagc aaaagttgaa gggaaggaag3420atggagaggc ctcatggttg ggggtgtgaa aggtcactcc ttttccatgt gatggagagt3480taagaaaaac cagtgtgtga gtttgatgtc ttcagacacc 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Leu Met Lys Gln Val Leu85 90 95Asn Phe Thr Leu Glu Asp Ile Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Arg100 105 110Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln115 120 125Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn130 135 140Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu145 150 155 160Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn165 170 175Ala Cys Val210422115935212DNA213小鼠(Mus musculus)22040042gaattcaagt ccacatgcaa tcaatccgaa tactttgtaa attctcttct tcaaatatcc60atctatatag tataagttat tgtaggatca tttaaaaata atgttttgag acttatgttt120gcacaagtaa aatgtcagag agaattagca aatgtatagt attattttat tttaaaaaat180ctatgcttaa aatgtctatt agattgttca ctactgacat ttccaaactt aacttgacct240tggctatgat ttcaaccttt gtatttgcat ctaccataac tgtgtgctca cttaccatgc300tatccgacga gcatgttccc ctgatgtttt tgccttttgc tctctcgcta acaggctctc360ctctcagtta tcaacttttg acacttgtgc gatcggtgat ggctgtcctg cagaaatcta420tgagtttttc ccttatgggg actttggccg ccagctgcct gcttctcatt 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Ile Gln Arg Asn130 135 140Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu145 150 155 160Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn165 170 175Ala Cys Ile
權利要求
1.刺激STAT轉錄因子表達的方法，包括使能夠進行所述表達的細胞與一定數量的IL-TIF/TL-21相接觸，使所述細胞足夠刺激所述表達。
2.權利要求1的方法，其中所述STAT轉錄因子是STAT3或STAT1。
3.權利要求2的方法，其中所述STAT轉錄因子是STAT3。
4.權利要求1的方法，其中所述IL-TIF/IL-21是哺乳動物IL-TIF/IL-21。
5.權利要求4的方法，其中所述哺乳動物IL-TIF/IL-21是人IL-TIF/IL-21。
6.權利要求5的方法，其中所述人IL-TIF/IL-21是由SEQ ID NO25或SEQ ID NO26所編碼。
7.誘導細胞產生急性期蛋白的方法，包括使所述細胞與一定數量IL-TIF/IL-21相接觸，該數量足夠誘導所述急性期蛋白的產生。
8.權利要求7的方法，其中所述細胞是肝臟細胞。
9.權利要求7的方法，其中所述急性期蛋白是人血清澱粉狀蛋白A，α1胰凝乳蛋白酶或結合珠蛋白。
10.權利要求7的方法，其中所述IL-TIF/IL-21是哺乳動物IL-TIF/IL-21。
11.權利要求10的方法，其中所述哺乳動物IL-TIF/IL-21是人IL-TIF/IL-21。
12.權利要求11的方法，其中所述人IL-TIF/IL-21由SEQ ID NO25或SEQ ID NO26所編碼。
13.調節IL-TIF/IL-21分子活性的方法，包括使IL-TIF/IL-21活性易感性的細胞與一定數量的IL-TIF-IL-21調節物相接觸，所述數量足夠調節IL-TIF/IL-21活性。
14.權利要求13的方法，其中所述調節物是能夠與IL-10Rβ分子結合的物質。
15.權利要求14的方法，其中所述調節物是能夠特異性結合IL-10Rβ分子的抗體。
16.權利要求16的方法，其中所述調節物是IL-10R分子的拮抗劑。
17.權利要求16的方法，其中所述IL-10R分子是IL-10R分子的激動劑。
18.權利要求14的方法，其中所述分子是IL-10R分子的激動劑。
19.權利要求18的方法，其中所述IL-10R分子是IL-10Rβ。
20.檢測暴露於炎症物質的方法，包括檢測來自相信暴露於炎症的受試者的樣品中IL-TIF/IL-21的表達，其中TIF的表達指示著暴露於炎症物質。
21.鑑定IL-TIF/IL-21調節物的方法，包括將確信為IL-TIF/IL-21調節物的物質與IL-TIF/IL-21源和表達急性期蛋白的細胞相接觸，並測定所述細胞產生的急性期蛋白，其中與在缺乏所述物質情況下所述細胞產量相比，所述急性期蛋白產量的改變，指示所述物質是IL-TIF/IL-21調節物。
全文摘要
本發明涉及核酸分子的分離，其表達經IL－9上調。對應於該核酸分子的蛋白的胺基酸顯示出細胞因子的某些結構特徵。除核酸分子和蛋白之外，還公開了所述這些分子的多種用途。這些分子可稱作T細胞誘導因子。這些分子涉及STAT分子的激活，急性期蛋白和炎症。
文檔編號G01N33/566GK1443241SQ01813125
公開日2003年9月17日 申請日期2001年6月27日 優先權日2000年7月27日
發明者勞爾·杜穆蒂爾, 瓊-克里斯多福·雷諾爾德 申請人:路德維格癌症研究院