黃瓜枯萎病菌在提高哈茨木黴菌株l產木黴素水平中的應用的製作方法

2023-12-08 17:53:16

專利名稱：黃瓜枯萎病菌在提高哈茨木黴菌株l產木黴素水平中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及提高哈茨木黴菌產木黴素水平的方法。
背景技術：
微生物發酵中效價往往是決定生產成本以及實現工業化生產的瓶頸所在。對菌株 進行遺傳改造、培養基及培養條件的優化等是提高產素水平的常用方法。近年來，真菌誘導 子在植物細胞培養和微生物發酵生產次生產物的研究中得到廣泛應用。真菌誘導子主要是 真菌的細胞表面結構或分泌物，它們可以是真菌的菌絲體、菌絲體降解產物、發酵液、真菌 分泌物等，主要包括多糖、脫乙醯幾丁質、β-1-3-葡聚糖、乙醯葡萄糖醛酸、糖蛋白、蛋白 質、短肽、不飽和脂肪酸等。關於真菌誘導子在微生物發酵生產活性次生代謝產物的應用報 道很少。研究組從枸骨中分離篩選到一株產木黴素(Trichodermin)的活性內生真菌-哈茨 木黴菌(Trichoderma harzianum),定名為哈茨木黴菌株(Trichoderma harzianum)L。該 菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14 日，保藏登記號CGMCC No. 1780。木黴素對多種農作物病原真菌具有很強的抑制作用，在防 治作物病害中具有廣泛的應用前景。從自然界分離的野生型菌株往往產素水平較低，生產 能力低下。國外有關哈茨木黴菌發酵生產木黴素的文獻甚少，BERTAGN0LLI等報導的哈茨木 黴菌株 Th008 產木黴素的單位為 0. 324μ g/mL(BERTAGNOLLI B L，DALY S and SINCLAIR J B.Antimycotic Compounds from the Plant Pathogen Rhizoctonia solani and its Antagonist Trichoderma harzianum. J. Phytopathology, 1998,146,131-135.)。石if究組分 離到的哈茨木黴菌株L現有的產木黴素單位約為80mg/L，為了更大的發揮哈茨木黴菌株L 和木黴素在生物防治上的應用，提高木黴素產率是關鍵技術。在前期的研究基礎上，發現添 加微生物誘導子能夠有效地提高木黴素產率，通過本發明為提高木黴素的發酵水平提供了 一種可行的方法。

發明內容
在研究提高哈茨木黴菌株L產素水平的試驗中，生物活性測定表明滅活的黃瓜枯 萎病菌(Fusarium oxysporum)菌絲體的加入能夠提高哈茨木黴菌株L發酵液的抑菌效果。 採用氣相色譜分析發酵液中木黴素的含量，顯示添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體後發酵液 中木黴素的濃度與對照相比提高了數倍。本發明通過在哈茨木黴菌株L培養液中添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體，提高發 酵液中木黴素的濃度。該發明為哈茨木黴菌株L的產素水平提高提供了一種可靠的方法。本發明的目的是針對野生型菌株哈茨木黴菌株L產素水平低的不足，提供一種提 高其產素水平的方法；本發明的另一目的是提供利用該菌株代謝產物木黴素製備微生物農 藥的方法。
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本發明目的通過以下技術方案來實現一種提高哈茨木黴菌株L發酵液中木黴素含量的方法按以下步驟進行(1)黃瓜枯萎病菌的培養黃瓜枯萎病菌，從浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所購買。培養基為馬 鈴薯葡萄糖(PD)液體培養基(配方為稱取200g去皮的馬鈴薯，切成塊煮沸半小時，然後 用紗布過濾，加葡萄糖20g，溶化後補足水至1L)，300mL三角瓶裝PD液體培養基60mL，用接 種鉤挑取少許黃瓜枯萎病菌菌絲於滅菌的培養瓶中，置26°C 28°C搖床，200r/min，振蕩 培養6天，發酵液經5000r/min離心lOmin，收集菌絲體，在_53°C、0. 5mbar條件下真空冷凍 乾燥15h，滅活的菌絲體在無菌條件下用研缽研磨至粉末狀，備用； (2)哈茨木黴菌株L液體發酵哈茨木黴菌株L為從枸骨中分離的內生真菌(石一捃，申屠旭萍，俞曉平.1株枸 骨內生真菌菌株的分類鑑定及其代謝產物的生防作用研究.植物病理學報，2009，39 (4) 362-367)。發酵培養基配方其組分與含量(每升培養基中所含的質量)為黃瓜枯萎病菌 菌絲體粉末60mg，蛋白腖30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麩皮5g、MnCl2 0. Olg^KH2PO4 0. lg、 MgSO4 0.05g;對照中不添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末，其餘組分與含量同發酵培 養基配方；300mL三角瓶裝發酵培養基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨木黴菌株L孢子 懸液(IX IO6個/mL)於滅菌的培養瓶中，置28°C搖床，180r/min，振蕩培養96h，發酵液經 5000rmin離心lOmin，上清液用於木黴素含量的測定；(3)木黴素的檢測方法採用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細管柱(以5%苯基甲基矽 氧烷為固定液，30πιΧ320μπιΧ0. 25μπι)；檢測器氫火焰離子檢測器(FID)；檢測器溫度 2700C ；進樣口溫度250°C ；柱溫度程序升溫，初始溫度100°C，保持5min，以10°C -min"1升 溫至260°C保持5min ；載氣氮氣；流速1. 5mL · min—1。本發明的有益效果一是本發明通過在哈茨木黴菌株L培養液中添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體，提 高發酵液中木黴素的濃度，這為哈茨木黴菌株L的產素水平提高提供了一種可靠的方法；二是本發明提供了製備防治作物真菌病害的微生物源農藥的活性成分木黴素，為 農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明提高木黴素產素水平的方法作進一步描述。實施例1 黃瓜枯萎病菌的培養從浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所購買。培養 基為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)，300mL三角瓶裝PD液體培養基60mL，用接種鉤挑取少 許黃瓜枯萎病菌菌絲於滅菌的培養瓶中，置26 V 28°C搖床，200r/min,振蕩培養6天，發 酵液經5000r/min離心lOmin，收集菌絲體，在_53°C、0. 5mbar條件下真空冷凍乾燥15h，滅 活的菌絲體在無菌條件下用研缽研磨至粉末狀，備用；哈茨木黴菌株L液體發酵哈茨木黴菌株L為從枸骨中分離的內生真菌，該菌株已 在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登記號CGMCC No. 1780。發酵培養基配方其組分與含量(每升培養基中所含的質量)為 黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末60mg，蛋白腖30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麩皮5g、MnCl2 0. Olg、 KH2PO4 O.lg、MgSO4 0.05g;對照中不添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末，其餘組分與含 量同發酵培養基配方；300mL三角瓶裝發酵培養基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨木黴菌 株L孢子懸液(IX IO6個/mL)於滅菌的培養瓶中，置28°C搖床，180r/min，振蕩培養96h， 發酵液經5000r/min離心lOmin，上清液用於木黴素含量的測定；木黴素的檢測採用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細管柱(以5% 苯基甲基矽氧烷為固定液，30πιΧ320μπιΧ0. 25μπι)；檢測器氫火焰離子檢測器(FID)； 檢測器溫度270°C ；進樣口溫度250°C ；柱溫度程序升溫，初始溫度10(TC，保持5min，以 IO0C · mirT1 升溫至 260°C保持 5min ；載氣氮氣；流速 1. 5mL · mirT1 ；結果表明添加黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末後，哈次木黴菌L發酵液中木黴素的含 量與對照相比提高了 4倍(從0. 082g/L升高至0. 328g/L)。實施例2 黃瓜枯萎病菌的培養同實施例1 ；哈茨木黴菌株L液體發酵哈茨木黴菌株L為從枸骨中分離的內生真菌，發酵培養 基配方其組分與含量(每升培養基中所含的質量)為黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末90mg，蛋 白腖 30g、玉米粉 10g、葡萄糖 15g、麩皮 5g、MnCl2 0. Olg^KH2PO4 0. lg、MgS04 0 . 05g ；對照中 不添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末，其餘組分與含量同發酵培養基配方；300mL三角 瓶裝發酵培養基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨木黴菌株L孢子懸液(1 X IO6個/mL)於 滅菌的培養瓶中，置28°C搖床，180r/min,振蕩培養96h，發酵液經5000r/min離心lOmin，上 清液用於木黴素含量的測定；木黴素的檢測同實施例1 ；結果表明添加黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末後，哈次木黴菌L發酵液中木黴素的含 量與對照相比提高了 4. 2倍(從0. 082g/L升高至0. 344g/L)。實施例3 黃瓜枯萎病菌的培養同實施例1 ；哈茨木黴菌株L液體發酵哈茨木黴菌株L為從枸骨中分離的內生真菌，發酵培養 基配方其組分與含量(每升培養基中所含的質量)為黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末90mg (在 哈茨木黴菌液體發酵24小時後添加)，蛋白腖30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麩皮5g、MnCl2 0. Olg、KH2PO4 0. lg、MgSO4 0. 05g ；對照中不添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末，其餘組 分與含量同發酵培養基配方；300mL三角瓶裝發酵培養基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨 木黴菌株L孢子懸液(IX IO6個/mL)於滅菌的培養瓶中，置28°C搖床，180r/min，振蕩培養 108h，發酵液經5000r/min離心lOmin，上清液用於木黴素含量的測定；木黴素的檢測同實施例1 ；結果表明添加黃瓜枯萎病菌菌絲體後，哈茨木黴菌株L發酵液中木黴素的含量 與對照相比提高了 4. 25倍(從0. 082g/L升高至0. 349g/L)。實施例4 番茄灰黴病菌的培養番茄灰黴病菌(Botrytis cinerea)從浙江省農業科院植 物保護與微生物研究所購買。培養基為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)，300mL三角瓶裝PD
5液體培養基60mL，用接種鉤挑取少許黃瓜枯萎病菌菌絲於滅菌的培養瓶中，置26°C 28°C 搖床，200r/min,振蕩培養6天，發酵液經5000r/min離心lOmin，收集菌絲體，在_53°C、 0. 5mbar條件下真空冷凍乾燥15h，滅活的菌絲體在無菌條件下用研缽研磨至粉末狀，備 用；哈茨木黴菌株L液體發酵哈茨木黴菌株L為從枸骨中分離的內生真菌，發酵培養 基配方其組分與含量(每升培養基中所含的質量)為番茄灰黴病菌菌絲體粉末60mg，蛋 白腖 30g、玉米粉 10g、葡萄糖 15g、麩皮 5g、MnCl2 0. Olg^KH2PO4 0. lg、MgS04 0 . 05g ；對照中 不添加番茄灰黴病菌菌絲體粉末，其餘組分與含量同發酵培養基配方；300mL三角瓶裝發 酵培養基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨木黴菌株L孢子懸液(1 X IO6個/mL)於滅菌的 培養瓶中，置28°C搖床，180r/min,振蕩培養96h，發酵液經5000r/min離心lOmin，上清液用 於木黴素含量的測定；木黴素的檢測採用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細管柱(以5% 苯基甲基矽氧烷為固定液，30πιΧ320μπιΧ0. 25μπι)；檢測器氫火焰離子檢測器(FID)； 檢測器溫度270°C ；進樣口溫度250°C ；柱溫度程序升溫，初始溫度IOCTC，保持5min，以 IO0C · mirT1 升溫至 260°C保持 5min ；載氣氮氣；流速 1. 5mL · mirT1 ；結果表明添加番茄灰黴病菌菌絲體粉末後，哈茨木黴菌株L發酵液中木黴素的 含量(0.0825g/L升)與對照(0.0820g/L升)相比基本沒有提高。
權利要求
黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)菌絲體在提高哈茨木黴菌株(Trichoderma harzianum)L生產木黴素水平中的應用，其特徵在於將滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末加入到哈茨木黴菌株L的培養基中，對哈茨木黴菌株L進行培養發酵，然後對發酵液進行離心；其中哈茨木黴菌株L為從枸骨中分離的內生真菌，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登記號CGMCC No.1780。
2.權利要求1所述的提高哈茨木黴菌株L發酵液中木黴素含量的方法，其特徵在於所 述的培養基中含有滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末、蛋白腖、玉米粉、葡萄糖、麩皮、MnCl2、 KH2PO4、MgSO4。
3.權利要求2所述的培養基各組分含量(每升培養基中所含的質量)為滅活的黃瓜 枯萎病菌菌絲體粉末60-90mg、蛋白腖30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麩皮5g、MnCl2 0. Olg、 KH2PO4 0. lg、MgSO4 0. 05g。
4.權利要求1所述的用途，其特徵在於黃瓜枯萎病菌的培養過程為培養基為馬鈴薯 葡萄糖液體培養基，用接種鉤挑取少許黃瓜枯萎病菌菌絲於滅菌的培養瓶中，搖床振蕩培 養；然後發酵液離心，收集菌絲體，真空冷凍乾燥，將滅活的菌絲體在無菌條件下用研缽研 磨至粉末狀。
全文摘要
本發明公開了黃瓜枯萎病菌在提高哈茨木黴菌株L產木黴素水平中的應用，屬於微生物技術領域。該方法將滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末加入到哈茨木黴菌株L的培養基中進行發酵培養，然後對發酵液進行離心，採用氣相色譜分析發酵液中木黴素的含量，顯示添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末後發酵液中木黴素的濃度與對照相比提高了數倍。通過本發明為提高哈茨木黴菌株L產木黴素的發酵水平提供了一種可行的方法。
文檔編號C12R1/885GK101979619SQ20101052764
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月2日 優先權日2010年11月2日
發明者俞曉平, 申屠旭萍, 董勝張, 邊亞琳, 郝培應 申請人:中國計量學院