多表位疫苗yl66以及在製備腫瘤治療性疫苗中的應用的製作方法

2023-12-09 02:10:16 1

專利名稱：多表位疫苗yl66以及在製備腫瘤治療性疫苗中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域中的多表位疫苗技術，尤其是涉及一種多表位疫苗YL66，本發明還涉及該多表位疫苗YL66在製備腫瘤治療性疫苗中的應用。
背景技術：
近年來疫苗在預防和治療感染性疾病和惡性腫瘤上獲得巨大成功，研究和開發新型腫瘤疫苗已經成為腫瘤免疫治療研究的熱點和方向。腫瘤疫苗(tumor vaccine)治療的核心是腫瘤抗原，包括腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen, TSA)和腫瘤相關性抗原(tumor-associated antigen, TAA)。腫瘤疫苗的基本原理是利用腫瘤抗原,通過主動免疫的方式來誘導機體產生特異性抗腫瘤免疫反應，以此來激發機體自身的免疫保護機制，達到腫瘤治療或預防復發的作用。腫瘤抗原的分類標準不盡相同，根據腫瘤抗原的性質和組分的不同，腫瘤疫苗可以分為以細胞為載體的腫瘤疫苗(包括腫瘤細胞疫苗、樹突狀細胞疫苗和融合疫苗)、多肽/蛋白質疫苗、DNA (核酸)疫苗、抗獨特型疫苗、病毒疫苗和異種疫苗等。
多肽疫苗是按照抗原基因中已知或人工軟體預測的某段抗原表位的胺基酸序列通過化學合成技術製備的疫苗。使用吋，直接將化學合成的多肽疫苗注入體內或者在體外共培養以誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，它是抗腫瘤免疫中主要的效應細胞，從而對腫瘤細胞起到殺傷作用。多肽疫苗即表位(印itope)，是抗原上的抗原決定簇，是與T細胞受體/B細胞受體或抗體特異結合的基本単位，是決定抗原特異性的特殊化學基團。多肽疫苗的優點是特異性高、可以方便地人工設計和大量合成純度高、複製性好、化學性質穩定安全性好、費用低廉、無致癌性的多肽。但是肽的半衰期很短，只能提供暫時的刺激，同時誘導的免疫反應只能針對該種T細胞表面肽而不能引起廣泛的T細胞免疫，而且在應用上還要受到HLA分子配型以及患者腫瘤是否表達該抗原的限制。這些問題使多肽疫苗在臨床上的應用受到一定的限制。由於多肽疫苗的免疫原性弱，只含單個表位肽，且多肽疫苗與人的MHC I類分子HLA-A*0201相關，具有人白細胞抗原HLA-A2限制性，於是，人們提出將腫瘤抗原整個或部分蛋白質作為疫苗。這種蛋白質疫苗包含了更多的MHC I和MHC II類分子限制的表位肽，與多肽疫苗受主要組織相容性複合體(MHC)限制性不同的是，免疫原性較肽疫苗更強且具有所有表位，可以克服HLA限制。將編碼特定蛋白的外源基因直接導入動物體內，來達到免疫接種的目的，這種核酸既是載體同時也是抗原的來源，具有疫苗的功能，被稱為核酸疫苗，這是近幾年來迅速發展起來的新興的分子生物學和免疫學相結合的ー種技術。它包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究最多的是DNA疫苗。由於DNA疫苗的眾多優點，目前已經被應用於臨床前期實驗，但是由於整合後的重組真核表達載體可能具有潛在的危險性且不具備內在的擴增能力，其在人體內的安全性和療效以及遠期效果都仍需要繼續觀察。然而，免疫原性弱和免疫耐受的存在是多表位疫苗作為腫瘤治療性疫苗應用的兩大障礙。因此,如何提高多表位的免疫原性以及打破機體對多表位的免疫耐受成為腫瘤治療性多表位疫苗發展的關鍵。

發明內容
本發明的目的在於提供一種多表位疫苗YL66，本發明還提供了多表位疫苗YL66在製備腫瘤治療性疫苗中的應用。為實現上述目的，本發明可採取下述技術方案
本發明所述的多表位疫苗YL66，以來源於腫瘤細胞高表達抗原C0X-2和MAGE-4的HLA-A2 限制性 CTL 優勢表位線性九肽 p321 (ILIGETIKI)、p321_lY9L (YLIGETIKL)、P286-1Y2L9L (YLLEHVVRL)為基礎，引入相關輔助序列 TAT-PTD (47_57) (YGRKKRRQRRR)、Th 表位PADRE (AKFVAAWTLKAAA)、肽酶識別基序RVKR以及柔性連接子GSG設計而得的。YL66 的序列示意如下TAT-PTD(47_57) — GSG 序列一PADRE—RVKR — p321—RVKR—P321-1Y9L— RVKR-p286-lY2L9L0YL66的胺基酸序列為 Tyr-bly—Arg-Lys-Lys—Arg—Arg-irln—Arg—Arg—Arg-Gly-ber-Gly-Ala-Ly s_Phe~Val-
Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Leu-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr-I
Ie-Lys-Ile-Arg-Val-Lys-Arg-Tyr-Leu-Ile-Gly-Glu-Tnr-Ile-Lys-Leu-Arg-Val-Lys-Ar
g_Tyr_Leu_Leu_Glu_His_Val_Val_Arg_Leu。由多表位疫苗YL66構建出原核表達載體PGEX-4T-2-YL66和真核表達載體pCDNA3. 1-YL66 ;其中原核表達載體pGEX-4T_2_YL66在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行原核表達，得到融合蛋白GST-YL66。本發明還提供了真核表達載體P⑶NA3. 1-YL66和融合蛋白GST-YL66在製備腫瘤治療性疫苗中的應用。本發明的優點在於採用理論和實驗相結合的方法構建出多表位疫苗YL66，並用於融合蛋白GST-YL66和DNA疫苗pCDNA3. 1-YL66。構建的YL66多表位未見文獻報導，為相關腫瘤的免疫治療提供了實驗基礎和理論基礎，也為重組蛋白表達和純化方面做出了努力，初歩了解該疫苗的免疫效果也為多表位疫苗和DNA疫苗在過繼性免疫治療和臨床應用上提供更多的支持。


圖I、圖2分別為原核表達載體pGEX-4T-2-YL66和真核表達載體pCDNA3. 1-YL66的測序圖譜。圖3是GST-YL66融合蛋白表達和GST的全菌體蛋白12%SDS_PAGE分析。圖4是純化後蛋白GST和GST-YL66的12%SDS_PAGE分析。圖5 圖8是融合蛋白疫苗GST-YL66特異性CTL分泌IFN- Y的能力檢測。圖9 圖12是融合蛋白GST-YL66特異性CTL的體外細胞毒實驗結果。圖13是融合蛋白疫苗GST-YL66在HLA-A2. I/Kb轉基因小鼠體內特異性CTL分泌IFN-Y的能力檢測。圖14、圖15是融合蛋白GST-YL66特異性CTL的體內細胞毒實驗結果。
圖16是DNA疫苗pCDNA3. 1-YL66在HLA-A2. I/Kb轉基因小鼠體內特異性CTL分泌IFN-Y的能力檢測。圖17、圖18是DNA疫苗pCDNA3. 1-YL66誘導的特異性CTL在體內細胞毒實驗結
果O圖19是轉基因小鼠的體重變化記錄。
具體實施例方式本發明根據理論和實踐相結合的方法，以腫瘤高表達抗原C0X-2和MAGE-4的HLA-A2限制性CTL表位為基礎，選取能夠在健康供者外周血或者轉基因小鼠體內誘發強效的CD8+T細胞免疫反應且對腫瘤細胞產生特異性殺傷的天然表位和改造肽表位，從C0X-2 得到的HLA-A2限制性CTL表位p321以及它的改造表位肽P321_1Y9L和從MAGE-4得到的HLA-A2限制性CTL表位p286的改造表位肽P286_1Y2L9L進行表位優化組合後，引入Tat-PTD, GSG連接子、PADRE和RVKR接頭，構建出多表位融合疫苗YL66，YL66的胺基酸序列如下
YGRKKRRQRRR—GSG—AKFVAAWTLKAAA—RVKR—ILIGETIKI—RVKR—YLIGETIKL—RVKR—YLLEHVVRL (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Ser-Gly-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Leu-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr—Ile—Lys—Iie—Arg—Val—Lys—Arg—Tyr—Leu—Ile—Giy—Glu—Thr—Ile—Lys—Leu—Arg—Val—Lys-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Leu)
由YL66的胺基酸序列得到YL66的核苷酸序列
TAT GGC CGT AAG AM CGT CGT CAG CGT CGC CGT GGC AGC GGT GCG MA TTT GTG GCGGCG TGG ACC CTG AM GCG GCC GCC CGT GTT AAG CGT ATT CTG ATT GGC GAA ACC ATC MAATC CGT GTT AAG CGT TAT CTG ATC GGT GM ACC ATC AM CTG CGT GTT MG CGT TAT CTGCTG GAA CAT GTG GTG CGT CTG
交由生エ生物工程(上海)有限公司進行合成PUC57-YL66。為了將上述YL66的DNA片段克隆進原核表達載體pGEX_4T_2和真核表達載體PCDNA3. I中，以公司合成的PUC57-YL66為模板，設計帶有不同酶切位點適合兩種質粒載體的兩對引物進行YL66的PCR擴增。載體為pGEX-4T-2時引物設計如下
Forward primerl (Fl) GGATCCACCATGGGTTATGGC (下劃線部分為 BamH I)
Reverse primerl (Rl) CCGGAATTCGCAGACGCAC (下劃線部分為 EcoR I)
載體為P⑶NA3. I時引物設計如下
Forward primer2 (F2) CGGGATCCCGATGTATGGCCGTAAGAA (單下劃線部分為 BamH I，雙下劃線為起始密碼子)
Reverse primer2 (R2)GGAATTCCTACAGACGCACCACATGTTC (單下劃線部分為 EcoR I，雙下劃線為終止密碼子)
通過上述引物的PCR方法擴增後，進行雙酶切、膠回收、4°C連接過夜的方法將此片段克隆進原核表達載體PGEX-4T-2和真核表達載體P⑶NA3. 1，以獲得原核表達載體PGEX-4T-2-YL66和DNA疫苗pCDNA3. 1-YL66，進行測序，測序結果如圖I、圖2所示，與預期的一致，無閱讀框移位等現象。GST-YL66融合蛋白的原核表達和純化將鑑定正確的重組質粒pGEX-4T-2_YL66及pGEX-4T-2空載體轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)，37°C LB平板(Amp+)培養過夜。BL21(DE3)菌種以1:100的比例加入到含有50 μ g/mL氨苄青黴素的IOOml液體LB培養基中，37°C、200r/min培養。次日將Iml菌液加入到IOOml的LB培養基(Amp+)中，37°C、200r/min振蕩培養至對數中期(A600=0. 4 O. 6)，加入IPTG(終濃度為lmmol/L)，30°C繼續培養3h。3h後的大腸桿菌在4°C、5000rpm離心15min，棄上清取沉澱菌體，加入含終濃度為ImM苯甲基磺醯氟(PMSF)、0. 2mg/mL溶菌酶(lysozyme)的pH=7. 2的PBS (按照每IL菌液的沉澱菌體加IOOml的PBS)進行重懸，冰浴中超聲破碎15min (超聲IOs間歇20s)，待渾濁菌液呈澄清狀態且與超聲振頭不粘連時結束超聲。在4°C條件下，12000rpm離心20min,棄沉澱取上清4°C保存,用於GST Sefinose Resin的親和層析純化實驗。親和層析純化實驗流程①將恆流泵、支架、空心玻璃柱、核酸蛋白檢測儀、臺式記錄儀、自動部分收集器依次連接完成，在玻璃柱中加入3ml穀胱甘肽-瓊脂糖樹脂(保存於20%こ醇)，用5-10倍柱體積的PBS 洗滌，流速I. 5ml/min必用3 5倍穀胱甘肽緩衝液和10倍體積PBS/EDTA/PMSF洗滌柱子，流速I. 5ml/min ;③將上面步驟得到的上清加入,流速彡O. lml/min 用10倍體積的PBS/EDTA洗滌柱，流速為I. 5ml/min 用5倍體積的穀胱甘肽緩衝液洗脫結合的GST融合蛋白，流速為O. 3mL/min，收集洗脫液，經12% SDS-PAGE電泳後用考馬斯亮藍R-250染色檢測親和層析純化結果。結果如圖3，4所示，得到了融合蛋白GST-YL66。⑥10倍體積PBS繼續洗滌後，5倍體積20%こ醇洗滌，並保存於20%こ醇。將鑑定後得到的GST-YL66與凝血酶混合(凝血酶酶切體系每毫升的柱體積，4°C條件下，準備80μ I即160個單位凝血酶和920 μ I pH7. 3PBS的混合物)再按照上述的親和層析方法③中得到的流出液體即為YL66蛋白。GST-YL66和pCDNA3. 1-YL66的相關免疫活性檢測實驗
①GST-YL66融合蛋白疫苗體外免疫活性實驗。HLA-A2健康供者外周血單核細胞(PBMCs)的分離通過淋巴細胞分離液分離獲得PBMCs0將PBMCs於24孔板中培養，每孔加含IL-2，β 2_M，CpG 0DN-1826的頂DM培養基以及PBS組、GST組、GST-YL66組的相應各組分，置於37°C、5% C02培養箱中培養。分泌IFN- Y的T細胞數的檢測採用ELISP0T實驗，靶細胞為荷3個單獨表位的T2A2細胞，用ELISP0T圖像分析儀計數96孔板中每孔形成的斑點數。如圖5 圖8所示。結果顯示100μ g和200μ g融合蛋白疫苗GST-YL66能檢測到特異性T細胞免疫，同時相對於IOOyg GST所產生的斑點數相比差異顯著0° O. 05)。說明融合蛋白和DNA免疫製劑對於小鼠的體重和肝腎均沒有明顯的影響。表I免疫製劑對於小鼠肝腎指數的影響(^is, n=5 )
權利要求
1.一種多表位疫苗YL66,其特徵在於所述疫苗的胺基酸序列為Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys—Arg—Arg—Gin—Arg—Arg—Arg-Gly—Ser—Gly—Ala—Lys_Pne~Val—Ala—Ala-Trp-Thr—Leu—Leu—Ala—Ala—Ala—Arg~Val_Lys—Arg-Ile—Leu—Ile-Gly-Glu-Thr-Iie-Lys—Ile—Arg~Val_Lys-Arg-Tyr-Leu-Ile-Gly-Glu-Thr-Ile-Lys-Leu-Arg-Val-Lys-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Leu0
2.根據權利要求I所述多表位疫苗YL66，其特徵在於由所述多表位疫苗YL66構建出原核表達載體pGEX-4T-2-YL66和真核表達載體pCDNA3. 1-YL66 ;其中原核表達載體PGEX-4T-2-YL66在大腸桿菌BL21中進行原核表達，得到融合蛋白GST-YL66。
3.根據權利要求2所述真核表達載體p⑶NA3.1-YL66和融合蛋白GST-YL66在製備腫瘤治療性疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種多表位疫苗YL66，並在此基礎上構建出原核表達載體pGEX-4T-2-YL66和真核表達載體pCDNA3.1-YL66，通過載體pGEX-4T-2-YL66的原核表達，得到融合蛋白GST-YL66。通過HLA-A2健康供者外周血和HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠的體內外ELISPOT實驗和LDH實驗，對融合蛋白GST-YL66和DNA疫苗pCDNA3.1-YL66進行了免疫活性研究。研究發現本發明所述抗腫瘤多表位疫苗在轉基因小鼠體內和人體外所誘導的特異性CTL對腫瘤細胞EC-9706顯示出一定的殺傷率，同時所誘導的CTL具有一定的抗原特異性，可用於腫瘤多表位疫苗構建策略和應用的進一步探究。
文檔編號A61P35/00GK102657854SQ20121015991
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月22日 優先權日2012年5月22日
發明者孫萌, 祁元明, 翟文杰, 翟明霞, 鄒喆, 陳飛, 高豔鋒 申請人:鄭州大學