用於產生體細胞的細胞系統的製作方法

2023-12-09 09:17:26

專利名稱：用於產生體細胞的細胞系統的製作方法
技術領域：
本發明是關於細胞系統及產生體細胞的方法。
背景技術：
許多臨床上常見的慢性神經退化疾病，如帕金森氏症、阿茲海默症、亨丁頓氏症及肌萎縮性脊髓側索硬化症，都是由於中樞神經系統(CNS)中的神經細胞退化及死亡造成的結果。神經細胞不像表皮及肝臟細胞，無法快速地再生。雖然CNS中的幹細胞在正常及神經細胞受損的情況下都可複製及分化，但其複製速度相當慢，且分化成神經細胞的比例非常低。CNS中大部分的幹細胞會分化成神經膠質細胞，因而無法挽救神經退化疾病。
神經細胞移植提供一個治療神經退化疾病的方向，研究人員已試著在活體外及活體內從不同的幹細胞產生神經細胞。一般相信幹細胞具有某些特性，包括自我更新、多潛能性、增殖、長壽及分化。在臨床的應用上，胚胎、臍帶血及骨髓是最普遍的人類幹細胞來源。在胚胎中可治療中樞神經系統病變的幹細胞主要是神經幹細胞及囊胚的胚胎幹細胞(R.L.Rietze et al.，2001，Nature 412；736-739)。研究也指出為了修還脊髓創傷，以胚胎幹細胞(J.W.McDonald et al.，1999，NatureMedicine 51410-1412)或神經幹細胞(Q.L.Cao et al.，2001，Experimental Neurology 16748-58)移植後，這些細胞主要分化成星細胞及寡樹突細胞，極少數轉變為神經細胞。除了取得困難、移植後的生存率不高及轉變為神經細胞的比例極低外，胚胎組織的移植也因為宗教、法律及道德爭議而受到阻礙。
藉由直接植入臍帶血中的造血幹細胞以治療受損神經細胞仍有待研究。然而，活體外模式顯示，臍帶血中的造血幹細胞培養在含有0.001％的β-巰基乙醇(βME)培養基中可轉型成神經細胞的前趨物，其中10％的細胞可進一步被誘導而分化成神經細胞及神經膠質細胞(J.R.Sanchez-Ramos et al.，2001，Experimental Neurology 171109-115；及Y.Ha et al.，2001，Neuroreport 12(16)3523-3527)。由於臍帶血幹細胞轉變成神經細胞的比例相對地較低，因此臍帶血的應用及研究主要集中在血液疾病。
骨髓中含有造血幹細胞，其提供紅血球、血小板、單核細胞、顆粒細胞及淋巴細胞前趨物的持續來源。此外，骨髓也含有達到非血液組織幹細胞標準的細胞。已有報告指出，老鼠成熟骨髓中的造血幹細胞可分化成腦中的微神經膠質細胞及大神經膠質細胞(M.A.Eglitis etal.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.944080-4085)。骨髓基質中的非造血幹細胞被稱為骨髓基質細胞(BMSC)或骨髓間葉細胞。BMSC在活體外可分化成骨生成細胞、軟骨生成細胞、脂肪生成細胞、肌纖維生成細胞及其它系統(M.F.Pittenger et al.，1999，Science 284143-147及B.E.Petersen et al.，1999，Science 2841168-1170)。最近，BMSC已被報告可在活體內分化為神經細胞(S.A.Azizi et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.953908-3913；及G C.Kopen et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.9610711-10716)。
以上所有產生神經細胞的多能性細胞都有一個共通的問題這些細胞大部分都分化成神經膠質細胞(星狀細胞、寡樹突細胞等)而非神經細胞。只有在BMSC的活體外培養發現BME在神經分化上有顯著的效果，其可誘導80％的培養BMSC分化成神經細胞(D.Woodbury etal.，2000，Journal of Neuroscience Research 61364-370)。然而，BME對蛋白質具有毒性而不適用於人體(K.White et al.，1973，Journal ofpharmaceutical Sciences 62237-241)。因此仍需要開發新的多功能細胞來源用於產生神經細胞。
數十年來有數百萬人受到心臟損害而使心肌細胞死亡。心臟受損區域形成疤痕組織而損害心臟的功能。儘管治療方法有進展且對疾病病理學的基礎的了解有顯著地增進，每年因心血管疾病死亡的人數尚未降低到令人滿意的程度。因此，心血管研究人員持續尋找再生心肌細胞，希望能發現替換受損心臟組織的方法。
因為建立多效性細胞可能會對早期人類心臟分化、功能性基因體學、藥學測試、細胞治療及組織工程的研究造成巨大衝擊，因此尋找可用於分化為有用的心肌細胞，且完全不需憂慮如上所討論的道德及技術上的問題的新穎細胞的需求日漸增加。

發明內容
為克服上述現有技術的缺點，本發明提供產生體細胞的細胞系統。特別地，本發明的細胞系統包括臍帶間葉細胞。
另一方面，本發明提供產生體細胞的方法，其包括培養臍帶間葉細胞及誘導培養的臍帶間葉細胞細胞分化的步驟。
在一具體實施例中，此培養的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由外胚層衍生的細胞。
在另一具體實施例中，此培養的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由中胚層衍生的細胞。
在更另一具體實施例中，此培養的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由內胚層衍生的細胞。


圖1表示臍帶間葉細胞在2mMβ-巰基乙醇中培養48小時後，(A)NF及(B)NeuN的免疫染色結果。
圖2表示臍帶間葉細胞在(A)FBS-DMEM培養基(控制組)及(B)培養過神經細胞的培養基中培養6天後的型態。
圖3表示臍帶間葉細胞在培養過神經細胞的培養基中培養6天後，(A)NF及(B)NeuN的免疫染色結果。
圖4表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基處理不同時間後，其表現NF的比例。
圖5表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基處理後，GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法結果。
圖6表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基培養9天後，其(A)parvalbumin(PV)及(B)calbindin-D28K(CB)的免疫染色結果。
圖7表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基培養6天後，其GAD的(A)免疫染色及(B)西方墨點法結果。
圖8(A)表示經培養過神經細胞的培養基誘導的臍帶間葉細胞在處理後第0、3、6及9天時，其細胞密度的改變(比例尺100μm)；(B)表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基處理後，以DAPI染色定量細胞密度。
圖9表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基培養3天(3D)及9天(9D)後，以DAPI+BrdU雙重染色及NF+BrdU雙重染色的結果。
圖10表示臍帶間葉細胞在(A)不提供細胞分化因子，及(B)提供細胞分化因子後，其C-肌鈣蛋白I及F-肌動蛋白絲的表現的照片影像。
具體實施例方式
培養的臍帶間葉細胞可增殖及分化成各種體細胞。
在此使用的「臍帶間葉細胞」乙詞是指位於哺乳類動物臍帶，較佳為人類臍帶間質組織中的細胞。
根據本發明，臍帶間葉細胞是從臍帶中分離出來，並在已知的細胞培養基中培養使其增殖。根據本發明，適用於培養臍帶間葉細胞的培養基包括但不限於達爾克必需基本培養基(DMEM)。培養的臍帶間葉細胞可直接用於產生體細胞，或冷凍於液態氮中用於將來使用。
根據本發明，培養的臍帶間葉細胞可經由適當處理而引發其分化。在本發明一具體實施例中，培養的臍帶間葉細胞可分化成來自內胚層的體細胞，包括但不限於神經細胞及視網膜。在本發明另一具體實施例中，培養的臍帶間葉細胞可分化成來自中胚層的體細胞，包括但不限於肌肉細胞(骨骼肌、平滑肌、心肌細胞及心血管細胞)、骨原細胞、軟骨原細胞、腸胃器官及肝臟。在本發明更另一具體實施例中，培養的臍帶間葉細胞可分化成來自內胚層的體細胞，包括但不限於腸胃器官的黏膜表皮。
培養的臍帶間葉細胞可添加適當的添加物而誘導其神經細胞分化。如在培養胚胎幹細胞或神經幹細胞時可加入神經生長因子(NGF)以誘導神經細胞分化(AM Wobus et al.，1997，Journal of Molecular Cellular Cardiology 291525-1539.；E Cattaneo及R McKey，1990，Nature 347762-765.)。其它從骨髓基質細胞誘導神經細胞分化的方法包括但不限於加入視網酸(RA)、表皮生長因子(EGF)及腦源神經性因子(BDNF)(J Sanchez-Ramos et al.，2000，Experimental Neurology 164247-256)。另一實驗結果顯示，β-巰基乙醇(βME)可引發骨髓基質細胞分化成神經細胞(D Woodbury et al.，2000，Journal of NeuroscienceResearch 61364-370)。
培養的臍帶間葉細胞可添加適當添加物而誘導其心肌細胞分化。如可在培養胚胎幹細胞時加入催產素以誘導心肌細胞分化(J Paquin etal.，2002，PNAS 99(14)9550-9555)。另一個由骨髓基質細胞誘導心肌細胞分化的方法是以5-疊氮胞(5-azacytidine)處理。電子顯微鏡顯示有包括典型肌節及心房顆粒的類心肌細胞的超結構產生，(K Fukuda，2001，Artificial Organs 25(3)187-193)。
在本發明一較佳具體實施例中，以藉由將神經細胞培養於基礎培養基6至9天而製備的培養基培養的臍帶間葉細胞，可高度(87％)分化成功能性後分裂神經細胞。培養過神經細胞的培養基是另一個同時申請專利的標的(序號091136135)。
在本發明的另一較佳具體實施例中，培養於加有細胞分化因子，如5-疊氮胞，的培養基中的臍帶間葉細胞可分化成心肌細胞或心血管細胞。
以下分析是用以定性根據本發明的方法所產生的神經細胞。
NF的免疫細胞化學神經纖維(NF)是神經細胞中的主要細胞骨骼，其負責調整神經細胞樹突的大小、外觀及直徑。只有在發育晚期及成熟期的神經細胞才會表現NF。對NF的免疫染色可用以確定神經細胞處於晚期。
NeuN的免疫細胞化學神經細胞特定核蛋白(NeuN)是脊椎動物中樞神經系統神經細胞細胞核中的特殊蛋白。在活體外NeuN可和DNA結合。已知在神經細胞發育中，NeuN的出現較NF早。因此對NeuN的免疫染色可用以確定神經細胞處於轉型早期。
GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法在哺乳動物的CNS中，麩胺酸是主要的刺激神經傳導物質。大部分的神經細胞都有麩胺酸受體來接收刺激信息。其中主要有二類麩胺酸受體離子型及代謝型。離子型受體可依照其不同的選擇性激動劑，進一步再分為NMDA(N-甲基-D-天門冬胺酸)受體、AMPA(α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異唑基丙酸)受體及KA(海人草酸)受體。KA受體是由GluR5、GluR6、GluR7、KA1及KA2等次單元形成。因此，利用西方墨點法檢測GluR5、GluR6、GluR7及KA2可確定神經細胞具有合成功能性蛋白質的能力。
Ca2+結合蛋白的免疫細胞化學Ca2+在細胞的信息傳遞途徑中扮演重要的角色。然而，在細胞中大部分的Ca2+並不是單獨作用，而是和Ca2+結合蛋白相結合。Ca2+結合蛋白可以緩衝細胞內的Ca2+濃度，進而調節Ca2+的活性。在中樞神經系統中存在著許多種類的Ca2+結合蛋白，分布最廣的是parvalbumin(PV)、calbindin-D28K(CB)及calretinin。PV及CB皆屬於EF-hand型Ca2+結合蛋白家族。在胚胎神經系統發育期間，PV及CB被認為是神經細胞特定表現的Ca2+結合蛋白。因此，對PV及CB的免疫染色可用以確定神經細胞具有合成功能性蛋白質的能力。
BrdU及DAPI的雙重標記DAPI(4′，6-二基-2-苯基二鹽酸鹽)是一種螢光染料，可自由地通過細胞膜和核膜，並和細胞核中的DNA結合，通常用以計算細胞的數目。此外，在細胞複製過程中，細胞須合成另一組染色體，並將外加的BrdU(溴化去氧尿核，其為胸腺嘧啶核酸的相似物)納入所合成的染色體中。因此，觀察BrdU的納入可用以確定細胞的複製。BrdU及DAPI的雙重標記可確定神經細胞的複製。
BrdU及NF的雙重標記如上所述，NF的免疫染色用以確定是否為神經細胞，BrdU則用以確定細胞的複製。因此，NF及BrdU的雙重標記可確定神經細胞的複製能力。
GAD的免疫細胞化學GABA是神經傳導物質的一，其是由麩胺酸經麩胺酸去羧基(GAD)催化而合成。因此，利用對GAD的免疫染色可確定神經細胞具有合成神經傳導物質GABA的能力。
根據本發明的方法所產生的神經細胞可用於治療神經退化疾病，如帕金森氏症、阿茲海默症、亨丁頓氏症，及肌萎縮性脊髓側索硬化症或因中風及外傷造成的神經細胞死亡。
以下的分析是用於定性根據本發明的方法所產生的心肌細胞及心血管細胞。
心臟肌鈣蛋白(Troponin)I/F-肌動蛋白的免疫細胞化學利用免疫細胞化學，可於形成收縮的心肌細胞之間葉細胞中研究心臟特殊蛋白質的存在及其空間組織。特殊的心臟細胞標記，如心臟肌鈣蛋白I，已被證明(Kehat et al.，2001.)可在收縮的心肌細胞中陽性染色，以證實該細胞性質為心肌細胞而非骨骼肌細胞。此外，為證明該間葉細胞可組成整齊的排列，就像心臟組織的細胞排列方式，該細胞也以F-肌動蛋白(其為維持完整細胞結構的細胞骨架必需蛋白質)染色。
由以下的實施例對本發明做進一步說明，但不應以此限定本發明的範圍。
實施例1人類臍帶間葉細胞的製備人類臍帶間葉細胞是從一提供接生服務的診所(蔡氏婦產科診所，臺北市北投區石牌路一段72號)取得。臍帶以無菌操作方式收集並在4℃下儲存於HBSS(Biochrom L201-10)不超過24小時。
臍帶先泡在75％的乙醇中30秒以消毒。在無菌操作臺中將消毒過的臍帶置於無鈣及無鎂離子的緩衝溶液(CMF，Gibco 14185-052)，以消毒過的器具將臍帶縱切，並將其中的血管及間葉組織(瓦頓氏凝膠)去除。將間葉組織切成0.5立方公分的小塊，以250×g離心5分鐘。去除上清液，並以適量的無血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉澱物二次，再以250×g離心5分鐘。間葉組織在37℃下以膠原 處理14至18小時，清洗後，再以2.5％的胰蛋白 於37℃及震蕩下處理30分鐘。加入FBS(Hyclone SH30071.03)至間葉組織以終止胰蛋白反應。此時間葉組織已變成間葉細胞。
間葉細胞以10％FBS-DMEM使其分散並計算其數量後，便可直接用於培養。
實施例2利用β-巰基乙醇(BME)將臍帶間葉細胞轉形為神經細胞將由實施例1得來的臍帶間葉細胞培養於10％FBS-DMEM中72小時。於培養物中加入2mM的βME繼續培養72小時。結果顯示於圖1。
如圖1(A1及A2)所示，臍帶間葉細胞培養於2mMβME72小時後可表現NF，顯示臍帶間葉細胞已轉形為神經細胞。
如圖1(B1及B2)所示，臍帶間葉細胞培養於2mMβME72小時後可表現NeuN，顯示臍帶間葉細胞已轉形為神經細胞。
實施例3利用培養過神經細胞的10％FBS-DMEM將臍帶間葉細胞轉形成神經細胞(a)培養過神經細胞的10％FBS-DMEM的製備用以製備培養過神經細胞的FBS-DMEM的神經細胞是取自七天大的史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠的腦部(中華民國臺灣省臺北市國立陽明大學動物中心)。
在以下的操作的前，先將含有24ml10％FBS-DMEM的50ml離心管置於37℃培養箱內。
大鼠以i.p.注射給予0.3ml的10％水合氯化物。3至4分鐘後，完全麻醉的大鼠以75％乙醇全身消毒。在無菌操作臺中將大鼠腦取出並置於CMF中。將腦以900rpm離心5分鐘。去除上清液，添加10％FBS-DMEM至沉澱物(腦組織)。以移液器吸放15次將腦組織打散成單細胞。將打散的細胞加至的前準備的50ml離心管，與其中的FBS-DMEM充分混合。將此混合物加至24孔盤的塗覆有聚-L-離胺酸的孔中，在37℃培養箱中培養。第二天加入最終濃度為2μM的阿糖胞(Arac)。
培養的第五天，此培養基即可取出用來培養臍帶間葉細胞。
(b)臍帶間葉細胞轉形為神經細胞將由實施例1得到的臍帶間葉細胞，培養於由實施例2得到的培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基中，或培養於FBS-DMEM(控制組)中，置於37℃培養箱。在第3、6、9及12天收集細胞。
如圖2(A)所示，培養於FBS-DMEM 6天的臍帶間葉細胞(控制組)的形態為紡錘型，且因細胞增殖而互相緊密地貼附。培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基6天的臍帶間葉細胞顯現神經的表型，包括細胞體收縮、細胞突起的延伸(process elaboration)及細胞集簇(圖1B)。
實施例4神經細胞分化的定性分析在實施例3中收集的細胞用做以下的分析，其結果描述如下(1)NF的免疫染色以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶於0.1M PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(兔子抗神經纖維200多株IgG，1∶250稀釋，Chemicon AB1982)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的的山羊抗兔子IgG，1∶1000稀釋，Sigma b-8895)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml的50mM Tris緩衝溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠(permount)封在載玻片上並在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖3(A)所示，培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基6天的臍帶間葉細胞表現NF，顯示其已轉型成神經細胞。
本實驗也測定以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理不同時間的臍帶間葉細胞表現NF的比例。如圖4所示，處理後第3天有59.4％的臍帶間葉細胞表現NF，處理後第6天NF的表現量達到最大，87.4％。處理時間延長NF表現量既不升高也不降低(n＝3，單因子變異數分析，續以LSD分析，P＜0.01)。
(II)NeuN的免疫染色以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶於0.1M PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(小鼠抗神經核單株IgG，1∶100稀釋，Chemicon MAB377)在4℃下反應至少36至42小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的山羊抗老鼠IgG，1∶250稀釋，Chemicon AP124B)在室溫下反應1小時；再以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml的50mM Tris緩衝溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上並在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖3(B)所示，培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基6天的臍帶間葉細胞表現NeuN，顯示其已轉型成神經細胞。
(III)GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法(a)細胞膜的製備細胞膜的製備是由以培養過神經細胞的FBS-DMEM處理不同時間的臍帶間葉細胞及七天齡大鼠的腦而得。以0.1M磷酸緩衝液清洗培養的細胞3分鐘二次。在4℃下添加Tris-HCl緩衝液(50mM，pH 7.4)至細胞，以刮刀將細胞從培養皿上刮除。將刮除的細胞置於一15ml的鐵氟龍-玻璃均質機中磨20次以使其均質化，接著在4℃下以30000g離心30分鐘。所得到的沉澱物大部分為細胞膜，再磨沉澱物並溶解於適量的Tris-HCl緩衝溶液中，儲存於-20℃冰箱中以備將來使用。
(b)蛋白質濃度的測定為了用於西方墨點法，由以上方法得到的樣品中的蛋白質以595nm吸光值測定蛋白質濃度，此蛋白質濃度的測定是依據Bradford法實施(MM.Bradford，1976，Analytical Biochemistry 72248-254)。
(c)電泳樣品中的蛋白質以20％SDS-PAGE分離。將凝膠中分離的蛋白質轉印至PVDF膜(NEW，NEF1002)以用於西方墨點法。
(d)西方墨點法以TBS溶液(0.9％NaCl溶於50mM Tris-HCl中，pH7.4)清洗含有蛋白質的PVDF膜30分鐘二次。以溶有5％脫脂奶粉的TBS緩衝液進行阻斷反應60分鐘。接著將PVDF膜浸泡於阻斷液(0.05％Triton-X100、5％正常山羊血清及3％BSA)60分鐘後，以TBS緩衝液清洗，再與初級抗體(兔子抗KA2多株IgG，1∶1800稀釋，UPSTATE06-315；山羊抗GluR5多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7617；山羊抗GluR6多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7618；山羊抗GluR7多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7620；及兔子抗谷胺酸去羧基多株IgG，1∶1500稀釋，Chemicon AB108)在4℃下反應12至18小時。
反應完成之後，以TTBS(0.05％Tween-20溶於TBS中)清洗PVDF膜30分鐘二次後，將此膜浸泡於阻斷液中60分鐘，再與二級抗體(抗Glu5/6/7的生物素-抗山羊/綿羊IgG，1∶200稀釋，Sigma B-3148；及抗KAR2/GAD的生物素-抗兔子IgG，1∶250稀釋，ChemiconAP187B)在室溫下反應1小時。以TTBS清洗反應過後的PVDF膜30分鐘二次，再與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，VectorlabsPK-4000)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次，再以DAB(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml的50mM Tris緩衝溶液中，pH7.4)顯影。
如圖5所示，臍帶間葉細胞在以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理前並無表現海人草酸(Kainate)受體次單元。以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理後第6天，海人草酸受體次單元，包括GluR6、GluR7及KA2，有少量地表現，處理後第12天，GluR5、GluR6、GluR7及KA2有顯著地表現。
(IV)Parvalbumin(PV)及Calbindin-D28K(CB)的免疫染色以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶於0.1M的PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(山羊抗parvalbumin的多株IgG，1∶40稀釋，Santa Cruz sc-7449及山羊抗calbindin多株IgG，1∶40稀釋，Santa Cruz sc-7691)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的小鼠抗山羊/綿羊單株IgG，1∶250稀釋，Sigma B3148)在室溫下反應1小時；再以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml的50mM Tris緩衝溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上並在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖6所示，培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基9天的臍帶間葉細胞表現parvalbumin(圖5A)及calbindin-D28K(圖5B)，顯示其已轉型成神經細胞並具有合成Ca2+結合蛋白的能力。
(V)GAD的免疫染色及西方墨點法以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶於0.1M的PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(兔子抗谷胺酸鹽去羧基 多株IgG，1∶1500稀釋，Chemicon AB108)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1MPBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的山羊抗兔子IgG，1∶300稀釋，Sigma b8895)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次。接著與親和素-生物素化-辣根過氧化酵素還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次，再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml50mM的Tris緩衝溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上並在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖7(A)所示，培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基6天後的臍帶間葉細胞表現GAD，顯示其已轉型成神經細胞並具有合成神經傳導物質GABA的能力。如圖7(B)所示，臍帶間葉細胞可在處理後第6天被誘導出表現GAD的能力，且在第12天GAD的表現量有顯著地增加。
(III)、(IV)及(V)的結果證明根據本發明的方法得到的神經細胞具功能性且可合成具有神經細胞特徵的蛋白質及神經傳導物質。
(VI)DAPI染色以0.1M磷酸緩衝液清洗處理後的細胞5分鐘二次，然後以50μg/ml的DAPI染色30分鐘。細胞以Tris緩衝液(Tris-HCl 50mM，pH 7.3)完全清洗並以包埋劑(Tris∶甘油＝1∶1)包埋，在螢光顯微鏡下觀察及計算細胞數目。
圖8(A)顯示細胞密度的顯微影像。利用DAPI標記(藍色)測定處理後第0、3、6及9天的細胞數目。圖8(B)顯示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理不同時間後的細胞密度。在不同的處理後時間點，利用DAPI染色測定細胞密度的改變。結果指出處理後第9天的細胞密度顯著高於第3天的細胞密度(n＝3，單因子變異數分析，續以LSD分析，P＜0.01)。
(VII)BrdU及DAPI的雙重染色給予生長在蓋玻片上的細胞最終濃度為50μM的BrdU(SigmaB5002，配製為50mM庫存溶液)，並使其繼續生長24小時。以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH 7.4)清洗細胞5分鐘二次；再以固定液(70％乙醇於50mM甘胺酸緩衝液中，pH 2.0)在-20℃下固定30分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞接著與初級抗體(小鼠抗BrdU單株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2及1mMβ-巰基乙醇於66mM的Tris緩衝液中1∶100稀釋)在4℃下反應至少36至42小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(螢光素共軛的山羊抗小鼠IgG，1∶50稀釋，Chemicon AP124F)及1mg/ml DAPI(Sigma D9542)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次。蓋玻片以包埋劑(Vector H-1000)固定於在載玻片上，以指甲油密封，在螢光顯微鏡(Olympus BX50)下觀察。並計算單位面積內被BrdU標記的細胞數目。
(VIII)BrdU及NF的雙重染色給予生長在蓋玻片上的細胞最終濃度為50μM的BrdU(SigmaB5002，配置為50mM庫存溶液)，並使其繼續生長超過24小時。以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PB，pH7.4)清洗細胞5分鐘二次；再以固定液(70％乙醇於50mM胺基乙酸緩衝液中，pH 2.0)在-20℃下固定30分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(小鼠抗BrdU單株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2、1mMβ-巰基乙醇於66mM的Tris緩衝溶液1∶100稀釋)在4℃下反應至少12至18小時後；再與另一初級抗體(兔子抗神經纖維多株IgG，1∶250稀釋，Chemicon AB1982)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(螢光素共軛的山羊抗老鼠IgG，1∶50稀釋，Chemicon AP124F及若丹明(Rhodamine)共軛的山羊抗兔子IgG，1∶50稀釋，ChemiconAP132R)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次。蓋玻片以包埋劑(Vector H-1000)固定於在載玻片上，以指甲油密封，在螢光顯微鏡(Olympus BX50)下觀察。並計算單位面積內被BrdU標記的細胞數目。
圖9顯示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理3天後的增殖分析結果(A-F)。大部分被DAPI標記的細胞(A中的藍色)為BrdU-陽性(B中的綠色)。(C)是結果(A)及(B)的合併。處理後第3天的細胞已分化成可表現NF的細胞(D中的紅色)，郄仍被BrdU標記(E中的綠色)。(F)是結果(D)及(E)的合併。以培養過神經細胞的FBS-DMEM處理後第9天的細胞失去增殖能力(G-L)。所有被DAPI標記的細胞(G中的藍色)為BrdU-陰性(H中的綠色)。(I)是結果(G)及(H)的合併。處理後第9天的細胞已分化成可表現NF的細胞(J中的紅色)，但大部分無法被BrdU標記(K中的綠色)。(L)是結果(J)及(K)的合併。總結來說，大部分的細胞在第9天已轉型成神經細胞並停止增殖，由此得知此神經細胞在第9天已進入後分裂階段。
(VII)及(VIII)的結果顯示，以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基培養的臍帶間質細胞可增殖並分化成神經細胞。
實施例5臍帶間葉細胞轉形成心肌細胞及心血管細胞將由實施例1得來的臍帶間葉細胞培養於添加有約4.5g/l的葡萄糖及約10％FBS的DMEM細胞生長培養基中，待細胞貼附於培養皿底部後，將細胞生長培養基置換成細胞分化培養基，其製備方法為將3μM的5-疊氮胞作為細胞分化因子添加於細胞生長培養基。或者，該細胞分化因子可直接加入培養物中。
臍帶間葉細胞在細胞分化培養基中培養24小時，然後將細胞分化培養基置換成細胞生長培養基以避免細胞長期曝露於5-疊氮胞 中造成的毒害。分化的細胞持續在細胞生長培養基中培養1-3周以確保細胞的存活及最佳的分化。培養基每三天更換為新鮮的培養基。
實施例6心臟分化的定性分析延續實施例5的步驟，將培養在蓋玻片上的細胞以固定劑(如多聚甲醛)固定以維持細胞在存活狀態。以等張生理食鹽水清洗固定在蓋玻片上的細胞，然後以含有細胞穿孔劑(如0.1％Triton X-100)的阻斷劑在室溫下處理15分鐘以阻斷細胞分化及使細胞穿孔。接著添加以1∶100稀釋的對心肌特殊C-肌鈣蛋白I表位及F-肌動蛋白絲有專一性辨認及結合的單株抗體(以肌鈣蛋白I-C親和性純化的山羊多株抗體，由SantaCruz Biotechnology公司提供；及F-肌動蛋白以FITC共軛的鬼筆環(Phalloidin)染色，由Molecular Probe公司提供)(初級抗體)至固定在蓋玻片上的已分化的細胞。培養1小時後，以生理食鹽水洗去任何初級抗體的非專一性結合。
接著，與螢光或任何可以光學設備(如相位差雷射掃描顯微鏡、螢光顯微鏡或光學顯微鏡)輕易檢測的可見染料共軛的二級抗體，羅丹明(Rhodamine)(TRITC)共軛的AffmiPure驢子抗山羊IgG(由Jackson免疫研究實驗室公司提供)，以1∶100稀釋加入與初級抗體的宿主種類結合。培養1小時後，以生理食鹽水洗去任何二級抗體的非專一性結合。接著，標記的細胞以封片劑固定在蓋玻片上，並以相位差雷射掃描顯微鏡觀察。
如圖10(A)及10(B)所示，該分化的細胞相較於未以分化因子處理的細胞，展現C-肌鈣蛋白I的顯著表現，顯示該臍帶間葉細胞已成功地分化成人類心肌細胞或心血管細胞。且該分化的細胞的F-肌動蛋白表現進一步確定該分化的細胞展現與心肌細胞或心血管細胞相似的特定細胞附著型式。
權利要求
1.一種產生體細胞的細胞系統，其特徵在於，該細胞系統包括臍帶間葉細胞。
2.根據權利要求1所述的細胞系統，其特徵在於，該臍帶間葉細胞是哺乳動物臍帶間葉細胞。
3.根據權利要求2所述的細胞系統，其特徵在於，該臍帶間葉細胞是人類臍帶間葉細胞。
4.根據權利要求1所述的細胞系統，其特徵在於，該體細胞是衍生自內胚層、中胚層或外胚層。
5.根據權利要求1所述的細胞系統，其特徵在於，該體細胞是神經細胞。
6.根據權利要求1所述的細胞系統，其特徵在於，該體細胞是心肌細胞。
7.根據權利要求1所述的細胞系統，其特徵在於，該體細胞是心血管細胞。
8.一種產生體細胞的方法，其特徵在於，該方法包括培養臍帶間葉細胞及誘導該培養的臍帶間葉細胞細胞分化的步驟。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，該臍帶間葉細胞是哺乳動物臍帶間葉細胞。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，該臍帶間葉細胞是人類臍帶間葉細胞。
11.據權利要求8所述的方法，其特徵在於，該體細胞是衍生自內胚層、中胚層或外胚層。
12.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，該臍帶間葉細胞是以β-巰基乙醇處理，以誘導分化成神經細胞。
13.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，該臍帶間葉細胞是培養於培養過神經細胞的10％ FBS-DMEM中，以誘導分化成神經細胞。
14.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，該臍帶間葉細胞是以5-疊氮胞處理，以誘導分化成心肌細胞。
15.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，該臍帶間葉細胞是以5-疊氮胞處理，以誘導分化成心血管細胞。
全文摘要
本發明提供產生體細胞的細胞系統。特別地，本發明的細胞系統包括臍帶間葉細胞，另一方面，本發明提供產生體細胞的方法，其包括培養臍帶間葉細胞及誘導培養的臍帶間葉細胞細胞分化的步驟。在一具體實施例中，此培養的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由外胚層衍生的細胞。在另一具體實施例中，此培養的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由中胚層衍生的細胞。在更另一具體實施例中，此培養的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由內胚層衍生的細胞。
文檔編號C12N5/074GK1548531SQ20031012335
公開日2004年11月24日 申請日期2003年12月15日 優先權日2002年12月13日
發明者傅毓秀, 王懷詩 申請人:傅毓秀, 王懷詩