軍曹魚MHC-Ⅱα基因序列的製作方法

2024-04-07 20:31:05

專利名稱：軍曹魚MHC-Ⅱα基因序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種蛋白編碼序列，尤其是涉及一種軍曹魚MHC-II α基因序列。
背景技術：
MHC(major histocompatibility complex)即主要組織相容性複合體，是指染色 體上由一系列緊密連鎖的基因位點所組成的具有高度多態性的複合遺傳系統或區域。是由 MHC編碼的一類細胞表面轉膜蛋白，能結合併呈遞內源抗原和外源抗原給T淋巴細胞。根 據化學結構和功能的不同，MHC可分為MHCI類分子和MHCII類分子。其中，II類MHC分子 呈遞的抗原多是細胞外源性多肽，它在內質網內由α、β和輔助分子Y鏈組裝成完整三聚 體，蛋白酶水解Y鏈，抗原多肽與II類MHC分子結合，形成穩定的II類MHC-多肽複合體， 再運至細胞表面，外源性抗原在線粒體或溶酶體中與MHCII類分子結合後呈遞給協助T淋 巴細胞(Th，CD4+)，從而觸發免疫反應。魚類MHCII類分子是由a鏈和β鏈以非共價鍵的 形式組成一個異二聚體。MHC廣泛參與免疫應答的誘導與調節，激發機體特異性免疫反應，在免疫學上具有 極為重要的意義。由於MHC具有多態性、與疾病的相關性以及連鎖不平衡性的特點，因此， 了解魚類MHC基因的結構與功能，尋找與疾病相關聯的易感基因或疾病抵抗基因，對預防 疾病具有很高的價值。此外，由於MHC的高度多態性，故可用於種群遺傳學研究，並作為種 群分子進化的標記之一。再者，MHC具有的多態性、與疾病的關聯及其連鎖不平衡等特點可 以用來選育抗病品系。

發明內容
本發明的目的是提供一種軍曹魚MHC-II α基因序列。本發明通過以近源物種MHC-II α基因的⑶S序列的保守區設計的兼併引物，並用 PCR法擴增，結合RACE技術克隆到軍曹魚MHC-II α鏈基因的全表達序列；通過對MHC-II α 基因設計有效地鑑定引物，從而可以通過螢光定量PCR來分析該基因的組織分布情況，並 對經LPS刺激後的脾臟中的MHCII α的表達量進行了分析。具體DNA核苷酸及相應的氨基 酸序列如下agtcgactctaagattcacagacgctcagctcagtgacctgctgctgacgaagatgatga 60XMM 2tcaagctgctcctcttcctcccctgtctcatctctgtctctgctgaaagtctccatgtgg 120Leader pept i deX α domainIKLLLFLPCPISVSAESLHV 22accttgctatcactggctgttcagactctgatggagaggatatgtactctctggatggag 180DLAITGCSDSDGEDMYSLDG 42aagagatgtggtttgcagacttcgtcaatcaaaggggagtggagcctcagcccagcttcg 240
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圖1是本發明在軍曹魚正常組織中的分布；圖2是本發明經LPS刺激後軍曹魚脾臟組織中的MHC-II α基因隨時間的表達變化圖。
具體實施例方式1.總RNA的提取取健康的軍曹魚(體重約IOOOg)在養殖桶中養殖3日後，腹腔注射Iml的鯊魚弧菌(JT2)。刺激192h後，解剖魚體取出脾臟約250mg，放入-80°C冰箱備用。取備用組織約 IOOmg用剪刀剪碎加入Iml的Trizol (美國invitrogen公司)進行勻漿，按照試劑盒說明 提取總RNA。2. cDNA第一鏈的合成取軍曹魚總RNA5yg與反轉錄引物(oligodT接頭引物)1 μ 1 (lOpmol/L)混合， 65°C加熱5min後，立即放置冰上靜置2min，然後加入5Xbuffer，IOmmol/LdNTP混合液， Ribonuclease Inhibitor，M-MLV 反轉錄酶，反應體系為 20 μ 1。反應程序為 37°C、60min， 最後放入-80°C保存備用。3.引物設計依據，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、鼠、虹鱒等)MHCII-α同源基因⑶S序列，利用 Clustal W軟體進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計兼併引物(J2AF、J2AR)， 擴增片段大小約為324bp。引物設計後提交英駿生物工程技術服務有限公司進行DNA合成。4.對軍曹魚MHC-II α基因cDNA全序列的克隆以近源物種MHC-II α基因⑶S序列的保守區設計的兼併引物(J2AF、J2AR)，擴增 片段大小約為324bp。以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼併引物進行PCR擴增，所擴增的PCR產 物用的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然後將純化的PCR產物 克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌TOP 10感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。 經簡併引物PCR檢測後，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。根據已得到的cDNA片段序列設計特異性引物(RCMC32A0UT、RCMC32AIN、 RCMC52A0UT、RCMC52AIN)，利用 cDNA 末端快速擴增技術(Rapid Amplificationof cDNA ends, RACE)對目的基因的3 『和5 『末端進行PCR擴增。在3' RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側引物RCMC32A0UT 和3』接頭引物SMART 3a進行PCR反應，所得產物利用內側特異性引物RCMC32AIN和3』接 頭引物SMART 3a再進行PCR擴增。在5' RACE中，利用末端轉移酶和dCTP在cDNA末端加上poly (C)尾後，以加尾後 的cDNA作為模板，利用外側特異性引物RCMC52A0UT和OligodG進行第一次PCR擴增，所得 PCR產物再利用內側引物RCMC52AIN和OligodG進行第二次PCR擴增。所得到的PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測後，將PCR產物純化 後，克隆到PMD-18T載體中，轉化大腸桿菌TOP 10感受態細胞，挑取陽性克隆，用M13弓丨物 對質粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼併引物擴增所得的序列利用DNAStar軟體進行 拼接。5.對軍曹魚MHC-II α基因的測定所得到的PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測後，將PCR產物純化 後，克隆到PMD-18T載體中，轉化大腸桿菌Τ0Ρ10感受態細胞，挑取陽性克隆。測序結果用 BLAST軟體進行同源性測定，來確定為軍曹魚MHC-II α基因同源序列。6、MHC-II α基因在不同組織中的RT-PCR分析取健康的軍曹魚(185g)心臟、脾臟、鰓、頭腎、肌肉、心、腸和腦等組織，以反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板，應用Real-time PCR檢測方法對軍曹魚的MHC-II α基因組織表達特點進行了研究(β-ActinF，β -ActinR, J2AF，J2AR)。如圖1所示，MHC-II α基因 在正常軍曹魚組織中均有所表達，其中較強的表達於頭腎中，中等程度表達於鰓、脾、腦，在 心、腸、肌肉中表達較弱。7、RT-PCR 檢測 MHC-II α mRNA 的表達情況提取經LPS刺激的不同時間點的脾臟組織RNA，以反轉錄合成的第一鏈cDNA為模 板，應用Real-time PCR檢測LPS刺激後的脾臟中表達調控規律(β-ActinF，β -ActinR, J2AF，J2AR)。利用2_δ Δετ法計算相對表達量，如圖2所示，經LPS刺激後MHC-II α基因表 達呈現下降的趨勢，相對於對照組都具有顯著性差異。本發明使用的引物見下表
引物名稱Prime 核酸序列(5' -3' )Nucleotide sequence應用範圍
RCMC2AFTCCTCCTTCCACGCTCAT兼併引物
RCMC2ARAACACCGCAGGTCCGATA兼併引物
oligo-dT 接頭引物 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN反轉錄
SMART 3aCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT3' RACE
RCMC32AOUTCAACAACGCATGACCAGGATCT3， RACE
RCMC32AINATCGGACCTGCGGTGTTC3' RACE
Olido-dGGGGGGGGGGGGGGGG(A/T/C)5， RACE
RCMC52AOUTAfiGTCCGATACTGGGCTGC5' RACE
RCMC52AINATGATGAGCGTGGAAGGAGG5' RACE
β -ActinFTGAGACCACCTACAACAGCRT-PCR 內參
β -ActinRCTGCATCCTGTCAGCGATRT-PCR 內參
J2AFTCGGTCTGACGGTCGGTTRT-PCR
J2ARTCTCTGAAGCAGGTGAAGCC_RT-PCR_
權利要求
一種軍曹魚MHC-IIα基因序列鏈基因序列，其特徵在於它的DNA核苷酸及相應的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
全文摘要
本發明公開了一種軍曹魚MHC-IIα基因序列，它的DNA核苷酸及相應的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所述。本基因的獲得不僅為研究魚類MHC-IIα類分子的作用機理以及MHC-IIα基因多態性與魚體抗病力的關係奠定基礎，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫抗體成為現實。
文檔編號C12N15/12GK101812458SQ201010109630
公開日2010年8月25日 申請日期2010年2月5日 優先權日2010年2月5日
發明者侯月娥, 馮娟, 徐力文, 王江勇, 蘇友祿, 茅莉娜, 郭志勳 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所