TALEs雙識別檢測方法及其應用的製作方法
2024-01-28 20:25:15 2
TALEs雙識別檢測方法及其應用的製作方法
【專利摘要】TALEs雙識別檢測方法，步驟如下：步驟一：TALEs原核蛋白表達質粒的構建；步驟二：原核表達TALEs蛋白；步驟三：TALEs蛋白包被在微孔板上步驟，加入DNA樣品，DNA被包被在微孔板上的TALEs蛋白包捕獲；步驟四：用標記有鹼性磷酸酶的TALEs蛋白識別被捕獲的DNA，加入鹼性磷酸酶的底物，產生化學發光信號，並判讀信號。本發明利用TALEs蛋白特異性識別DNA序列的特性，然後通過化學發光放大信號，靈敏度比較高，可以用於快速診斷。本發明與傳統檢測手段有很大的不同，沒有中間的PCR擴展步驟，檢測靈敏度比較高，假陽性率比較低。該方法不僅可以用於科研的基因突變檢測等，也可以用做臨床診斷。
【專利說明】TALEs雙識別檢測方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於分子生物學領域，具體涉及一種TALEs雙識別檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002] TALE (Transcription Activator Like Effectors)是一類 DNA 結合蛋白。它 的DNA結合結構域是由可變數量的重複單元組成，天然TALEs主要由位於N端的轉運信號 (translocation signal)、位於C端的核定位信號（nuclear localization signals, NLS) 和轉錄激活結構域（transcriptional activation domain, AD)以及位於中間的DNA結合 結構域三部分組成。DNA結合結構域由包含33~35 (通常為34)個胺基酸殘基的重複單元 串聯而成，介導DNA特異識別與結合。每個重複單元序列高度保守，主要區別在於第12和 第13位的重複可變雙殘基（repeat variant di-residue, RVD)。研究發現每個重複單元 的RVD決定了其所識別的核苷酸，且其識別遵循一個簡單法則：NI=A，HD=C，NG=T，NN=G or A。TALEs理論上可以識別任何DNA序列。
[0003] 目前還沒有用TALES蛋白用於基因的診斷，本發明TALES雙識別檢測技術，用它做 突變檢測。該方法不僅可以用於科研的檢測，也可以用於臨床診斷。
【發明內容】
[0004] 解決的技術問題： 本發明的目的在於克服現有技術的不足而開發的一種TALEs雙識別檢測方法，該方法 可檢測出不同的基因，點突變等，可用於分子診斷、基因表達的研究，本發明檢測靈敏度比 較高，假陽性率比較低。
[0005] 技術方案： 本發明利用TALEs識別DNA的特性，表達特異識別DNA序列的TALEs蛋白，然後把識別 不同DNA序列的蛋白做包被在微孔板上。再然後加入DNA樣品與包被在微孔板上的TALEs 蛋白結合，接著再加入偶聯有鹼性磷酸酶的TALEs蛋白，該蛋白特異識別DNA序列，最後加 入鹼性磷酸酶的底物，化學發光檢測。從而檢測出不同的基因，點突變等。
[0006] TALEs雙識別檢測方法，步驟如下： 步驟一 =TALEs原核蛋白表達質粒的構建：用NdeI和BamHI切pET-16b載體，然後把 TALEs序列克隆到pET-16b載體的NdeI和BamH位點，得pET-16b-TALEs原核表達載體； 步驟二：原核表達TALEs蛋白：將步驟一製備的pET-16b-TALEs原核表達載體轉化到 大腸桿菌BL21中，IPTG誘導，收集細菌並裂解細胞，離心取上清液，進行Ni柱親和層析，待 目的蛋白與Ni柱結合之後，用漂洗液洗滌，後用洗脫緩衝液衝洗，將洗脫組分中的高鹽緩 衝液置換成PBS溶液，最後進行SDS-PAGE的檢測，所得即為純化的TALEs蛋白。
[0007] 步驟三：TALEs蛋白定向高密度包被在微孔板上。加入提取的DNA樣品，DNA被 包被在微孔板上的TALEs蛋白包捕獲。
[0008] 步驟四：用偶聯有鹼性磷酸酶的TALEs蛋白識別被捕獲的DNA，加入鹼性磷酸酶的 底物，產生化學發光信號，並判讀信號。
[0009] 所述的TALEs雙識別檢測方法在基因診斷中的應用。
[0010] 有益效果 本發明打破基因晶片的核酸結合核酸，蛋白晶片中蛋白識別蛋白的特性，以蛋白特異 性識別DNA，穩定，而且靈敏度比較高，可以用於快速診斷。與現有技術相比，本發明的優點 是可以高通量檢測不同的基因和多個突變位點，該方法不僅可以用於科研的檢測，也可以 用做臨床診斷。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1為用化學發光法檢測的信號結果圖，結果如圖1所示，TALES檢測EGFR基因 T790M位點的檢測結果。
【具體實施方式】
[0012] 下面通過【具體實施方式】結合附圖對本發明作進一步詳細說明。但本領域技術人員 將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明 具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。 所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0013] 實施例1 1、材料：pET-16b購於Novagen、大腸桿菌BL21購於Takara,標記有鹼性磷酸酶的 TALEs蛋白由北京博奧森生物技術有限公司標記。
[0014] 2、方法 步驟一 =TALEs原核蛋白表達質粒的構建：用NdeI和BamHI切PET-16b載體，然後把 TALEs序列克隆到pET-16b載體的NdeI和BamH位點，得pET-16b-TALEs原核表達載體； 步驟二：原核表達TALEs蛋白：將步驟一製備的pET-16b-TALEs原核表達載體轉化到 大腸桿菌BL21，IPTG誘導，收集細菌並裂解細胞（50mM NaH2P04，pH 8. 0,300mM NaCl，10mM 咪唑)，離心取上清液，進行Ni柱親和層析，待目的蛋白與Ni柱結合之後，先用漂洗液（50mM NaH2PO 4, pH 8. 0,300mM NaCI，20mM 咪唑）洗滌，之後用洗脫緩衝液（50mM NaH2PO4, pH8.0， 300mM NaCI，250mM咪唑）衝洗，將洗脫組分中的高鹽緩衝液（50mM NaH2PO4, pH8.0,300mM NaCI，250mM咪唑）置換成PBS溶液，最後進行SDS-PAGE的檢測，所得即為純化的TALEs蛋 白； 步驟三=TALEs蛋白定向包被在微孔板上，加入DNA樣品，DNA被包被在微孔板上的 TALEs蛋白包捕獲； 步驟四：用標記有鹼性磷酸酶的TALEs蛋白識別被捕獲的DNA，加入鹼性磷酸酶的底 物，產生化學發光信號，並判讀信號。
[0015] 實施例2 檢測人類表皮生長因子受體（EGFR)基因20號外顯子的T790M的突變 1.選擇識別野生型 1790 序列的 TALEs 探針：TALEs-T790(CGACATCACGCAGCTC)(SEQ ID NO. 1)，識別 790M 的序列的 TALEs 探針：TALEs-790M (CGACATCATGCAGCTC) (SEQ ID NO. 2)， 識別陰性對照序列的TALEs探針：TALEs-control(CGACATCTCGTAGCTC)(SEQIDN(λ3)並構 建原核表達的重組質粒 pET-16b-TALEs-T790 (CGACATCACGCAGCTC)，pET-16b-TALEs-790M E(CGACATCATGCAGCTC)和 pET-16b-TALEs-control (CGACATCTCGTAGCTC)。這三個載體轉化 大腸桿菌E. coli BL21:轉化菌在5ml氨苄抗性的培養基中培養過夜，次日轉移入500ml 相同的培養基中培養，經IPTG16°C過夜誘導，收集所得到的TALEs-790M，TALEs-790M和 TALEs-control蛋白菌體，經過高壓破碎後離心獲得可溶性的蛋白，進行Ni柱親和層析。待 目的蛋白與Ni柱結合之後，先用漂洗液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，5%(v/v)甘油， 60mM 咪唑，ρΗ8·0 )洗滌，之後用洗脫緩衝液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5% (v/v)甘 油，500mM咪唑，pH8.0 )洗脫掉蛋白。利用ro-10脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩衝液置 換成含有20% (體積百分比）甘油的PBS溶液，之後進行SDS-PAGE的檢測，所得即為純化 的 TALEs-T790, TALES-790M 和 TALEs-control 蛋白。
[0016] 2. TALES-T790包被在微孔板上。用標記有親和素的TALES-T790蛋白和帶有鏈黴 素的9孔板結合，TALES-T790蛋白就包被在微孔板上。
[0017] 3.加入提取好的DNA樣品進行雜交捕獲，去掉非特異結合的DNA。然後把偶聯有鹼 性磷酸酶的TALES-790M蛋白加入到ICl，IC2孔中，把偶聯有鹼性磷酸酶的TALEs-control 蛋白加入到其他孔中，最後加入鹼性磷酸酶的底物，產生化學發光信號，並判讀信號。
[0018] 表1序列
【權利要求】
1. TALEs雙識別檢測方法，其特徵在於，步驟如下： 步驟一 ：TALEs原核蛋白表達質粒的構建：用Ndel和BamHI切pET-16b載體，然後把 TALEs序列克隆到pET-16b載體的Ndel和BamH位點，得pET-16b-TALEs原核表達載體； 步驟二：原核表達TALEs蛋白：將步驟一製備的pET-16b-TALEs原核表達載體轉化到 大腸桿菌BL21中，IPTG誘導，收集細菌並裂解細胞，離心取上清液，進行Ni柱親和層析，待 目的蛋白與Ni柱結合之後，用漂洗液洗滌，後用洗脫緩衝液衝洗，將洗脫組分中的高鹽緩 衝液置換成PBS溶液，最後進行SDS-PAGE的檢測，所得即為純化的TALEs蛋白； 步驟三：將TALEs蛋白定向包被在微孔板上，加入DNA樣品，DNA被包被在微孔板上的 TALEs蛋白包捕獲； 步驟四：用標記有鹼性磷酸酶的TALEs蛋白識別被捕獲的DNA，加入鹼性磷酸酶的底 物，產生化學發光信號，並判讀信號。
2. 權利要求1所述的TALEs雙識別檢測方法在基因診斷中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498594SQ201410726245
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月4日 優先權日:2014年12月4日
【發明者】李雲英 申請人:李雲英