一種培育蠟質減少的轉基因植物的方法
2024-01-19 12:27:15 6
專利名稱：一種培育蠟質減少的轉基因植物的方法
技術領域：
本發明涉及一種培育蠟質減少的轉基因植物的方法。
背景技術：
植物表皮蠟質是覆蓋在植物表面最外層，不溶解於水而溶解於有機溶劑(氯仿等)的一類混合物的總稱，它們是由表皮細胞所合成和分泌，一般認為表皮蠟質具有阻止植物組織內水分的非氣孔性散失、維持植物表面清潔與植物表面防水、防止植物被有害光線損傷、保護植物避免被病菌侵害和防止某些昆蟲的蠶食等功能。此外，表皮蠟質的含量通常會影響表皮結構的變化，而表皮結構的變化通常會影響表皮對水分子的吸附和滲透，例如，表皮蠟質的含量會影響水稻葉片GUS染色的效果，疏水性的表皮蠟質含量越高，GUS染色液就越難被葉表皮吸附和滲透，水稻葉片GUS染色的效果就越差，導致只有葉片的切口邊緣很小一部分區域能被染色，其他大部分區域很難被染色。而蠟質含量越少，就越有利於 ⑶S染色液的吸附和滲透，⑶S染色的效果就越好。同時對一些作物的研究結果表明，作物表皮蠟質與作物水分利用效率、產量、收穫指數和角質蒸騰等都有較好的相關性，有蠟質表型的材料其抗旱節水性和產量都要高於無蠟質表型的材料。水稻是世界三大糧食作物之一，但水稻生產需要大量的水，乾旱已成為缺水地區水稻生產最大的限制性因子，因此耐旱相關基因的挖掘和抗旱品種培育，是目前穩定糧食生產的最有效途徑。目前，利用正向遺傳學和反向遺傳學的方法，人們已經從許多物種中克隆出了蠟質相關基因並進行了相關的功能分析。根據這些基因的功能可將它們分為以下幾類蠟質合成基因，蠟質轉運基因，蠟質調控基因等。雖然這方面的研究取得了不少進展，但目前與耐旱性狀相關的水稻葉片蠟質缺失突變體卻鮮有報導，因此利用水稻葉片蠟質缺失突變體克隆與葉片蠟質形成相關的基因，並分析其功能，進一步了解水稻葉表皮蠟質與耐旱性之間的相關性，具有重要的理論意義和實際意義。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種與蠟質形成相關的RNA分子。本發明所提供的RNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。表達上述RNA分子的重組幹擾載體也屬於本發明的保護範圍。上述重組幹擾載體按照包括如下步驟的方法得到將SEQ ID NO 3所示DNA片段插入出發載體的多克隆位點，得到所述重組幹擾載體。上述重組幹擾載體中，所述出發載體為pCaml30X ；所述pCaml30X按照包括如下步驟的方法製備得到將CaMV35S啟動子片段插入載體pCAMBIA1300的I3St I和Hind III的識別位點間，得到的重組載體記作pCaml30XM ；將 Nos終止子片段插入載體pCaml30XM的EcoR I和Mc I識別位點間，得到的重組載體即為 pCaml30Xo本發明的另一個目的是提供一種培育蠟質減少的轉基因植物的方法。
本發明所提供的培育蠟質減少的轉基因植物的方法，包括如下步驟使出發植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質減少的轉基因植物。上述方法中，所述使出發植物中的SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的功能喪失的方法為抑制出發植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達。上述方法中，所述抑制出發植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達的方法包括如下步驟向所述出發植物中導入上述任一所述重組幹擾載體。上述方法中，所述蠟質為植物表皮蠟質；所述植物表皮蠟質可為植物葉片表面蠟質；上述方法中，所述植物為單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。上述方法中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在調節植物中蠟質形成中的應用也屬於本發明的保護範圍。SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在培育耐旱植物中的應用也屬於本發明的保護範圍。上述應用中，所述蠟質為植物表皮蠟質；所述植物表皮蠟質可為植物葉片表面蠟質；上述應用中，所述植物為單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。上述應用中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明基因影響葉片蠟質形成，是一個控制葉片蠟質形成的基因，具體是對葉片蠟質形成起正調控作用。本發明基因對了解水稻葉片蠟質形成的機制具有重要的應用價值，可以探索將其用於水稻育種，通過基因工程手段改良水稻葉表皮性狀從而提高抗旱能力。此外，本發明的基因和蛋白控制表皮蠟質的含量，表皮蠟質的含量會影響水稻葉片GUS 染色的效果，降低表皮蠟質的含量可以增強水稻葉片GUS染色的效果，因此可利用該基因來培育檢測外源基因在葉片表達情況的轉基因實驗材料。
圖1為野生型與突變體osgll植株和葉片表型。圖2為野生型3037和突變體osgll的表型。圖3為野生型3037與突變體osgll的葉表皮屬性分析。圖4為乾旱對野生型3037與突變體osgll的影響。圖5為互補表達載體的構建。圖6為野生型與pGLlRNAi轉基因植株及其葉片表型。圖7為野生型日本晴(WT)和轉pGLlRNAi植株OsGLl基因表達量。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、基因的發現1、水稻蠟質缺失突變體osgll的表型分析水稻蠟質缺失突變體osgll是野生型3037的自然突變體。在正常情況下，突變體 osgll與野生型3037相比沒有明顯差異(圖1A)，但在在下雨天或者人工淋浴的情況下，突變體osgll的葉片表現出高度親水的表型。在野生型3037中，由於葉表皮蠟質的大量存在，水分子往往會在葉表面聚合形成球形狀的水珠，只要稍微抖動一下葉片，都會導致葉片上這些水珠的滴落。而在突變體osgll中，由於葉片高度親水，水分子將會均勻散布在整個葉表面而不形成水珠(圖1B)。圖1中，左為野生型，右為突變體。2、突變體osgll的電鏡觀察分析通過掃描電鏡觀察發現，與野生型3037相比(圖2A，B)，突變體osgll葉表皮近軸端與遠軸端的蠟質嚴重減少(圖2D，E)，而透射電鏡的研究結果表明，野生型3037表皮膜可分為兩層結構，最外層為透明層，最內層為非透明層(圖2C)，與野生型3037相比，突變體 osgll葉表皮膜變薄，最外層的透明層消失，只含有最內層的非透明層(圖2F)。圖2中，A 為野生型3037的遠軸端葉片表面；B為為野生型3037的近軸端葉片表面；C為野生型3037 的表皮膜結構；D為突變體osgll的遠軸端葉片表面；E為為突變體osgll的近軸端葉片表面；F為突變體osgll的表皮膜結構。P 乳突細胞；CW 細胞壁；TL :透明層；OL 非透明層。3、水稻蠟質缺失突變體osgll葉表皮屬性的分析葉表皮屬性分析的檢測包括葉綠體滲透實驗和葉片的水分散失實驗，對於葉綠體滲透實驗，主要在暗室中進行，我們以抽穗期每個水稻分櫱的倒三葉為研究對象，將葉片切割成3釐米長並侵泡在濃度為80%的30毫升乙醇中，在1-12小時內，每隔1小時測定葉綠素的含量，每個時間點的葉綠素滲透率，以該時間點滲透出來的葉綠素含量佔第12個小時滲透出來的葉綠素含量的百分比表示。對於水分散失實驗，也是在暗室中進行，也是以抽穗期每個水稻分櫱的倒三葉為研究對象，在O小時，0. 5小時，1小時，1. 5小時，2小時，3小時， 4小時，5小時，6小時，7小時，8小時這11個時間點分別測定樣品的重量，每個時間點的水分散失率，以該時間點損失的水分重量佔最初樣品重量的百分比表示。水稻蠟質缺失突變體osgll與野生型3037的葉綠體滲透率、水分散失率的測定結果如圖3所示，表明蠟質缺失突變體osgll與野生型3037相比，葉綠體滲透型降低，而水分散失率增加。圖3中，A為野生型3037與突變體osgll的葉綠體滲透實驗；B為野生型3037與突變體osgll的水分散失實驗。每個樣品重複三次。W:野生型3037 ;M:突變體osgll。4、水稻蠟質缺失突變體osgll的乾旱實驗分析將野生型3037和突變體osgll種在同一個盆裡，在正常情況下生長6周後，停止給他們澆水，乾旱持續12天後再給他們澆水，觀察他們表型的變化。結果表明，野生型3037 的大部分葉片能夠恢復正常，而突變體osgll只有少部分葉片能夠恢復正常(圖4)，這表明突變體osgll對於乾旱更敏感。圖4中，A為乾旱實驗開始之前的野生型3037(左)與突變體osgll(右)；B為乾旱實驗結束後的野生型3037(左)與突變體osgll(右)。5、水稻蠟質缺失突變體osgll的遺傳分析水稻蠟質缺失突變體osgll和粳型野生型材料中花11，二品種雜交得Fl代，Fl代自交產生F2代，對F2代植株進行表型鑑定，中花11和osgll分別作為正、負對照，F2代植株的表型鑑定結果如表1所示，表明水稻蠟質缺失這一性狀符合單基因控制遺傳規律。表1中，正常株數是指具有中花11表型的株數，蠟質缺失osgll株數是指具有osgll表型的株數。表1水稻蠟質缺失突變體osgll的遺傳分析
權利要求
1.一種RNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
2.表達權利要求1所述RNA分子的重組幹擾載體。
3.根據權利要求2所述的重組幹擾載體，其特徵在於所述重組幹擾載體按照包括如下步驟的方法得到將SEQ ID NO :3所示DNA片段插入出發載體的多克隆位點，得到所述重組幹擾載體。
4.根據權利要求2或3所述的重組幹擾載體，其特徵在於所述出發載體為pCaml30X；所述pCaml30X按照包括如下步驟的方法製備得到將CaMV35S啟動子片段插入載體pCAMBIA1300的I3St I和Hind III的識別位點間，得到的重組載體記作pCaml30XM ；將 Nos終止子片段插入載體pCaml30XM的EcoR I和Mc I識別位點間，得到的重組載體即為 pCaml30Xo
5.一種培育蠟質減少的轉基因植物的方法，包括如下步驟使出發植物中的SEQID NO 1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質減少的轉基因植物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述使出發植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失的方法為抑制出發植物中的SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因表達；所述抑制出發植物中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因表達的方法包括如下步驟 向所述出發植物中導入權利要求2-4中任一所述重組幹擾載體。
7.SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在調節植物中蠟質形成中的應用；SEQ ID NO :1所示蛋白或SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在培育耐旱植物中的應用。
8.根據權利要求5-7中任一所述的方法或應用，其特徵在於所述蠟質為植物表皮蠟質；所述植物為單子葉植物。
9.根據權利要求5-8中任一所述的方法或應用，其特徵在於所述植物表皮蠟質為植物葉片表面蠟質；所述單子葉植物為水稻。
10.根據權利要求5-9中任一所述的方法或應用，其特徵在於所述SEQID N0:1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
全文摘要
本發明公開了一種培育蠟質減少的轉基因植物的方法。該培育蠟質減少的轉基因植物的方法，包括如下步驟使出發植物中的SEQ ID NO1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到蠟質減少的轉基因植物。本發明基因影響葉片蠟質形成，是一個控制葉片蠟質形成的基因，具體是對葉片蠟質形成起正調控作用。本發明基因對了解水稻葉片蠟質形成的機制具有重要的應用價值，可以探索將其用於水稻育種，通過基因工程手段改良水稻葉表皮性狀從而提高抗旱能力。此外，本發明的基因和蛋白控制表皮蠟質的含量，表皮蠟質的含量會影響水稻葉片GUS染色的效果，降低表皮蠟質的含量可以增強水稻葉片GUS染色的效果，因此可利用該基因來培育檢測外源基因在葉片表達情況的轉基因實驗材料。
文檔編號C12N15/63GK102168083SQ20101061060
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者唐丁, 李明, 王克劍, 程祝寬, 覃寶祥 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所