一種Lasiodiplodiairanensis菌及其發酵產茉莉酸的方法與流程

2024-02-26 07:08:15

本發明涉及一種lasiodiplodiairanensis菌及其發酵產茉莉酸的方法，屬於生物
技術領域：
。
背景技術：
：茉莉酸化學名稱3-氧-2-2′-順-戊烯基-環戊烷-1-乙酸，分子式c12h18o3，分子量210.27。是一種新型的植物激素，在植物的花、莖、葉、根等組織與器官中普遍存在，在植物的生長發育過程中發揮著重要的作用。同時作為第二信號，在植物受到生物與非生物的傷害時誘導激活植物體內的防禦基因，抵禦外界的傷害。並且因茉莉酸及其甲酯具有清淡、幽雅的香味，所以其可作為很多香花精油主香的成分，廣泛的應用於香料業的產生中。在農業生產中，茉莉酸類物質能明顯的促進不育植株開花還可以用來提高植物的抗旱性，同時茉莉酸類物質可以誘導植物產生有毒物質、害蟲蛋白酶抑制劑等來達到抗蟲害的效果，在農業生產中可以用其來代替部分殺蟲劑。目前茉莉酸的製備方法主要有三種，從植物中提取、化學合成及微生物發酵法。植物中茉莉酸含量在1-9～10-6g/g，因此，從植物中提取的量少，滿足不了當前的需求。化學法根據起始原料不同，分為順-4-庚烯酸為起始原料、乙酸乙酯為起起始原料、及2-環戊烯-1-乙二醇縮酮和2-甲基-1,3-丁二烯為起始原料的方法，但這些方法的反應收率不高(30％以下)，反應條件苛刻，並且合成的茉莉酸都是外消旋物，限制了其使用的範圍。微生物發酵法是通過真菌發酵生產茉莉酸。aldridge等最早從真菌可可毛色二孢lasiodiplodiatheobroma培養液中分離出遊離的茉莉酸(j.chemsocchemcoummum.1971,13:1623),這說明某些微生物具有分泌茉莉酸的可能。美國專利us20020110881a1公開了棉色二孢(diplodiagossypina)發酵產茉莉酸、茉莉酸甲酯及茉莉酸異構體的方法，其中，d.gossypinaatcc10936產茉莉酸濃度可達1.2g/l。國內，韓曉敏等為檢測可可毛色二孢菌對白木香產生倍半萜的誘導作用，採用氣質聯用在其pda培養液中檢測到茉莉酸類化合物(中國中醫藥雜誌，2014，39(2)：192-196)，但其中茉莉酸甲酯含量不高(250mg/l)，同時沒有進行相關發酵生產方面的研究。技術實現要素：本發明要解決的第一個技術問題是提供一株lasiodiplodiairanensisdwh-2，可以產生茉莉酸。本發明對變質果蔬及玉蕊、拉貢木、海桑、水黃皮、玉米、棉花等植物的腐爛部位上的微生物進行分離，篩選得到分泌茉莉酸的菌株dwh-2，經分子鑑定屬於一株l.iranensis菌，其產量明顯高於一般野生菌株，通過優化培養基和培養條件進一步提高了產物濃度。所述l.iranensisdwh-2已於2017年5月27日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2017288。所述dwh-2的活化培養，可將菌株接於pda平板上，放置在25～28℃的培養箱中活化4～5天。所述dwh-2在pda平板上，菌落生長初期為白色，且日生長量較快，生長到第四天時平板背面開始出現綠色，生長到第六天時培養基開始變成黑色，生長到第九天時培養基完全變成黑色。在電鏡下觀察，發現該菌的菌絲體有橫隔，且為多核。所述dwh-2的its基因序列與多株l.iranensis的its基因序列相似性達99％～100％，但這些l.iranensis都沒有關於產茉莉酸的報導。本發明要解決的第二個技術問題是提供一種應用所述l.iranensisdwh-2發酵產茉莉酸的方法。應用所述l.iranensisdwh-2發酵產茉莉酸，是在靜止培養狀態下進行。包括在20～30℃，靜止發酵培養6～10天。用於所述l.iranensisdwh-2發酵產茉莉酸的發酵培養基的碳源包括蔗糖、澱粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖中的一種或幾種的混合。碳源濃度為25～500g/l。用於所述l.iranensisdwh-2發酵產茉莉酸的發酵培養基的無機氮源包括硝酸鈉、尿素、硝酸銨中的一種或幾種的混合。無機氮源濃度為3～15g/l。用於所述l.iranensisdwh-2發酵產茉莉酸的發酵培養基的有機氮源包括牛肉膏、蛋白腖、玉米漿、酵母膏、麥芽提取物中的一種或幾種的混合。有機氮源濃度為3～15g/l。在本發明的一種實施方式中，用於所述l.iranensisdwh-2發酵產茉莉酸的發酵培養基是蔗糖25～500g/l，硝酸鈉1～15g/l，磷酸二氫鉀0.5～3g/l，氯化鉀0.1～0.4g/l，七水硫酸鎂1～9g/l，七水硫酸鐵0.1～0.9g/l，玉米漿1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8；所述微量元素：七水硫酸鐵0.01～0.04g/l，七水硫酸錳0.001～0.004g/l，七水硫酸銅0.001～0.004g/l，二水合鉬酸鈉0.001～0.004g/l。在應用l.iranensisdwh-2發酵產茉莉酸的過程中，還可以向發酵體系中添加大孔樹脂。大孔樹脂的型號包括xad-1、xad-2、xad-7hp、ab-8、d101。用量為5～20g/100ml。應用本發明提供的l.iranensisdwh-2發酵產茉莉酸，茉莉酸的產量可達到1760mg/l。生物材料保藏lasiodiplodiairanensisdwh-2，已於2017年5月27日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2017288，保藏地址為中國.武漢.武漢大學。附圖說明圖1tlc產物初步鑑定圖圖2產物鑑定gc-ms圖圖3菌株dwh-2的進化樹具體實施方式產物分析方法：採用薄層層析(tlc)對產物進行初步定性。參照文獻方法，所用的薄層板為gf254，展開劑為：正己烷：乙酸乙酯：醋酸＝60：40：1，顯色劑為濃硫酸：甲醇＝1：1用氣質聯用(gc-ms)對產物進行進一步的鑑定。參照文獻方法。氣質條件：氣相色譜柱ab--5ms30m×0.25mm×0.25μm，載氣為氦氣，壓力為130kg/cm2，分表壓力為0.31kg/cm2，流速0.8ml/min。色譜柱採用程序升溫，從起始溫度50℃以20℃/min升至180℃後保持4min，再以10℃/min升至290℃後保持15min，250℃進樣，不分流，進樣體積1μl。用hplc(高效液相色譜)對產物的濃度進行檢測，參照文獻方法。流動相為甲醇：水：磷酸＝55:44.9：0.1；進樣量10～30ul；流速1ml/min；檢測器為紫外檢測器。實施例1產茉莉酸菌株的篩選與確定發酵培養基：蔗糖25～500g/l，硝酸鈉1～15g/l，磷酸二氫鉀0.5～3g/l，氯化鉀0.1～0.4g/l，七水硫酸鎂1～9g/l，七水硫酸鐵0.1～0.9g/l，玉米漿1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8。所述微量元素：七水硫酸鐵0.01～0.04g/l，七水硫酸錳0.001～0.004g/l，七水硫酸銅0.001～0.004g/l，二水合鉬酸鈉0.001～0.004g/l。以腐爛的水果及玉蕊、拉貢木、海桑、水黃皮、玉米、棉花等植物的腐爛部位為篩菌材料，將其處理好稀釋塗布在pda平板，25℃～30℃培養4～7天。用打孔器將長出的菌接於500ml裝有發酵培養基的三角瓶中，靜止放置在20～30℃的培養箱中發酵6～10天。發酵結束後將發酵液離心後取上清液，用6mol/l的鹽酸將其ph調至3～4左右，再用0.5～5倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取，萃取結束後用真空旋轉蒸發儀將乙酸乙酯蒸除，產物溶於甲醇中。用tlc(薄層層析)進行初步的定性檢測，將有紅色斑點出現的發酵液(圖1)進行hplc進一步的檢測，觀察是否有與標樣出峰時間相同的峰出現。與標樣出峰時間相同的樣品用gc-ms(氣質聯用)進行鑑定，並用hplc(高效液相色譜)進行產物的濃度測定，gc-ms圖見附圖2。經篩選，獲得一株可以產茉莉酸的菌株dwh-2，產茉莉酸的濃度達到320mg/l發酵液。將dwh-2在pda平板上培養後進行its測序，測得its基因序列(seqidno:1)與lasiodiplodiairanensis的its基因序列相似性達100％。dwh-2在pda平板上，菌落生長初期為白色，且日生長量較快，生長到第四天時平板背面開始出現綠色，生長到第六天時培養基開始變成黑色，生長到第九天時培養基完全變成黑色。在電鏡下觀察，發現該菌的菌絲體有橫隔，且為多核。因此，經形態學與分子生物學鑑定，dwh-2為lasiodiplodiairanensis。實施例2培養方式對菌株產茉莉酸的影響發酵培養基：蔗糖25～500g/l，硝酸鈉1～15g/l，磷酸二氫鉀0.5～3g/l，氯化鉀0.1～0.4g/l，七水硫酸鎂1～9g/l，七水硫酸鐵0.1～0.9g/l，玉米漿1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8。微量元素：七水硫酸鐵0.01～0.04g/l，七水硫酸錳0.001～0.004g/l，七水硫酸銅0.001～0.004g/l，二水合鉬酸鈉0.001～0.004g/l。用打孔器將長出的菌接於500ml裝有發酵培養基的三角瓶中，於25～3℃的培養箱中發酵培養6～10天，在培養的過程中設置三種不同的培養方式，靜止培養、往復式搖床培養及旋轉式搖床培養。發酵上清液用hplc測產物的濃度，結果如表1。表1培養方式對菌株產茉莉酸的影響培養方式產物濃度(mg/l)靜置培養342往復式搖床56旋轉式搖床62實施例3不同碳源對菌株產茉莉酸的影響按實施例2的方法對dwh-2進行靜止培養，其中發酵培養基的碳源(50g/l)分別為蔗糖、乳糖、澱粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖，在培養箱中25～30℃靜止培養6～10天，發酵上清液用hplc測產物的濃度，結果如表2。表2不同碳源對菌株產茉莉酸的影響碳源產物濃度(mg/l)蔗糖314乳糖31澱粉140麥芽糖258葡萄糖199果糖102實施例4碳源不同濃度對菌株產茉莉酸的影響同實施例2方法，其中發酵培養基以蔗糖為唯一碳源，且設置蔗糖的濃度分別為25g/l、50g/l、75g/l、100g/l、125g/l、150g/l，300g/l，500g/l在培養箱中25～30℃靜止培養6～10天。hplc測發酵液中的產物的濃度，結果如表3。表3碳源不同濃度對產茉莉酸的影響蔗糖濃度(g/l)產物濃度(mg/l)253105051775267100238125177150185300189500201實施例5無機氮源對菌株產茉莉酸的影響按實施例2的方法，其中，發酵培養基以蔗糖為唯一碳源，無機氮源分別為硝酸鈉、尿素、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨，在培養箱中25～30℃靜止培養6～10天。hplc測產物的濃度如表4。表4無機氮源對產茉莉酸的影響無機氮源產物濃度(mg/l)硝酸鈉224尿素116硝酸銨3.6氯化銨0.503硫酸銨0.45實施例6無機氮濃度對菌株產茉莉酸的影響按實施例2的方法，其中發酵培養基以蔗糖為唯一碳源，無機氮源為硝酸鈉，設置硝酸鈉的濃度為3g/l、4.5g/l、6g/l、7.5g/l、9g/l、10.5g/l，15g/l在培養箱中25～30℃靜止培養6～10天。hplc測產物的濃度如表5。表5無機氮濃度對產茉莉酸的影響硝酸鈉濃度(g/l)產物濃度(mg/l)37934.580567097.5447.49660.410.5399.515380.9實施例7有機氮源對菌株產茉莉酸的影響按實施例2的方法，其中發酵培養基以蔗糖為唯一碳源，無機氮源為硝酸鈉，有機氮源為牛肉膏、蛋白腖、玉米漿、酵母膏、麥芽提取物，在培養箱中25～30℃靜止培養6～10天。hplc測產物的濃度如表6。表6有機氮源種類對菌株產茉莉酸的影響有機氮種類產物濃度(mg/l)牛肉膏849蛋白腖475玉米漿850酵母膏702麥芽提取物294實施例8大孔樹脂對對菌株產茉莉酸的影響按實施例2的方法，在接種後培養第3-5天時，向培養基中加入滅過菌的xad-1、xad-2、xad-7hp、ab-8、d101，5～20％(w/v)，吸附部分產物，避免當培養液中產物濃度達到一定後，不再增加反而會分解。發酵結束後，分離樹脂和上清液，用乙酸乙酯洗脫，用真空旋轉蒸發儀蒸除乙酸乙酯。hplc測產物的濃度如表7。表7大孔樹脂對菌株產茉莉酸的影響樹脂類型產物濃度(mg/l)xad-11210xad-21760xad-7hp1527ab-81760d1011720雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。sequencelisting江南大學一種lasiodiplodiairanensis菌及其發酵產茉莉酸的方法1patentinversion3.31519dnalasiodiplodiairanensis1cctgcggaaggatcattaccgagttttcgggcttcggctcgactctcccaccctttgtga60acgtacctctgttgctttggcggctccggccgccaaaggacctccaaactccagtcagta120aacgcagacgtctgataaacaagttaataaactaaaactttcaacaacggatctcttggt180tctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagt240gaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccttggtattccggggggcatgcctgtt300cgagcgtcattacaaccctcaagctctgcttggaattgggcaccgtcctcactgcggacg360cgcctcaaagacctcggcggtggctgttcagccctcaagcgtagtagaatacacctcgct420ttggagtggttggcgtcgcccgccggacgaaccttctgaacttttctcaaggttgacctc480ggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaa519當前第1頁12