新的抗凝血多肽及複合物的製作方法

2023-10-26 22:35:22 2

專利名稱：：新的抗凝血多肽及複合物的製作方法
技術領域：
：本發明屬於蛇毒領域，本發明提供了兩種新的蛇多肽及其編碼核酸。本發明也提供了各種基於該新蛇多肽的發現及其抑制血凝能力的應用、方法和組合物。
背景技術：
：血液凝固，是一種由一系列的擴增反應導致的對血管損傷的自然反應，其中血漿中絲氨酸蛋白酶循環的特異性酶原被限制性蛋白水解酶而持續活化，導致形成血栓，從而防止失血("3)。這是透過外在途逕啟動的(4)。由於血管損傷而暴露的膜結合組織因子(TF)，與預存在血漿"6)中的Vila因子(FVIIa)(佔VII因子總量的1%-2%)互相作用，並形成了外源性的tenase複合物。這種複合物將X因子(FX)激活為Xa因子(FXa)。在與其輔助因子Va結合後，FXa將凝血酶原溶蛋白性裂解為凝血酶。凝血酶將纖維蛋白原裂解為纖維蛋白，促進一種纖維蛋白凝塊的形成，並激活血小板包容在該凝塊中。TF-FVIIa複合物也可以激活IX因子(FIX),IXa因子(FIXa),從而有利於在凝血級聯中通過內在途徑傳播。凝血級聯受到嚴格控制。調控中的任何失衡可能導致不能凝血，血造成外傷性失血過多致死或有害血塊的形成，由於血管阻塞造成死亡和虛弱，所述的血管阻塞是指心肌梗塞、中風、肺栓塞或靜脈血栓(7)。因此，人們迫切需要預防和治療血栓疾病。抗凝血藥是預防和治療血栓栓塞性疾病的關鍵。約0.7%的西方人接受口服抗凝血藥治療(8)。香豆素，肝素是最知名的臨床使用的抗凝劑。香豆素抑制所有維生素K依賴蛋白的活性，包括前凝血劑(凝血酶，FXa,FIXa和FVIIa)及抗凝血藥(活化蛋白C(APC)和蛋白S),而肝素通過抗凝血酶m增強對凝血酶和FXa的抑制(9.1G)。這些抗凝劑作用的非特異性方式，決定了他們在形成血栓與止血之間的治療上的局限性(11'。因此，有必要開發新的在凝血過程中針對特定的凝血酶或某一特定步驟的抗凝血藥(12'13)。基於其在血液中相對較低的濃度(10nM)和在啟動凝血級聯中起關鍵作用(14)，FVII/FVIIa可能是一個誘人的開發新型和特異性抗凝血劑的藥靶。蛇毒中的蛋白質或毒素已用於設計和開發一些治療藥物或前導分子，尤其用於心血管疾病(15)。舉例來說，一個血管緊張素轉化酶抑制劑家族就是基於源自南美蛇毒液肽的緩激肽而開發的(16)。血小板聚集抑制劑，如替非巴肽和替羅非班，基於單鏈蛇毒多肽而設計的。所述的單鏈蛇毒多肽是一個發現在viperid和crotalid蛇毒中的血小板聚集抑制劑的大家族(17'22)。從馬來亞坑蝰蛇蛇毒提取的蝮蛇抗栓酶(ancrod)降低血纖維蛋白原水平，並已在各種缺血包括中風(23)的情況中進行了成功的試驗。
發明內容此處所述的是一種調節眼鏡蛇//emacAa,i^Aaemac/wrt^(非洲環頸血腹蛇)毒液抗凝血活性的三指毒素(hemextinA)的純化和鑑定。當hemextinA和另一種三指毒素(hemextinB)相互作用形成複合物hemextinAB時，其抗凝血活性得到了增強。發明人表明了兩種蛋白的複合物的形成可能對抗凝血活性很重要。這是第一種由三指毒素構成的四聚體。發明人通過用分割法抑制外源性tenase活性和研究它們對重構的外源性tenase複合物的影響表明hemextinA及其協同複合物延長了凝血時間.進一步地，發明人通過研究hemextinAB複合物和hemextinA對12種絲氨酸蛋白酶的作用證實hemextinAB複合物和hemextinA抑制作用的特異性。hemextinAB複合物是第一個被報導不需要介質介導其抑制活性的天然FVIIa抑制劑。hemextinAB複合物和FVIIa/TF-FVIIa的分子間相互作用為尋找抑制血液凝固啟動的抗凝劑提供了一個新的示例。hemextinAB複合物形成過程中的分子間相互作用也可以用生物物理技術來解釋。基於這些研究結果，這種獨特的抗凝劑複合物模型將在下面描述。在本發明的第一個方面，提供了一種包含SEQIDNO.l或SEQIDN0.3所示胺基酸序列的多肽，或其變體、突變體或片段。在本發明的第二個方面，提供了一種包含SEQIDN0.2，4或5所示胺基酸序列的多肽，或其變體、突變體或片段。在本發明的第三個方面，提供了一種核酸分子，其(i)編碼本發明第一或第二個方面所述的多肽；或(ii)與(i)的核酸分子雜交，或其變體、突變體，片段或補體。在本發明的第四個方面，提供了含有本發明第三個方面所述核酸分子的載體。在本發明的第五個方面，提供了用本發明第四個方面的載體轉化的宿主細胞。在本發明的第六個方面，提供了一種製備本發明第一或第二個方面所述多肽的方法，該方法包括在適合所述多肽表達的條件下培養本發明第五個方面所述的宿主細胞。在本發明的第七個方面，提供了一種製備本發明第一或第二個方面所述多肽的方法，該方法包括上述多肽的化學合成。在本發明的第八個方面，本發明提供了一種製備包含第一個方面和第個二個方面所述多肽的複合物的方法，其中該方法包括在適宜複合物物形成的條件下將本發明第一個方面的多肽和第二的個方面所述多肽進行接觸。在本發明的第九個方面，本發明提供了一種複合物，其包含(i)本發明第一個方面所述的多肽；和(ii)本發明第二個方面所述的多肽。在本發明的第十個方面，提供了一種產生抗體的方法，該抗體能夠識別本發明第一或第二個方面的多肽，或者能夠識別本發明第九個方面所述的複合物，其中該方法包括下列步驟(i)用本發明第一或第二個方面的多肽或第九個方面所述的複合物免疫動物；(ii)由所述動物獲得抗體。在本發明的第十一個方面，提供了能夠識別本發明第一或第二個方面所述多肽或本發明第九個方面所述複合物的抗體。在本發明的第十二個方面，提供了一種製備抗本發明第一個方面或第二個方面所述的多肽或本發明第九個方面所述複合物的抗蛇毒血清的方法，其中該方法包括用本發明第一個方面或第二個方面所述的多肽或第九個方面所述的複合物免疫動物；然後由所述用於製備抗蛇毒血清的動物收集抗體。在本發明的第十三個方面，提供了有效抗本發明第一或第二個方面所述多肽或第九個方面所述複合物的抗蛇毒血清。在本發明的第十四個方面，提供了識別本發明第一或第二個方面所述多肽或第九個方面所述複合物的調節劑的方法。其中該方法包括下列步驟(i)將待測化合物與本發明第一或第二個方面所述的多肽或第九個方面所述的合成物接觸；以及(ii)檢測待測化合物是否與所述多肽或所述複合物結合。在本發明的第十五個方面，提供了一種藥物組合物，該組合物包含本發明第一或第二個方面的多肽，第三個方面的核酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞，第九個方面的複合物，第十一個方面的抗體，第十三個方面的抗蛇毒血清，或第十四個方面的方法所識別的調節劑。在本發明的第十六個方面，提供了第一或第二個方面所述的多肽，第三個方面的核酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞，第九個方面的複合物，第十一個方面的抗體，第十三個方面的抗蛇毒血清，或第十四個方面的方法所識別的調節劑在藥物中的應用。在本發明的第十七個方面，提供了一種用於藥物的聯合製劑，該聯合製劑包含(i)本發明第一個方面所述的多肽，或者編碼相同多肽的核酸分子；和(ii)本發明第二個方面所述的多肽，或者編碼相同多肽的核酸分子。在本發明的第十八個方面，提供了第一或第二個方面所述的多肽，第三個方面的核酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞，第九個方面的複合物在製備用於治療需抗凝血治療病人的藥物中的應用。在本發明的第十九個方面，提供了下列物質在製備用於治療需抗凝血治療病人的聯合製劑中的的應用(i)本發明第一個方面所述的多肽或編碼相同多肽的核酸分子；和(ii)本發明第二個方面所述的多肽或編碼相同多肽的核酸分子。在本發明的第二十個方面，提供了治療需抗凝血治療病人的方法，該方法包括對病人施用第一個方面或第二個方面的多肽，第三個方面的核苷酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞，第九個方面的複合物，第十五個方面的藥物組合物。在本發明的第二十一個方面，提供了一種治療需抗凝血治療病人的方法，該方法包括給病人施用下述物質(i)本發明第一個方面所述的多肽，或編碼該多肽的核酸分子;和(ii)本發明第二個方面所述的多肽，或編碼該多肽的核酸分子。在本發明的第二十二個方面，提供了治療被蛇咬傷的病人的方法，該方法包括對病人施用第一個方面或第二個方面的多肽，第三個方面的核苷酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞，第九個方面的複合物，第十五個方面的藥物組合物。在本發明的第二十三個方面，本發明提供了第一個方面或第二個方面的多肽，第三個方面的核苷酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞，第九個方面的合成物，第十五個方面的藥物組合物在製備用於治療被蛇咬傷病人的藥物中的應用。附圖簡要說明圖l:粗毒液的抗凝血活性。粗毒液對復鉤時間(A)和凝血酶原時間(B)的影響。注意毒液在兩種檢測中都顯示出強抗凝血活性。各數據點代表平均值士標準差。圖2:hemextinA和B的純化。(A)唾蛇(R/w^wac/^ws)粗蛇毒通過Superdex30柱進行的分子排阻色譜。內附，峰2和峰3的抗凝血活性。(B)峰3在UnoS6柱上的陽離子交換色譜。包含hemextinA(C)和B(D)的級分通過JupiterCI8半製備柱的RP-HPLC圖譜。(E)和(F)分別是hemextinA和B的微柱液相色譜圖譜。通過ESI-MS測定hemextinA和B的均質性和質量。hemextinA(G)和B(H)的重構質譜。圖3:hemextinA和B的N-端序列。通過Edman降解測定hemextinA和B起始的37個N端殘基。三指毒素家族的保守半胱氨酸殘基用黑底標註。進一步的蛋白測序結果顯示於圖13中。圖4:hemextinA區和B區對凝血酶原時間的影響。(A)hemextinA區和B區對凝血酶原時間的影響。注當hemextinB存在時，hemextinA的抗凝能力增加。各數據點代表平均值土標準差。(B)通過對凝血說明書第7/76頁酶原時間的影響解釋了hemextinsA和B之間形成了複合物。各數據點代表平均值±標準差。圖5:對形成的hemextinAB複合物進行的凝膠過濾研究。hemextin複合物的洗脫時間減至一40分鐘，單hemextin的洗脫時間為一70分鐘。圖6:活性步驟的定位。(A)圖示顯示了凝血酶原、stypven和凝血酶外源性凝血途徑的選擇性激活的凝固時間的測定。hemextinA(B)，hemextinB(C)和hemextinAB複合物(D)對凝血酶原時間(△)的影響；stypven時間(*)和凝血酶時間(躍)凝血檢測(具體參見下文)的影響。各數據點代表平均值士標準差。圖7:TF-FV活性的抑制。(A)hemextinA，hemextinB和hemextinAB複合物(■)對FVIIa-TF抑制的抑制效力。(B)通過對TF-FV酶活性的影響解釋了hemextinsA和B之間形成了複合物。圖8:磷脂對hemextinsA和B及hemextinAB複合物抑制活性的影響。hemextinA(攀)，hemextinB(▲)和hemextinAB複合物(聽)抑制(A)FVIIa及(B)FVIIa-sTF氨基分解活性的效力。注缺乏磷脂不影響蛋白和重組複合物的抑制效力。圖9:絲氨酸蛋白酶特異性。hemextinA，hemextinB和hemextinAB複合物對(A)FIXa，(B)FXa，(C)FXIa，(D)FXIIa，(E)血漿激肽釋放酶，(F)凝血酶，(G)胰蛋白酶，(H)糜蛋白酶，(I)尿激酶(J)血漿酶和(K)APC及(L)tPA的氨基分解活性的影響。除了在纖溶酶和糜蛋白酶實驗中用抑肽酶，(園)在所有實驗中用苯甲脒作為陽性對照，。通過與空白(口)相比來測定蛋白質和重組複合物的抑制效力，空白為含有用測定緩衝液替代蛋白的的測定混合物。注hemextinA和hemextin複合物均抑制血漿激肽釋放酶的氨基分解活性，但hemextinB不抑制。圖10:血漿激肽釋放酶氨基分解活性的抑制。hemextinA(*)，hemextinB(▲)和hemextinAB複合物(■)抑制血漿激肽釋放酶氨基分解活性的的效力。注抑制的IC5o為5pm。圖11:抑制特性。(A)為存在50nM(□)(2kj)，25nM(o)(kj),12.5nM(■)(1/2kj)的重組hemextinAB複合物的條件下，FVIIa-sTF動力學活性的雙倒數(Lineweaver-Burk)作圖。表示不存在hemextinAB的情況下，FVIIa-sTF的動力學活性。Vm肌隨抑制劑濃度的增加而減小，而Km保持不變(詳見表2),這是非竟爭抑制劑中可觀察到的典型現象。(B)為描述抑制Kj的次要曲線。圖中的箭頭表示Kj為25nM。圖12:hemextinAB複合物和FVIIa間形成複合物的ITC研究。(A)微卡/時間圖示中的原始數據表示向1.4毫升的含10FVIIa的細胞中注射0.2mM的重組hemextinAB複合物後的熱量釋放；(B)原始數據的積分表示熱/mol與摩爾的比。K的最適參數為4.11><105]/["，A/的為7.931kcal.M"，AS的為1.25cal.M"。圖13:hemextinB和A的序列信息以及hemextinB和A的序列比較。圖14:與hemextin複合物形成有關的構象變化。圖中顯示了不同蛋白質濃度的(A)hemextinA和(B)hemextinB的CD譜。取決於較高濃度聚集的構象變化用箭頭標註。(C)為hemextinA隨著hemextinB濃度的增加而引起的構象變化。(D)為hemextinA隨hemextinB濃度的增加在217nm處的CD變化。hemextinA與hemextinB的比達到1:1(C和D)後進一步增加hemextinA，CD譜沒有顯著的變化。圖15:用GEMMA測定hemextin抗體複合物形成過程中的分子直徑。單一hemextin和hemextin複合物的分子直徑是基於其電泳遷移率來計算的。hemextin複合物的形成導致分子直徑增加。另外在驗證所得的數據後，hemextinA和hemextinB的分子直徑並沒有隨著加入等摩爾毒素C而有任何顯著的增加。圖16:利用DLS測量鈴動力直徑。(A)對50mMTris-HCl緩衝液中的hemextinA，hemextinB和hemextin複合物進行CONTIN分析。不同濃度的氯化鈉(B)和甘油(C)對hemextin複合物的影響。計算的每一分子類型的鈴動力直徑顯示在圖中。圖17:利用ITC研究hemextinA和B間的相互作用。(A)為向1.4毫升的含O.lmMhemextinA的細胞中注射1M的hemextinB後的熱量釋放的原始itc數據。的最適參數為1.04，&的最適參數為2.33x106m"，Af/的為-11.68kcal.M"。圖18:hemextinA-hemextinB相互作用的熱力學。(A)溫度對hemextinA-hemextinB相互作用的能量的影響熱焓變化(Z/f)，(■)熵範圍變化(rAS")和(▲)自由能變化(Z\G)。(B)顯示了文獻(O)(數據來自Ye和Wu(68),McNemar等人(69)和引用的Stites的綜述(7))中描述的不同蛋白-蛋白間相互作用以及hemextinA-hemextinB間相互作用的焓熵補償。圖19:不同的緩衝液條件下hemextinAB複合物的形成。(A)放/ff論^/^me勸'"S^合參效潛^^^。所有實驗均在pH值7.4的條件下進行。用於緩衝液的離子化焓的變化對磷酸鹽而言為0.71kcal/mol,MOPS為5.27kcal/mol,Tris(Ref)為11.3kcal/mol。(B)&//菱#放漆f遂f遊乾錄絲。親和力隨著緩衝離子強度的增加而下降。(c)《。^伊/滋闢欽慮絲。親和力隨著甘油濃度的增加而減少表明了疏水相互作用的重要性。圖20:不同緩衝液條件下hemextin複合物的SEC研究。(A)hemextin複合物在Tris-hc1緩衝液的洗脫分布。(B)各種離子強度的Tris-HCl緩衝液(用不同濃度的氯化鈉)。(C)含有不同濃度甘油的Tris-HCl緩衝液。隨著鹽或甘油的增加，該四聚體複合物分解為二聚體和單體(分別以峰4，2和1表示)。*(d)使用以下蛋白作為分子量標記物對柱進行校準-(A)卵類粘蛋白(28KD),(B)核糖核酸酶(15.6KD)，(C)細胞色素C(12KD)，(D)apoprotinin(7KD)和(E)pelovaterin(4KD)。由校正曲線計算得到四聚體、二聚體和單體的分子量。圖21:緩衝液條件對抗凝血活性的影響。(A)緩衝離子強度和(B)甘油對抗凝血活性的影響。HemextinAB複合物的抗凝血活性隨緩衝液離子強度的增加而增加，也隨著甘油濃度的增加而增加。箭頭表示抗凝複合物主要為二聚體和單聚體混合物時，(A)鹽和(B)甘油的濃度。圖22:—維力NMR研究。不同緩衝液條件下，(a)hemextinA和(B)hemextinB的譜。氯化鈉存在時，hemextinA的卩-摺疊結構完全不受影響。圖23:hemextin複合物的建議模型。(A)為描述hemextinAB複合物形成的圖示。兩個結構相似的三指毒素，hemextinsA和B，以1:1的化學計量形成一個緊湊、剛性四聚體的複合物。(B)顯示鹽和甘油對hemextinsA和B構象的影響的圖示。鹽存在時，hemextinA經歷了構象變化。(C)為鹽和甘油存在下，四聚體hemextinAB複合物的分解。分解可能產生兩種不同的位面。因此，高鹽中的hemextinAB二聚體，不同於存在甘油時形成的二聚體。虛線表示兩個假定的抗凝位點(詳見附圖)。發明詳述本發明在第一個方面提供了一種含有SEQIDNO.l或SEQIDN0.3所示胺基酸序列的多肽，或其變體、突變體或片段。在一個實施方案中，該多肽包含SEQIDNO.l所示的胺基酸序列。在另一實施方案中，該多肽包含SEQIDNO.3所示的胺基酸序列。下面所要描述的，也包含本發明第一個方面所述多肽的功能性等價物。正如此處所描述的，HemextinA自身也表現出抗凝血活性。相應地，本發明第一個方面所述的多肽也表現出抗凝血活性。在一個實施方案中，多肽可獲自//./^emac/wrtw(非洲環頸血腹蛇)的毒液。圖13中所示的SEQIDNO.l是HemextinA序列，即LKCKNKLVPFLSKTCPEGKNLCYKMTMLKMPKIPIKRGCTDACPKSSLLVKWCCNKDKCNSEQIDN0.3是圖3中第一行的序列，即LKCKNKLVPFLSKT..CPEGKN..LCYKMT.LKKVTPKIKRGSEQIDNO.3表示HemextinA的N末端部分測序的結果。HemextinA的進一步測序產生SEQIDNO丄中的序列。本發明第二個方面提供了一種含有SEQIDN0.2,4或5所示胺基酸序列的多肽，或其變體、突變體或片段。在一個實施方案中，該多肽含有SEQIDN0.2所'示的胺基酸序列。在另一個實施方案中，帶多肽含有SEQIDN0.4所示的胺基酸序列。在另一實施方案中，帶多肽含有SEQIDNO.5所示的胺基酸序列。下面所描述的，也包括本發明第二個方面所述多肽的功能性等價物。圖13中所示的SEQIDN0.2是HemextinB，即LKCKNKWPFLKCKNKWPFLCYKMTLKKVPKIPIKRGCTDACPKSSLLVNVMCCKTDKCNSEQIDN0.4是圖3中第二行所示的序列，即LKCKNKWPFL.KT..CKNKWPFLCYKMT丄KKVTPKIKRGSEQIDNO.4表示HemextinB的N末端的起始序列。圖13中所示的SEQIDN0.5是HemextinB序列，儘管沒有最後四個胺基酸，即LKCKNKVVPFLKCKNKVVPFLCYKMTLKKVPKIPIKRGCTDACPKSSLLVNVMCCKT人們確信在SEQIDNO.2的C末端部分(尤其是最後四個胺基酸)可能存在變化。相應地，在一個實施方案中，提供了一種在C端不同於本發明第二個方面所示SEQIDN0.2序列的多肽。更具體地，本發明提供了一種在SEQIDN0.2最後四個胺基酸(例如C末端的第一個或第一、第二、第三和/或第四個中的一或多個胺基酸(即DKCN))中的至少一個(例如l、2、3或4個)不同於SEQIDN0.2所示序列的。因此，在本發明第二個方面的一個實施方案中，提供了一種含有SEQIDN0.5的多肽。由於SEQIDN0.5.被認為是HemextinB的不完全序列，因此在一個實施方案中提供了一種包含SEQIDNO.5和在位於SEQIDN0.5胺基酸序列C末端一個或多個(例如1、2、3、4、5、6個等)附加胺基酸的多肽。在一個實施方案中，本發明第二個方面所述的多肽可獲自//./wemac/w^s(非洲環頸血腹蛇)的毒液。本發明第二個方面的多肽能夠與本發明第一個方面的多肽形成一種複合物，從而使得對本發明第一個方面所述多肽的抗凝活性產生了協同作用。本發明第一和第二個方面所述的多肽不是必須獲自蛇毒，而是可以以任何形式產生，包括例如重組技術和化學合成例如固相肽合成。在另一個實施方案中，提供了一種本發明第一或第二個方面所述的蛋白質，該蛋白質是從//.kzemac/^ft^蛇毒中純化得到的。純化的方法是本領域中公知的且其可用於純化本發明第一或第二個方面所述的多肽。多肽的純化可以通過實施方案中描述的方法獲得。因此，在一個實施方案中，第一和第二個方面所述的多肽由實施例部分描述的方法獲得或可獲得。本發明第一和第二個方面所述的多肽，可以是從天然環境中分離出來的，其自然發生的形式，或是被修飾的。但是它們或者單獨保留(例如本發明第一個方面的多肽的情況)，或者以複合物的形式保留其所表現出的抗凝血活性。例如，用化學方法引入一或多個對胺基酸結構的化學修飾來對所述的多肽進行修飾。關於蛋白質和胺基酸序列的測定和鑑定，本領域所屬技術人員能夠理解多肽的部分胺基酸序列是已知的，寡核苷酸探針可以被設計用來探測//./wew^/^m^基因組或cDNA文庫，因此就能夠確定和證實目的多肽或基因序列。由於基因編碼是隨機的，因此大量的多核苷酸序列能夠編碼相同的肽序列。為確保實際的核苷酸序列存在於探針寡核苷酸中，該寡核苷酸被合成摻入，當需要時使用多個核苷酸。設計、製備和使用退化探針的方法是本領域公已知的。參見Narang，SA(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等(1981)RecombinantDNA，Proc3rdClevelandSympos.Macromolecules,ed.AGWalton,Amsterdam:Elsevierpp273-289;Itakura等.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等.(1984)Science198:1056;Dee等.(1983)A^wc/^c11:477。使用退化探針來解釋基因序列和編碼的多肽也是本領域公知的，並且本領域普通技術人員很容易能夠完成。本發明第一和第二個方面所述的多肽可以彼此形成複合物，因此，就會對本發明第一個方面所述的多肽的抗凝血活性產生協同作用。相應地，在本發明的第一和第二個方面的實施方案中提供了一個包含本發明第一個方面和第二個方面的多肽的複合物。如下面所討論的，該複合物被認為是一個四聚體。在一個實施方案中，該複合物是一個異質二聚體(heteodimer)。這樣的複合物可用於本發明的各個方面，例如用在治療病人所需的抗凝療法個方面。本發明第一個方面所述的多肽，其分子量被測定為約6835.00±50，20,10，15,10,5,2，1或0.52道爾頓。本發明第一個方面所述的多肽，其分子量被測定為約6835.50±50,20，10，15,10,5,2，1或0.52道爾頓。本發明第二個方面所述的多肽，其分子量被測定為約6791.38±50，20,10,15，10，5，2，1或0.32道爾頓。本發明第二個方面所述的多肽，其分子量被測定為約6792.56±50,20，10,15，10，5，2,1或0.32。本發明實施例部分所用的方法可以是，例如，用來測定分子量。其它本領域公知的方法也可以替換使用。術語"多肽"和"蛋白質"可以互換使用，且是指任何肽鍵或修飾的肽鍵連接的胺基酸聚合物(二肽或更多)。本發明所述的多肽也可以包含非肽組分，例如碳氫基團。碳氫和非肽取代基可被合成多肽的細胞加到多肽上，其根據細胞類型的不同而有所差異。多肽在此處是以胺基酸骨架結構所確定的；取代基例如碳氫基團一般不是特異性的，但是仍然可被表達。術語"包含，，及其語法變體是指"包括"。例如，一個組合物"包含"x可以僅僅由x組成，或者包括一個或多個附加組分。類似地，一個包含特定序列的多肽可以僅僅由特定的序列組成，也可以包括一個或多個其他的組分。例如，本發明的多肽可以由一個或多個附加在其N端或c端的胺基酸序列組成。本發明第一和第二個方面所述的多肽包括所引證的序列的變體。因此各種變異的胺基酸可以包括，例如，為進一步研究HemextinA或HeniextinB的結果所鑑別的等位變體或變異序列。也包括功能性等價物、活性片段和融合蛋白。為避免疑問，本發明的第一和第二個方面包括變體的功能性等價物或變體的活性片段。所包含的融合蛋白包含變體、功能性等價物和活性片段。類似地，本發明擴展到功能性等價物的變體和活性片段。本發明第一和第二個方面所述的多肽可以分別以一個具有第二個方面多肽或第一個方面多肽的複合物的形式提供。本發明第一個方面的多肽可以是hemextinA,hemextinA的變體、突變體、功能性等價物、活性片段，或者包含hemextinA的融合蛋白。本發明第二個方面的多肽可以是hemextinB,hemextinB的變體、突變體、功能性等價物、活性片段，或者包含hemextinB的融合蛋白。因此，各種hemextinA和hemextinB的混合物、變體、突變體、功能性等價物、活性片段以及hemextinA和hemextinB的融合蛋白的各種組合被想像假定產生的複合物具有抗凝血活性。在一個實施方案中，如果一個多肽或多肽複合物增加凝血酶原時間或抑制了外源性tenase活性，那麼該多肽或多肽複合物就被認為具有抗凝血活性。為測定多肽或多肽複合物是否具有抗凝血活性，可以按照下面實施例部分描述的方式實施凝血酶原試驗。簡要地，凝血酶原時間可以根據Quick(參見QuickAJ.(1935)JMol.Chem.109,73-74)方法測量。100plof50mM的Tris-HCl緩衝液(pH7.4)，100|il血漿和50pl研究的蛋白37。C培養2min。加入150pi加鉀試劑凝血酶原激酶則凝血開始。如果多肽表現出抗凝血活性，則凝血酶原時間增加。可選地，多肽或多肽複合物對外源性tenase活性的影響可通過下面實施例部分所述的方式來評估。正如此處所述的，hemextinA和及其與hemextinB的複合物被認為通過TF-FVIIa複合物(外源性tenase複合物)抑制了FX的活性。因此，本發明第一個方面的多肽和由本發明第一和第二個方面的多肽複合物適當地抑制了TF-FVIIa複合物將FX催化激活為FXa.的能力。關於如何測定的細節在下面實施例部分闡述，實施例部分描述了單個蛋白和外源性tenase活性複合物的抑制作用能夠通過測量蛋白或FXa結構複合物的方式來測定。在一個實施方案中，當以含有hemextinA的複合物或hemextinA的變體、突變體、功能性等價物、活性片段形式存在時，hemextinB的變體、突變體、功能性等價物、活性片段具有至少約20%，30%,40%,50%，55%,60%，65%,70%,75%，80%，85%,90%o或95%的外源性tenase活性抑制作用。為測定推定的功能性等價物、活性片段或hemextinA的融合蛋白是否能夠與本發明第二個方面的多肽形成一個協同複合物，或者為測定外源性抗凝血活性，選擇性地使用hemextinB。同樣，為測定推定的功能性等價物、活性片段或hemextinB的融合蛋白是否能夠與本發明第二個方面的多肽形成協同複合物，或者為測定外源性抗凝血活性，選擇性地使用hemextinA。變體包括，例如，屬於源於由其獲取多肽的種的等位變體。此外，可能SEQIDNO.2的最後四個胺基酸用於突變。相應地，SEQIDNO.1，2，3,4或5變體序列的鑑別序列和作為進一步研究HemextinA或B的鑑別序列也包括在第一和第二個方面的範圍內。本發明所述變體可以包括一個或多個胺基酸殘基被一個或多個保守的或非保守的胺基酸殘基(優選保守的胺基酸殘基)所替代的多肽。一般此種替代發生在Ala，Val,Leu和He;Ser和Thr;酸性的Asp和Glu殘基；Asn和Gin;基本的Lys和Arg殘基；芳香族Phe和Tyr殘基。特別優選的變體是幾個胺基酸以任意組合被替代、刪除或添加，例如在510，15,1~3，1~2或僅僅1個。更特別優選的是沉默替代、添加或刪除，這不會改變多肽的性質和活性。關於這個同樣更優選的是保守胺基酸殘基。變體或突變的多肽也包括其一個或多個胺基酸殘基包括取代基的多肽。希望修飾一個胺基酸序列如修飾多肽的性質(例如其生物活性)的變體也被考慮在內。另一個本發明所述第一和第二個方面的實施方案提供了包含單個或多個胺基酸殘基，添加、插入，和/或刪除，和/或化學修飾的胺基酸取代的本發明多肽的功能性等價物。其中"功能性等價物"指(i)含有或者單獨或以複合物形式表現出的抗凝血活性的功能性特徵；或者(ii)含有與多肽協同的抗原決定簇。本發明此個方面所述的功能性等價多肽，可以是一個含有至少與本發明所述的多肽有60%的相同序列的多肽。在一個實施方案中，提供了與hemextinA，hemextinB或等位變體至少有60%相同序列的功能性等同多肽。測量蛋白序列同一性的方法是本領域已知的，該方法在本文中可以通過上下文被本領域普通技術人員所理解，序列同一性是基於胺基酸同一性(有時指的是"hard同源性)而計算出的。例如，UWGCGPackage提供了能夠被用於計算序列同一性(例如使用其默認的設置)的BESTFIT程序(Devereux等(1984)NucleicAcidsResearch12，p387-395)。PILEUP和BLAST的算法能用於計算序列同一性或線性序歹'K典型地使用其預設設置),例如就像在AltschulS.F.(1993)JMolEvol36:290-300;Altschul,S,F等(1990)JMolBiol215:403中所描述的，BLAST分析軟體可在世界範圍內通過網際網路從國家生物技術信息中心公開獲得，網址是www.ncbi.nlm.nih.gov。此算法包括首先通過識別詢問序列中長度W的短字碼來識別高得分序列對(HSPs),當與資料庫序列中相同長度的字碼比對時，詢問序列或者匹配，或者滿足某些陽性閾值界T。T指的是閾值界的相鄰字碼(Altschul等，同上文)。這些最初的相鄰字碼釆樣數最為開始檢索含有它們的HSPs的源詞。只要增加累積校準線，詞釆樣數沿著每一個序列的方向被擴展。BLAST算法是對這兩個序列的相似性作一個統計學分析。參見KarlinandAltschul(1993)Proc.Nad.Acad.Sci.USA90:5873。由BLAST算法所提供的相似性測量是最小的概率(P(N))，它通過在兩個核苷酸或被取代的胺基酸序列彼此匹配而提供了概率顯示。通常情況下，兩個多肽之間具有大於60%的序列同一性便認為是功能性等同，假定多肽單獨或以複合物的形式顯示出抗凝血特性多肽之間具有共同的共同的抗原決定漦。在一個實施方案中，本發明所述同等功能多肽和該多肽序列或片段相同顯示出序列同一性的程度大於60%。該多肽可能分別有大於70%，80%,90%,95%,97%,98%或99%序列相同度。本發明所述的功能性等價多肽，因此意欲包括突變體(諸如含有胺基酸替換、插入或刪除的突變體)。這種突變可能包括多肽，其中一個或一個以上的胺基酸殘基被一個保守或非保守的胺基酸殘基(最好是保守的胺基酸殘基)取代，這樣的取代胺基酸殘基可能是也可能不是一個由遺傳密碼編碼。典型的這種替換是包含在Ala,Val，Leu和Ile之中，絲氨酸和蘇氨酸殘基之中，其中酸性殘留Asp和Glu殘基之中，其中Asn和Gln殘基之中，賴氨酸和精氨酸殘基之中;或芳香苯丙氨酸和酪氨酸殘基之中。特別優選是其中的幾個，即在5至10個，l個和5個，l個和3個，1個和2個或只有1個胺基酸被替換、刪除或補充，在任何組合的變體。特別優選是不改變性質和活性的沉默替換，補充和刪除。在這個方面是保守的替代也是特別優選。"突變"的多肽，還包括其中一個或一個以上的胺基酸殘基包括一個取代基的多肽。具有改進功能的功能性等價物，還可通過在多肽序列中的特異性殘基系統或定向突變來設計。也包括在該範圍內的本發明第一和第二個方面都是活性片段，其中"活性片段"是指平截的多肽，即(i)具有以單獨或以複合物的形式表現抗凝血活性的功能性特點，(ii)具有與多肽共同的抗原決定簇。本發明的活性片段，包括至少n個連續的來自本發明所述多肽的胺基酸。適當地，活性片段至少包含的n個連續胺基酸來自於SEQIDNO.l，SEQIDN0.2,SEQIDN0.3，SEQIDN0.4或SEQIDNO.5或任意這些序列的變體、突變體或功能性等價物。n通常是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、35、40、45、50、55或60或更多)。本發明所述的多肽(例如本發明多肽的變體，突變體，功能等價物或片段)是可"自由獨立的"，即不是一部分或融合於其它胺基酸或多肽，也可包含在形成部分或區域的較大多肽之中。當以一個較大的多肽組成時，在一個實施方案中的本發明所述的多肽形成了一個單一連續的區域。此外，一些多肽可由一個單一的較大的多肽組成。在一個本發明第一和第二個方面的實施方案中，提供了一個功能性等價物或具有與本發明的多肽共同的抗原決定簇的活性片段。在一個實施方案中，抗原決定簇被hemextinA,hemextinB或一個等位基因變體共享。在一個實施方案中，抗原決定簇被SEQIDNO.l，SEQIDN0.2,SEQIDN0.3,SEQIDNO,4orSEQIDN0.5.所共享。"抗原決定簇"，指的是一個接觸到某一特定抗體的分子片段(即抗原表位)。"抗原決定簇"或表位，通常由分子的化學活性表面基團，如胺基酸或糖側鏈構成，並有特定的三維結構特徵以及特異性電荷特性。據了解，在本領域中，能夠模擬一種蛋白質抗原決定簇的相對較短的合成肽，可以用來刺激生產蛋白質抗體(例如，見sutcliffe等人，科學219:660(1983))。抗原-表面呈遞的肽和多肽能夠含有，例如，至少4至10個胺基酸，至少有10至15個胺基酸，或約15至約25個胺基酸。這種抗原-表面呈遞的肽和多肽可用此處所述的片段，或通過化學肽合成來生產。此外，抗原決定簇可由隨機肽庫的噬菌體展示進行選擇(見，例如，Lane和Stephen,Curr，Opin，免疫學5:268(1993)，和cortese等，Curr,gpin，biotechnol.7.616(1996))。鑑別抗原決定簇和由小分子肽組成的包含一個所描述的抗原決定簇的抗體產生的標準方i去，侈!j々口，Mole,"EpitopeMapping,"inMethodsinMolecularBiology,Vol,10，Manson(ed.)，pl05-116(TheHumanaPress,Inc.1992),Price,"ProductionandCharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies,"inMonoclonalAntibodiesProduction,Engineering,以及ClinicalApplication,RitterandLadyman(eds.),p6084(CambridgeUniversityPress1995),以及Coligan等.(eds.)，CurrentProtocolsinImmunology,第91-95頁和第91-911頁(JohnWiley&Sons1997)。這種具有抗原決定簇的多肽，可用於產生配體，如多克隆或單克隆抗體，其對本發明所述多肽具有免疫特異性。這種抗體可被用來分離或鑑別表達本發明多肽或者以親和層析純化多肽的克隆。抗體，也可能被用來診斷或治療愛滋病，其中包括其他應用，這對本領域普通技術人員而言也是顯而易見的。在一個實施方案中，本發明的第一和第二個方面，提供了一種含有將本發明的多肽融合到一個肽或多肽的融合蛋白，諸如一種標記，這可能是，例如，生物活性的、放射性的、酶或螢光，或一種抗體。舉例來說，包括一或多個額外的胺基酸序列，往往是有利的，其中所述的序列可能含有分泌或前導序列，原序列，輔助純化序列，或賦予更高的蛋白穩定的序列，例如在重組生產中。可選擇地，成熟的多肽，可與另一化合物融合，諸如增加多肽半衰期的化合物(如聚乙融合蛋白也可用於為本發明的多肽活性的抑制劑篩選肽庫。它可能用於表達能夠被商業上可獲得的抗體所識別的融合蛋白。融合蛋白也可能被基因改造，以含有位於本發明的多肽序列與一個異源多肽序列裂解位點，使該多肽可從異源多肽被裂解和純化脫離。對於"異源多肽"，包括在本質上是沒有發現與本發明的多肽結合的多肽。在一個本發明第一和第二個方面的優選實施方案中，提供了一個包含序列成分的多肽SEQIDNO.1，2,3，4或5(優選SEQIDNO.1:2或5)的胺基酸序列或變體、突變體、功能性等價物或活性片段。在一個實施方案中，多肽由SEQIDNO.1，2，3，4或5(優選地是SEQIDNO.1,2或5)的胺基酸序列或其變體、突變體、功能性等價物或活性片段構成。可以理解，本發明的多肽(例如SEQIDNO.1,2或5)可以在培養hemextinA和hemextinB.抗體個方面具有實用性。本發明的第三個方面提供了一種核酸分子，其中(i)編碼本發明第一或第二個的個方面多肽或，(ii)與(i)所述的核酸分子或其變體、突變體、片段或互補鏈雜交。寡核苷酸可是一個引物或探針。寡核苷酸可能含有嚴謹條件條件下與(i)所述核酸分子的至少10，12,15,17,20,25,30,35或40個保守核苷酸雜交的核苷酸序列的區域。在本發明第三個方面的一個實施方案中，核酸分子是一個包含寡核苷酸的探針或引物，寡核苷酸包含一個核苷酸序列區域，所述的核苷酸序列在嚴謹條件條件下與至少10，12,15,17，20,25,30,35或40個保守核苷酸(最好是自然發生的核酸分子)雜交。所述的核酸分子編碼SEQIDNO.1,2,3,4或5(或變體，突變體或功能性等價物或活性片段，等)。在一個實施方案中，核酸分子是一個包含寡核苷酸的探針或引物。所述的寡核苷酸包含一個核苷酸序列區域，該序列區域至少與10，12，15,17，20,25,30，35或40個核酸分子(最好是自然發生的核酸分子)的保守核苷酸互補。所述的核酸分子編碼本發明第一個方面的多肽，例如一個以SEQIDNO.1,2,3,4或5(或變體，突變體或功能性等價物或活性片段，等)表示的多肽。嚴謹條件可以是嚴謹的、中度嚴謹、中度/高度嚴謹、高度嚴謹或非常高度的嚴謹。本領域普通技術人員能夠理解由於遺傳密碼退化，許多編碼本發明第一和第二個方面多肽的核酸分子，可能會產生一些與已知多核苷酸序列和自然產生的基因具有最小序列同一性的多核苷酸。因此，本發明包括每一種多核苷酸序列可能的變化，可以基於可能密碼子選擇篩選組合來製備。此外，本領域普通技術人員能夠理解密碼子可能被挑選出以增加多肽或肽表達比率。所述的比率發生在某一特定的原核或真核宿主中，並與那些被宿主利用的特定密碼子的頻率一致。本發明的核酸可釆取RNA的形式，如mRNA，，或DNA的形式，其中包括，例如，克隆獲得或合成製得的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA或RNA可是編碼鏈，也可以稱為正義鏈，也可為非編碼鏈，也被稱為反義鏈。術語"核酸分子"，還包括DNA及RNA的類似物，如那些含有修飾骨架的，例如，肽核酸。測定是否將核酸分子雜交於特異性核酸的合適的實驗條件，可包括載有相關樣本的核酸濾紙的預浸泡，5xSSC,IO分鐘左右，並將濾紙在一個5xSSC溶液，5xDenhardt's溶液，0.5%SDS和100pg/mL的變性經超聲處理的鮭魚精子DNA預雜交，然後在同樣的含有濃度為10ng/ml的32-dCTP標記探針中雜交12小時大約45°C,按照Sambrook等(1989;MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndedition,ColdSpringHarbour,NewYork)所述的雜交方法操作。然後濾紙衝洗兩次，30分鐘，在2xSSC,0.5。/。的SDS至少在55'C時(低嚴謹度)，至少為60'C時(中等嚴謹度)，至少65。C時(中等/高嚴謹度)，在至少70'C時(高嚴謹度)，或者至少為75。C(極高嚴謹度)。雜交通過將濾紙曝光到X光片檢測。此外，有很多條件和因素被本領域的普通技術人員所知，這可能會被用來改變雜交的嚴謹度。例如，雜交到特異性核酸上的核酸的長度和性質(DNA,RNA的鹼基組成)；鹽和其它組份的濃度，如存在或缺少甲醯胺，硫酸葡聚糖，聚乙二醇等;雜交溫度的改變和/或洗滌步驟。此外，它也有可能從理論上預言與否兩個給定的核酸序列在某些特定的條件下雜交。相應地，作為一種上述經驗方法的替代，關於變異核酸序列是否雜交的測定，可以理論計算Tm(熔化溫度)為基礎，所述的Tm(熔化溫度)是兩個外源核酸序列與已知序列在特定條件下，諸如鹽濃度和溫度。在測定外源核酸序列(Tm(^>)熔化溫度，必須先測定同源核酸序列的熔化溫度(Tm(M,)。兩種完全互補的核酸鏈(同源雙鍵結構)之間的熔化溫度(Tm(隨，)，可按照下列公式確定，如在分子生物學中(JohnWileyandSons，1995年)概述的一樣Tm(同質「81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500TmABIVN單價陽離子的摩爾濃度，GC。/。-序列總鹼基數中鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的百分比，%形式=雜交緩衝液中甲醯胺的百分，和1^=核酸序列的長度。由上述公式確定的Tm是一個兩種完全互補的核酸序列間的同源雙鍵(Tm(,))的Tm。為了使Tm值適合這兩個外源核酸序列，它是假定異源序列的核苷酸序列間百分之一的差異等於Tm減少1°C。因此，異源雙鏈結構的T^M)，是通過將T^^,減去類似序列與探針序列之間的序列同一性百分比的差異來獲得。本發明所述的多肽、核酸分子與抗體是"純化的"。用在此處的術語"純化"，是指"通過人工"由其自然狀態改變而來，即如果它自然發生，它被從其自然宿主或環境改變或剔除。相關雜質可被減少或消除。在一個實施方案中，目的物種表現為優勢種(即在一摩爾的基礎上，它比任何其他個別物種在組成上更豐富)。在一個實施方案中，目的物種表現為實質上純化組分。實質上純化組分包括一個組合物，其中目的物種至少在所有生物大分子的物種的30%左右(摩爾基礎)。一般來說，一個實質上純化的組合物將包括多約80至90%的表現在組合物中的大分子種類，在一個實施方案中，對象物體被純化到基本同質(汙染物種類不能由傳統的檢測方法在組合物中檢出)，其中，組合基本上是由單一高分子品構成。核苷酸分子可以"裸露"的核苷酸分子或者包含核苷酸分子的載體和宿主細胞的形式提供，相關信息可參閱發明的第四和第五個方面。當核苷酸應用在病人身上時，總原則是所用的核苷酸分子應該是可以用核苷酸分子表達的多肽。本領域的技術人員包括具有適當資格的人員，如啟動子等都可以輕易製備這種核苷酸分子。本發明第四個方面提供了一種包含本發明的第三個方面所涉及的載體，如表達載體。此發明的載體可以包含形成信使核糖核酸的促進體和終結體，其中，促進體可操作的連接在核苷酸分子上，核苷酸分子可操作的連接在終結體上。載體還可以包括位置固定的核糖體，信使核糖核酸的初始和中止序列，提高和激活序列。許多原核和真核表達載體都可以買到。本領域技術人員知道如何選擇合適的載體。在一個實施方案中，載體包含編碼本發明第一個方面所涉及多肽的核苷酸序列。在一個實施方案中，載體包含編碼本發明第二個方面所涉及多肽的核苷酸序列。在一個實施方案中，載體包含編碼本發明第一和第二個方面所涉及多肽的核苷酸序列。本發明的載體還可以包含基因，例如允許可在合適宿主細胞和適當環境中篩選所述載體的標記基因。本發明還包括包含這些載體和表達載體的重組宿主細胞。因此，發明的第五個方面提供了隨著發明第四個方面所述的載體轉化的宿主細胞。舉例說明，宿主細胞包括細菌、酵母、真菌、昆蟲、鳥類、哺乳動物和植物細胞。在一個實施方案中，還提供了隨著發明第四個方面所述的載體轉化的宿主細胞，本發明第二個方面所述的多肽可以由宿主細胞表達。在一個實施方案中，還提供了用本發明第四個方面所述的載體轉化的宿主細胞，本發明第一個方面所述的多肽可以由宿主細胞表達，本發明第二個方面所述的多肽也可以由宿主細胞表達。本發明第一和第二個方面所述的多肽可由不同的載體編碼，其中，宿主細胞至少可用發明第四個方面所述的兩個不同載體轉化。本發明的第六個方面提供了一種製備本發明第一或第二個方面所述多肽的方法，包括在適合本發明第一或第二個方面涉及的表達多肽的條件下，培養本發明的第五個方面的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞表達本發明第一個方面的多肽。在另一個實施方案中，主細胞表達本發明第二個方面的多肽。在其他實施方案中，宿主細胞表達本發明第一和第二個方面的多肽。本發明的第七個方面提供了一種製備本發明第一或第二個方面所述多肽的方法，包括多肽的化學合成。例如化學合成可通過縮氨酸固相反應進行。這種技術是此領域熟知的技術，此領域技術人員能夠輕易實現。本發明的第六和第七個方面所涉及的方法還包括提純多肽，這種技術是此領域熟知的技術，此領域技術人員能夠輕易實現。如上所述，本發明的第一和第二個方面所涉及的多肽可以複合物形式提供，複合物包括本發明的第一個方面所涉及的多肽和本發明的第二個方面所涉及的多肽。複合物優選為四聚物。因此，本發明的第八個方面提供了一種製備複合物的方法，此複合物由本發明的第一個方面所涉及的多肽和第二個方面所涉及的多肽組成。此方法包括將本發明的第一個方面所涉及的多肽和第二個方面所涉及的多肽在適於複合物合成的條件下連結。本領域技術人員可容易的確定複合物的適當合成條件。此外，在下述具體實施例部分，適當條件包括將含有本發明第一個方面所涉及多肽和發明的第二個方面所涉及多肽的50mM緩衝溶液(Tris-buffer(pH7.4))在37。C保溫5分鐘。本發明的第九個方面提供了一種包含發明第一個方面所涉及的多肽和第二個方面所涉及的多肽的複合物。優選的，本發明第一個方面所涉及的多肽和第二個方面所涉及的多肽的比例是l:1。優選地，複合物是兩種多肽的四聚物。在一個實施方案中，複合物可通過本發明第八個方面涉及的方法來製備。如上所述，複合物為四聚物。在一個實施方案中，本發明的第一個方面所涉及的多肽是hemextinA。在一個實施方案中，本發明第二個方面所涉及的多肽是hemextinB。同時，複合物中的多肽可以是hemextinA和hemextinB，在上述討論中可知，一個或兩個多肽可以是上述的變體、突變體、功能性等價體、活躍片段或融合多肽。發明的第十個方面提供了製備抗體的方法，此抗體可識別本發明第一或第二個方面所涉及的多肽，或者本發明第九個方面所涉及的複合物，此方法包括以下步驟(i)用本發明第一或第二個方面所涉及的多肽，或者本發明第九個方面所涉及的複合物免疫動物；(ii)由所述動物體獲得抗體。本發明的第十一個方面提供了一種可識別本發明第一或第二個方面多肽的抗體。在一個實施方案中，抗體連接在hemextinA和hemextinB上，抗體連接在抗原表位上，如SEQIDNO.1,2,3,4,或5所示。在一個實施方案中，本發明第十和第十一個方面的抗體可識別本發明第一或第二個方面所涉及的多肽上的抗原決定簇，當多肽與本發明其他個方面所涉及的多肽形成複合物時，可暴露出抗原決定簇。因此，在一個實施方案中，抗體識別由本發明第一和第二個方面所涉及的多肽形成的複合物，可將複合物作為免疫原培養這種抗體。本發明涉及的抗體可單細胞或多細胞繁殖製備，可以是單特異性血清抗體，人抗體，還可能是雜交或嵌合抗體，如人源化抗體，改變抗體(Fab')2片段，F(ab)片段，Fv片段，單功能域抗體，二聚或三聚抗體片段或構件，微型抗體，或連接在抗原上的功能片段。抗體製備是本領域技術人員熟知的技術，且已公布在例如美國專利US4,011，308;4,722,890;4,016,043;3,876,504;3,770,380;和4,372,745上；也可以參照Harlow，Lane等人的《抗體-A實驗室手冊》和N.Y.的《ColdSpringHarborLaboratory〉〉(1988)。舉例說明通過對合適的動物，如老鼠，兔子，綿羊，山羊採用特定的抗原進行免疫處理，可以生成多細胞繁殖出的抗體。為提高免疫性，抗原必須在免疫處理前連接在載體上。這些載體是本領域普通技術人員熟知的。一般，將抗原混合或乳化在鹽液中，特別是一種佐劑如甫氏完全佐劑中，再皮下注射混合液或乳化液，來產生免疫。試驗動物通常2-6周後再加強一支或多支抗原鹽液，最好用弗氏完全佐劑。抗體也可以由本領域熟知的方法一體外免疫生成，多細胞繁殖的抗體血清就可以從獲得免疫的動物體內取得。單細胞繁殖抗體可採用科勒和梅斯坦(Kohler&Milstein)在《自然》1975年256期495-497頁的方法或其改進方法。典型地，上述方法可以使老鼠獲得免疫，也可以用在兔子身上，但是，比起從動物身上抽血提取血清，將脾(也可選擇幾個大淋巴節)摘除或切開與單細胞的連接更好。如需要，脾細胞可通過細胞懸浮液或嚴密包裹在抗原中被篩選(摘除或斷開特定連接)。表達特定抗原膜結合免疫球蛋白的B-細胞，連接在平板上,，不會被剩餘懸浮液衝走。將得到的B-細胞或所有游離脾細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜種瘤，並在選定的介質(如次黃嘌呤，蝶啶胺，胸腺嘧啶介質，"HAT")中培養，然後將雜種瘤稀釋到一定限度，化驗出與免疫抗原連接(不與無關抗原連接)的抗體。選定的單細胞克隆抗體一秘密雜種瘤就由體外(如在組織培養瓶或中空纖維反應器中)或體內(老鼠的腹中)培養出來。本發明也應用了人源化或嵌合的抗體，嵌合抗體分子在溫Winter等人1991年發表在《Nature》349期，293-299頁的文章，美國專利(No.4,816,567)中論及。人源化抗體分子在瑞茨曼(Riechmann)等人1988年發表在《Nature》332期，323-327頁的文章，沃森(Verhoeyan)等人1988年發表在《Science》239期，1534-1536頁的文章，及1994年九月21日出版的英國專利公開出版物(No.GB2，276，169)中論及。抗體可識別分子是說抗體能夠與特定的分子反應使分子與抗體連接，本發明所涉及的抗體可以已連接發明所涉及多肽的形式，和未連接本發明所涉及多肽的形式提供。在一個實施方案中，抗體或片段的結合親和力大於與105m-'的結合力，優選的，大於與10SM"的結合力，更優選的，大於與107m-'的結合力，最優選的，大於與18m"或1(^m"的結合力。本領域一項普通技術可以測定抗體的結合力，如斯凱特卡特分析法(斯凱特卡特年報，AT爿cW.Scz'.51:660(1949))。本發明的第十二個方面提供了一種製備本發明第一個方面、第二個方面所涉及的多肽以及本發明第九個方面所涉及的複合物的抗蛇毒血清的方法，包括利用本發明第一個方面，第二個方面所涉及的多肽以及本發明第九個方面所涉及的複合物使動物獲得免疫能力，然後從動物身上收集抗體，用來製造抗蛇毒血清。動物免疫處理可釆用本發明第一個方面所涉及的一種多肽，或本發明第二個方面所涉及的多肽，或同時釆用以上兩種多肽，所以動物可分別提供(分別製備或複合製備)或以複合物的形式提供兩種多肽。製備抗蛇毒血清的傳統方法是免疫處理哺乳動物，如馬，山羊或綿羊獲得對蛇毒的免疫能力。為降低毒性，蛇毒可用福馬林處理改性。為延長吸收時間，改性蛇毒可混合在氫氧化銷溶膠中。這樣得到的抗體就可以從動物身體中分離，用作病人特別是病人的解毒劑。最近，也釆用非哺乳動物鳥類如雞。在此過程中，將小雞用小劑量目標毒蛇的毒液免疫處理，當小雞長大，它就產生了可抗蛇毒的抗體，當小雞開始下蛋，抗蛇毒血清蛋白遺傳下來，並富集在蛋黃中，收集雞蛋提取蛋白質，製備抗體。將第一隻動物(如馬，雞)的血清施用於患病動物(寄主)給患病動物提供了特定有效的抗體。應用的抗體就像內在抗體一樣起作用，其與蛇毒結合降低毒性。本發明的第十三個方面提供了一種有效抑制本發明第一個方面，第二個方面所涉及的多肽以及本發明第九個方面所涉及的複合物的抗蛇毒血清，它可以按照本發明第十二個方面的方法來製備，但本發明第十四個方面所涉及的的方法交替使用。本發明的第十四個方面提供了一種識別本發明第一或第二個方面的多肽的複合分子，或本發明第九個方面的複合物分子的方法。文中所述的"調節劑"和"調節子"(modulator"and"modulates")等是指拮抗物、拮抗劑或者具有拮抗物、拮抗劑作用的化合物。為避免歧義，"調節劑，，應理解為包括可以提高發明的多肽或複合物抗凝血作用的化合物，以及可減弱本發明多肽或複合物抗凝血作用的化合物。發明第一個方面和第二個方面的多肽可在任何一種藥物篩選技術中用來篩選化合物文庫，那這種化合物就可調節發明第一個方面和第二個方面的多肽及發明兩種多肽複合物的活性。在一個實施方案中，方法包括將測試化合物與發明第一個方面或第二個方面的多肽連接，並確定是否已連接，多肽可以以包含發明兩種多肽的複合物形式提供。方法還包括確定測試化合物是否提高或減弱發明第一個方面或第二個方面的多肽的活性，或提高或減弱發明的兩種多肽的複合物的活性。本發明第一或第二個方面的多肽的活性，包括(i)當多肽(如存在發明第一個方面的多肽的情況下)單獨存在時，多肽作為抗凝血劑的活性；(ii)與發明其他個方面涉及的多肽形成活性化合物的能力(多肽發生複雜化合反應的能力或者得到複合物的反應可被影響(m)複合物的活性。測定抗凝血活性的方法已在上文描述，在具體實施例也會提及。這種方法包括凝血素實驗。拮抗物、拮抗劑、激動劑的活性也可以通過這裡描述的外源tenase複合物抑制的試驗來測定。測定測試化合物是否提高或減弱本發明所涉及多肽或多肽複合物的活性的方法，是本領域技術人員公知的，包括如相接實驗/軟體或X-射線結晶學。用在本發明篩選方法中的本發明所涉及的多肽或多肽複合物可以在溶液中的形式，或附著在固體支撐物上，粘在細胞表面或位於細胞內部。測試化合物(例如潛在調節劑))會以多種方式表現，包括自然或改性的培養基，酶，受體，小有機分子如分子量達到2000道爾頓的自然或合成有機分子，優選800道爾頓或更小的有機分子、肽類似物、無機分子、肽、多肽，抗體，或上述物質的結構或功能類似物。測試化合物可從如細胞，無細胞製劑，化學文庫或自然產物混合物中被分離，調節劑可以是自然或改性的培養基，配體，酶，受體或結構、功能類似物。為適當了解這種篩選技術，可參照Coligan等.，Cw/rewZ屍raZoco/sz力7mmwwo/ogy1(2):第5章(1991)。與拮抗物、拮抗劑、激動劑結合的好的化合物是結合於本發明所涉及的多肽和多肽複合物的分子。分子(如拮抗物)可通過竟爭性連接在本發明涉及的多肽或多肽複合物的受體上而可選擇地功能化。分子(如拮抗物)可通過結合在本發明涉及的多肽或多肽複合物的受體上，增加受體和發明涉及的多肽或多肽複合物的結合力而可選擇地功能化。潛在的調節劑(如拮抗物)包括有機小分子，肽，多肽以及連接在發明涉及的多肽上的抗體，從而抑制或消除活性。以這種方式，多肽或多肽複合體對正常細胞東縛分子的連接會被抑制，這樣多肽或多肽複合體的自然生物活性也被消除。在上述實施方案中，可採用簡單的結合力試驗，其中可通過標籤(label)直接觀測測試化合物與多肽或多肽複合體表面的結合，或間接連接於測試化合物，或在化驗中引入與標籤物質的竟爭物。另一種可採用的藥物篩選技術提供了與目的多肽或多肽複合物有適當結合力的化合物的全面篩選(參見國際專利申請W084/03564),由此，在固體基質上合成出大量不同小分子量測試化合物，然後與發明涉及的多肽或多肽複合體反應並衝洗。一種固定多肽或多肽複合體的方式是採用非中和抗體，釆用本
技術領域：
熟知的方法，可觀測被固定的多肽或多肽複合體。純化的多肽或多肽複合體也可以直接包覆在平板上，用在上述篩選技術中。矽法可用來測定調節劑活性，如需要，可釆用實驗方法確定調節劑活性。本發明的第十五個方面涉及一種藥物組合物，包括第一個方面或第二個方面涉及的多肽，第三個方面涉及的核苷酸，第四個方面涉及的載體，第五個方面涉及的宿主細胞，第九個方面涉及的複合物，第十一個方面涉及的抗體，第十三個方面涉及的抗蛇毒血清，第十四個方面涉及的調節劑。在一個實施方案中，藥物組合物包括發明第一個方面涉及的多肽或其編碼核酸。在一個實施方案中，該藥物組合物包含本發明第二個方面的多肽或其編碼核酸。在一個實施方案中，該藥物組合物包含(i)本發明第一個方面的多肽其編碼核酸分子；(ii)本發明第二個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子。包含本發明第一和第二個方面多肽的藥物組合物，該組合物中的多肽可以通過包含兩種多肽的複合物的形式提供，也可以通過非複合物多肽的形式提供。在一個實施方案中，本發明第一個方面的多肽與第二個方面的多肽的比例是在1:2到2:1的範圍內。更優選地，是在1:1.5至1.5:1的範圍內；更優選地，是1:1.25至1.25:l,更優選地，是1:1.15至1.15:1;更優選地，是1:U至1.1:1;更優選地，是1:1.05至1.05:1,以及更優選地，是約1:1。當多肽比例為1:1時，該多肽表現為四聚體形式，即包括本發明第一個方面的2條多肽和本發明第二個方面的2個多肽。本發明的藥物組合物，可包含一個藥物上可接受的載體。該組合物單獨施用或至少與其他的媒介物聯合施用，如一個如何無菌情況下都可以施用的穩定化合物。生物相容性藥用載體包括，但不僅限於，生理食鹽水，緩衝鹽水，葡萄糖和水。用在本發明中的藥物組合物，可以通過任何編號的途徑施用，包括但不僅限於，口服，靜脈注射，肌肉注射，動脈內，腦室內(intracerebroventricularly)，髓內，鞘內，腦室，透皮吸收，皮下，腹腔，鼻腔，腸道，局部，舌下含化，或直腸內的手段。除了活性成分，這些藥物組合物可能含有適合的藥物上可接受的載體，包括輔料和助劑。這些輔料和助劑能夠促進活性化合物加工成藥物上可應用的製劑。進一步配製和施用的技術細節，可參考最新版本的雷明頓的製藥科學(Maack出版，伊斯頓賓州)。口服的藥物製劑，可通過活性化合物與固體輔料結合而獲得，也可以通過加工由此產生的混合物顆粒(可選的，經過研磨)以獲得藥片或糖衣而獲得。如果需要的話，也可以添加合適的助劑。適當的輔料包括碳水化合物或蛋白質填充劑，如糖類，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇;澱粉玉米，小麥，水稻，馬鈴薯，或其他植物纖維素，如甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或羧甲基纖維素鈉;樹膠，包括阿拉伯樹膠(arabic)和西黃芪樹膠(tragacanth);和蛋白質，如明膠和膠原質。如果需要的話，可以添加崩解或溶解劑，如以交聯聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，褐藻酸或鹽，如海藻酸鈉。輔料可用適當包膜包裹，如濃縮的糖溶液，其中還可能含有阿拉伯樹膠，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波普凝膠，聚乙二醇，及/或二氧化鈦，紫膠漆溶液(lacquersolution)，以及適合有機溶劑或溶劑混合物。染料或顏料，可添加到藥片或糖衣片作為產品標識或表徵活性化合物的量，即劑量。可用於口服的藥物製劑包括明膠製成的壓接式膠囊，以及軟，密封的明膠製成的膠囊和包膜，如甘油或山梨醇。壓接式膠囊可含活性成分與填料或粘結劑的混合物，如乳糖或澱粉，潤滑劑，如滑石粉或硬脂酸鎂，並選擇性地，選用穩定劑。在軟膠囊中，活性化合物可能被溶解或懸浮在合適的液體中，如脂肪油，液體，或液體聚乙二醇或無穩定劑。適合腸外給藥的製藥配方可在水溶液中按配方製造，優選地，是在生理上兼容的緩衝器，例如漢克斯液，林格氏液，或生理緩衝鹽水。水中懸浮物注射液可能含有增加懸浮液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉，山梨醇，或右旋糖酐。此外，活性化合物的懸浮液，可製成適當的油性注射液。合適的親脂性溶劑或載體，包括不飽和脂肪酸脂，如麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯，三酸甘油脂，或脂質體。非脂聚陽離子胺基酸聚合物的要求，也可用於運載。或者，懸浮液也包含適合的穩定劑或增加化合物溶解度的因子，而且還可釆用高濃度溶液的製劑。對於局部或鼻腔給藥，適當的能夠透過特殊屏障的滲透劑，可以按照配方使用。這樣的滲透劑在本領域是已知的。本發明的藥品成分可以本領域公知的方式製成，例如，通過常規的混合，溶解，制粒，製成糖衣片，研磨，乳化，灌封，entrapping或冷凍乾燥過程。藥物組合物可作為鹽提供，也可以與許多酸性物質形成，其中包括但不僅限於，鹽酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，蘋果，和琥珀酸。鹽類比相應的自由基地的形式更趨於易溶於水性或其他質子溶劑。藥物組合物製備後，可以放置在一個適當的容器和標記指示狀態的處置。這種標記可能包括數量，頻率和使用的方法。對於適合用在本發明中的藥品組合物所包括的組合物，其中的活性成分是包含在可達到預期的目的一個有效的用量中。一個有效的劑量的測定是本領域普通技術人員多公知的。對於任何化合物來說，其治療有效劑量的初步估計或者通過細胞培養試驗，例如，對腫瘤細胞，或通過動物模型，如小鼠，大鼠，兔，狗，或者豬。動物模型也可用於確定適當的濃度範圍及給藥途徑。這些資料可以用來確定有用的劑量及對人的給藥途徑。治療有效劑量是指減輕症狀的活性成分的用量。療效與毒性，可通過在細胞培養中的標準的藥學程序或實驗動物，例如通過計算EDso或半數致死量統計資料來確定。治療作用的毒性劑量率是治療指數，它可以表示為LDso/ED5o比例。其中表現大的治療指數的藥物組合物是優選的。從細胞培養實驗和動物研究獲得的數據是用於按方配製人用的劑量範圍。包含此種組合物的劑量在循環濃度的範圍內是優選的，所述的循環濃度包括的EDso很少或根本沒有毒性。在這個範圍內劑量的不同取決於加工時的劑型，病人的敏感度，以及給藥途徑。精確的劑量將取決於醫生根據需要治療的病人的相關因素來確定。劑量和給藥被調整到以提供足夠濃度的活性成分或維持理想效果。可以考慮的因素，包括病情的嚴重性，病人的一般健康狀況，其年齡，體重和性別，給藥的時間和頻率，藥物組合物和反應靈敏度，及對治療的反應。長效型藥劑成分可每3至4天，每個星期，或雙周給藥，具體視其特定成分的半衰期和清除率而定。雖然上述討論的是關於本發明的藥品組合物，它應被理解為這種討論可能也適用於本發明的其他醫療產品或個方面，其中包括了本發明所述的"聯合製劑"和"藥物"。本發明的第十六個方面提供了本發明第一或第二個方面的多肽，本發明第三個方面的核酸分子，本發明第四個方面的載體，本發明第四個方面的宿主細胞，本發明第九個方面的複合物，本發明第十一個方面的抗體，本發明第十三個方面的抗蛇毒血清，能被本發明第十四個方面用於醫藥的方法所鑑別的調製劑。在一個實施方案中，醫療用途是使用病人需要的抗凝療法治療病人。"需抗凝治療的病人"，包括病人或對過量的凝血症狀易感者。過量的凝血對於特定病人，是指任何程度的可能有害病人健康的凝血。這些症狀可能包括一項或多項下列內容血栓病，腦栓塞，冠狀動脈疾病，心肌梗死，腦血管疾病，中風，肺栓塞，靜脈血栓形成，下肢深靜脈血栓，靜脈炎，表淺周邊動脈疾病，彌散性血管內凝血(DIC的)，血栓性靜脈炎，靜脈血栓形成，再狹窄，peripheralanginaphraxis，血管病血栓形成，缺血性腦血管血栓，血栓形成有關的疾病，不穩定型心絞痛，不穩定型心絞痛，血栓閉塞性脈管炎。由於此處使用的"治療"(與語法變體)是指無論在任何情況下，任何的及所有的用於糾正疾病狀態或症狀，防止疾病發生，或以其他方式阻止，妨礙，阻礙，或扭轉疾病疾病進展或其他不良症狀的應用。因此，所謂"治療"，包括預防性和治療性的處理。本發明的第十七個方面提供了一種用於治療需抗凝治療的病人的聯合製劑，該聯合製劑包括(i)本發明第一個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子；(ii)本發明第二個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子。(i)及(ii)可以本發明第九方面的複合物形式提供或分別提供。本發明第十八個方面提供了本發明第一個或第二個方面的多肽，本發明第三個方面的一個核酸分子，本發明第四個方面的載體，本發明第五個方面的宿主細胞或者本發明第九個方面的複合物在製備一種需抗凝治療的病人所需藥物上的應用。在本發明第十八個方面的一個實施方案中，提供了一種本發明第一個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子在製備一種需抗凝治療的病人所需藥物上的應用。可選的，該藥劑同時，單獨或連續的順序與本發明第二個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子給與病人。在一個實施方案中，將本發明第二個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子施用於患者。在本發明第十八個方面的一個實施方案中，提供了提供了一種本發明第二個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子在製備一種需抗凝治療的病人所需藥物上的應用。可選的，該藥劑同時，單獨或連續的順序與本發明第一個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子給與病人。在一個實施方案中，病人被給與了本發明第一個方面的多肽或編碼相同核酸分子。本發明第十九個方面提供了下列物質(i)本發明第一個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子；(ii)本發明第二個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子。在製備一種需抗凝治療的病人所需藥物上的應用。此處所使用的"組合製劑"，包括了醫藥製劑，其中包括(i)本發明第一個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子；(ii)本發明第二個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子。(i)及(ii)的成分可能出現在一個單一配方或可能出現在單獨的配方中。如果(i)及(ii)出現在單一配方中，它們可能會以複合物的形式提供，還可以非複合多肽(或當然是一個兩種混合物)的形式提供。因此，該活性成分在同一時間內(如同步)，或在不同的時間(如按順序)並在不同的時間內施用於病人，這可能是單獨獨立於另一個或與另一個相重疊。如果有單獨或連續給藥，第二治療劑的推遲給藥不應如失去本發明所述的治療劑的藥物組合物發揮的協同治療效果的益處。兩次組分給與的延遲時間，將於組分確切性質，相互作用，以及各自的半衰期的不同而變化，組合物可以按任何順序施用。在一個實施方案中，組份(i)與組份(ii)的比例是在1:2到2:1的範圍內。更優選地，是在1:1.5至1.5:1的範圍內；更優選地，是1:1.25至1.25:1,更優選地，是1:U5至1.15:1;更優選地，是1:1.1至1.1:1;更優選地，是1:1.05至1.05:1，以及更優選地，是約1:1。本發明第二十個方面提供了一種治療需要抗凝療法的病人用的方法，該方法包含對病人施用本發明第一個或第二個方面的多肽，第三個方面的核酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞，第九個方面的複合物或第十五個方面的藥物組合物。本發明的第二十一個方面提供了一種治療需要抗凝療法的病人用的方法，該方法包括對病人施用(i)本發明第一個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子；(ii)本發明第二個方面的多肽或編碼相同多肽的核酸分子。正如上面所討論的，(i)和(ii),可以表現為單獨的配方或者作為一個包含(i)和(ii)單一的配方。凡是單獨配方的形式，(i)和(ii)，可分別施用、按順序或同時施用。(i)和(ii)可以以本發明第九個方面的複合物的形式提供。本發明的第二十二個方面提供了一種治療被蛇咬傷病人的方法，該方法包括對病人施用，本發明第一個或第二個方面的多肽，第三個方面的核酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞，第九個方面的複合物或第十五個方面的藥物組合物。本發明的第二十三個方面提供了本發明第一個或第二個方面的多肽，第三個方面的一個核酸分子，第四個方面的載體，第五個方面的宿主細胞或者第九個方面的複合物以及第十五個方面的藥物組合物，在製備一種治療被蛇咬傷病人所需藥物中的應用。雖然本發明已在特定地方對本發明的特定方面進行了描述，但本領域普通技術人員應能理解這些內容可同樣適用於本發明的其他方面，並且說明書應據此相應地詮釋。本發明的實施，除另有註明外，將釆用傳統的分子生物學技術，微生物學技術和基因重組技術。所述的這些技術包含在本領域所釆用的這些技術之內。這些技術在文獻中被充分地解釋。供參考的實例，包括SambrookMolecularCloning;ALaboratoryManual,第三(2000)以及隨後的版本。實施例這裡介紹了可介導眼鏡蛇i/./^emacAw^(非洲環頸血蝮蛇)毒液抗凝血活性的三指毒素的純化和鑑定。儘管其具有溫和的抗凝血活性，但是與第二種三指毒素的協同作用增加了它的抗凝作用。這裡描述了該複合物形成的一些特徵。抗凝蛋白及其複合物通過TF-FVIIa特異性地抑制FX的活性。這是第一個獨特的通過抑制TF-FVIIa複合物表現抗凝作用的三指毒素協同複合物。材料和方法——低壓凍幹的/zaemac/^w毒液獲自非洲爬行動物和蛇毒，Gauteng，南非。凝血激酶與鈣(用於凝血酶原時間衍生法)，魯塞爾(氏)喹蛇毒液(RW)(用於蛇毒止血時間測定)，凝血酶試劑(用於凝血酶時間測定)，苯甲脒鹽酸化物以及4-乙烯吡啶購自Sigma公司(St.Louis，MO,美國)，卩-巰基乙醇購自NacalaiTesque(Kyoto,日本)。顯色底物是H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide(pNA)二鹽酸鹽(2HC1),(S-2288),/^ra-Glu-Pro-Arg-pNA.HCl(S-2366),H畫D-Phe陽Pip陽Arg-;NA'2HCl(S-2238),H-D-Pro-Phe-Arg-;NA.2Ha(S-2302),Z隱D-Arg畫Gly畫Arg-;NA,2HCl(S隱2765)，；少ra畫Glu-Gly-Axg畫；NA-HCI(S-2444),benzoyl陽Ile陽Glu(GluYOMe)-Gly隱Arg陽;NA.HCl(S-2222),H隱D陽Val-Leu畫Lys隱屍NA,2HCl(S曙2251),H陽D-Val-Leu-Arg畫屍NA-HCl(S-2266)和MeO-Suc-Arg陽Pro-Tyr-;NA'HCl(S-2586)來自ChromogenixAB，Stockholm。SpectrozymeFIXa(H-D-Leu-Ph'Gly-Arg-;NA.2AcOH)購自美國DignosticaInc.,Stamford,CT。所有底物在使用前在去離子水中重構。冷凍乾燥的重組人凝血激酶(Innovin)購自德國DadeBehringMarburg。人原血漿由健康自願受試者捐獻。所有其它化學藥品以及試劑均為可獲得的最高純度。拔凝i蛋冷遊潛眾——釆用AKTA純化裝置(AmershamBiosciences,Uppsala，Sweden)將i/.Aaemac/zato天然毒液(訓mg溶於1ml蒸餾水中)用Superdex30凝膠過濾柱過濾(1.6x60cm)，並用50mMTris-HCl(pH7.4)緩衝液平衡，並用同樣的緩衝液進行洗脫。利用凝血酶原時間凝固試驗來分析每一成分的抗凝血活性(見下文)。將有效的抗凝血活性成分混合，在相同色譜系統中再利用陽離子交換柱來進行亞分類。把抗凝血成分填裝到UnoS-6柱(Bio-Rad,Hercules,CA;柱體積為6ml),並用50mMpH7.5的Tris-HCl緩衝液平衡。結合的蛋白質用加有1MNaCl的相同緩衝液進行線性梯度洗脫。將收集的成分用於抗凝血活性試驗。將通過陽離子交換色譜法獲得的抗凝血峰組分裝入用0.1%三氟醋酸(TFA)平衡的JupiterC18(lx25cm)柱。結合的蛋白質用含有80%乙腈(ACN)的0.1%TFA緩衝液進行線性梯度洗脫。收集各峰的組分，低壓凍幹，以備抗凝血活性試驗使用以及隨後的釆用Chromeleon微液色譜系統(LCPackings,SanFrancisco,CA)的窄內徑Pepmap柱的再次色譜法分析試驗。慮夢,漆子眾|譜^<^S/-MS——用Perkin-ElmerSciex的API-300LC/MS/MS系統通過ESI-MS法來測定抗凝蛋白的均質性及質量。典型地，可將RP-HPLC部分直接用於分析。離子噴射的噴孔以及環的電壓分別是4600，50和350V。噴霧氣以及氣幕釆用氮氣。溶劑(0.1%含有40%ACN的TFA)輸送裝置採用50|il/分鐘的低速LC-IOADShimazdu泵。採用BioMultiview軟體(Perkin-ElmerSciex)分析和解巻粗質譜。ifi議》裙裙乙j眾~~利用已知方法(24)對蛋白質進行還原和吡啶乙基化。簡單地說，將蛋白質(0.5mg)溶解於50(^1的變性劑緩衝液(6M的鹽酸胍，0.25MTris-HCl,1mMEDTA,pH8.5)中。添加l(Hil的p-巰基乙醇到混合物中後，真空中37。C孵育2小時。再向混合物中添加4-乙烯吡P定(5(V1)，室溫放置2小時。吡啶乙基化的蛋白質用JupiterC18分析柱(4.6x250mm)進行梯度純化，流速為0.5ml/min，緩衝液為含有0.1%(v/v)CAN的TFA。A^^著^/斧-釆用Perkin-ElmerAppliedBiosystems494pulsed-液相測序儀(Procise)以及在線的785APTH-胺基酸分析器進行自動化Edman降解來測定天然的以及S-吡啶乙基化的蛋白質序列。拔凝i,^參闢重^^一之前的研究表明，有效的抗凝血蛋白質與另一種毒液蛋白互作形成具有協同作用的複合物。該複合物可以通過體外試驗在試驗前立即將兩種蛋白質(除非另外提到)按等量分子濃度在50mMTris緩衝液(pH7.4)中，37°C孵育5分鐘，就可以構建成各種不同的複合物。拔凝血放絲——通過釆用BBLfibrometer的四種凝固試驗來測定R/wemflcAa,w毒液及其組分的抗凝活性1、處^秒/《按照Langdell等人的方法(25)來測定復鈣時間。50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)(100(il)，血漿(IOOpl)以及不同濃度的毒液或它的成分(50在37'C預孵育2分鐘。在添加50pl50mM的CaCl2溶液後開始凝固。2、凝i鏐,^7《按照Quick的方法(26)來測定凝血酶原時間。100pi50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)，100|il血漿以及50pl的毒液或它的成分在37'C預孵育2分鐘。在添加購自Sigma(St.Louis,MO,USA)的凝血激酶和鈣試劑(150pi)後開始凝固。一為了研究靜電相互作用，通過50mM含有不同濃度NaCl(35mM-150mM)的Tris-HCl(pH7.4)溶液來監控特定濃度的hemextinA(4.4/iM),hemextinB(4.4|iM)和hemextinAB複合物(0.11pM)的抗凝活性。一為了研究疏水性的相互作用，通過50mM含有不同濃度甘油(125mM-250mM)的Tris-HCl(pH7.4)溶液來監控特定濃度的hemextinA(4.4(iM)，hemextinB(4.4|iM)和hemextinAB複合物(0.11|iM)的抗凝活性。3、老孝ii^7《.'蛇毒止血時間的測定是按照Hougie介紹的方法(27)確定的。血漿(lOO(il)，50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)(100|il)以及RW(O.Ol嗎/100和單一的蛋白質或改造的複合物(50^)在37。C預孵育2分鐘。在添加50pl50mM的CaCl2溶液後開始凝固。4、凝i^A7:凝血酶時間是按照Jim介紹的方法(28)來確定的。將單一蛋白或重構複合物與100的血漿以及10050mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)在總體積為250pl體系下37X:孵育2分鐘。在添加標準的凝血酶試劑後開始凝固(50[xl中添加0.01NIH單位)凝履3^^譜#一一不同抗凝蛋白之間複合物的形成是通過利用AKTA純化儀的Superdex30凝膠過濾柱(1.6x60cm)的凝膠過濾色譜法來檢測的。濾柱用流速為lml/min的50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)來平衡。將單一蛋白質以及等量分子的抗凝蛋白混合物(37t:孵育30分鐘)載入過濾柱，並用同樣的緩衝液進行洗脫。洗脫在280nm下進行。FW/a教z嗜眾一按照參考文獻(29)的方法大量製備FVIIa。簡單地說，通過純化以及從15000L人血漿納過濾的4.5gFVII。通過在l(TC下孵育18小時將FVII完全活化為FVIIa後，將FVIIa製品在20mM含有240rnMNaCl以及13mM甘氨酸、pH6.9的杼檬酸鹽溶液中透析。透析後的FVIIa置於-60"C冷凍保存。sZF按照參考文獻(3)所述的方法製備重組體人sTF(TF負型，跨膜以及胞內區域，含有胺基酸的1-219位)。簡單地說，構建sTF產物的表達載體並在啤酒酵母中表達。重組體sTF被分泌到發酵液中，然後通過兩步柱層析法分離。//在Z複合酶的改造一通過10pMFVIIa與70nM重組體人TF(Innovin)在緩衝液A(20mMHEPES,150mMNaCl,10mMCaCl2and1%BSA，pH7.4)中37。C孵育10分鐘完成TF-FVIIa複合物的重構。然後向混合液中添加FX至終濃度為30nM。孵育15分鐘後，向每50pi反應混合液中添加50pi的終止溶液(20mMHEPES,150mMNaCl,50mMEDTA以及1%BSA,pH7.4)後終止激活狀態。通過將1mMS-2222水解在緩衝液A中，並利用微量滴定板讀寫器在405nm處測定形成的FXa。通過在添加FX之前15分鐘添加單一蛋白質或抗凝複合物來測定對外在X複合酶活性的抑制作用。^資發麥冷鏐辨#絲一通過抗12種絲氨酸蛋白酶-前凝血絲氨酸蛋白酶(FIXa,FXa，FXIa,FXIIa，血漿激肽釋放酶和凝血酶)，抗凝蛋白絲氨酸蛋白酶(APC),溶解纖維蛋白絲氨酸蛋白酶(尿激酶，t-PA和纖維蛋白溶酶)和典型的絲氨酸蛋白酶(胰島素和胰凝乳蛋白酶)來檢驗抗凝蛋白及其複合物的選擇性。不同濃度的純化的hemextinA/hemextinB和重組的hemextinAB複合物與每種酶(表1)37°C下預孵育5分鐘，然後再加入合適的顯色底物。tableseeoriginaldocumentpage48為了研究FXIa、激肽釋放酶以及尿激酶，在篩選抗抑制劑之前首先確定它們的合適的底物。對於FXIa，確定了對應於顯色底物S-2266,S-2302和S-2366的醯胺酶活性Vmax。S-2302具有最高的底物活性V^x,因此被用於篩選研究。同樣地，我們對激肽釋放酶與底物S-2266,S-2302和S-2288以及尿激酶與底物S-2444和S-2484進行了試驗。微量滴定板單孔總體積是20(^1,測定了FVIIa終濃度(300nM)/S-2288，FVIIa-sTF(30nM)/S-2288,FXa(0.75nM)/S-2765，a-凝血酶(0.66nM)/S-2238，纖維蛋白溶酶(2nM)/S-2366，FIXa(3|iM)/spectrozymefOCa,FXIa(0.34nM)/S-2366，FXIIa(0.4nM)/S-2302,重組體組織纖維蛋白溶酶原激活劑(80nM)/S-2288,激活蛋白C(0.34nM)/S-2366,尿激酶/S-2444，血漿激肽釋放酶(0.4nM)/S-2302,胰島素(2.17nM)/S-2222以及胰凝乳蛋白酶(0.4nM)/S-2586。測量5分鐘以上的底物水解作用的動力學速率(mOD/min)。處參^#伊^#力夢紫^遊濕/定一所有的試驗都是在含有50mMpH8.0的Tris-HCl,150mMNaCl,10mMCaCl2以及1%BSA的測試緩衝液中37'C下進行。在測定單一hemextin以及hemextinAB複合物的抑制作用以前，先測定FVIIa-sTF的顯色底物S-2288水解作用的動力學常數。在含有FVIIa(30nM)與sTF(100nM)複合物的終體積為180^的96孔板每孔中添加S-2288(0—5mM)後開始反應。利用SPECTRAmaxplus溫度控制的微量培養板分光光度計(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)通過405nm(A405nm)處的吸光值來測得5分鐘以上的初始反應速度線性增加。通過測得的速度非線性回歸擬合獲得Km值為2.79mM。y/，^^力夢一通過大範圍底物濃度變化來測定抗凝血複合物的抑制潛能性。在微量滴定板的小孔中將酶輔助因子與抑制劑預混合後添加S-2288啟動反應。FVIIa-sTF的反應包含0.0125-0.05抑制劑複合物以及0至3mM的S-2288。在穩定狀態下測試5分鐘以上的起始速度，並通過反覆的非線性回歸與方程1的擬合，它展現一種經典的非競爭性抑制劑，並獲得Ki值。「=.................(Eq.l)箏蘆/,定童糸^(7rC,試'發一用VP-ITC滴定量熱系統(MicrocalInc.,Northampton,MA)來測定抗凝劑hemextinAB複合物與FVIIa的互作。該儀器釆用內裝電刻度校驗來標記刻度。將50mM的含有FVIIa(10(iM)的Tris-HCl以及10mMCaCl2(pH7.4)置於量熱孔，再用溶於250fil注射器的含有同樣緩衝液的重組的抗凝複合物(0.2mM)在37。C300rpm連續攪拌下滴定。在滴定前，將所有的蛋白質溶液進行過濾和脫氣。由於初始幾次注射出現基線錯誤，因此擬合法不包含這些數據。利用儀器本身配套的MicrocalOriGlnVersion7.0數據分析軟體將量熱數據處理以及擬合成為^^^,^^一遂4模型。按照方程式2來計算活性孔體積^中的溶液的總產熱量Q(通過非配對的種類設置為0來確定)，其中《為親和力常數，"是位點數量，」//是配體結合的熱函，M,和《分別是大分子以及配體的容積濃度，結合formulaseeoriginaldocumentpage50(Eq.2)測定的兩次速續注射完成之間的熱變化(A0是按照標準的Marquardt方法將孔內的蛋白質以及配體溶液進行校對的。按照下面的關係計算互作之間的自由能變化"G):AG二A/f-TA5:-irin《。,其中r為絕對溫度，及為普適氣體常數。CD》vf裔試'-發——利用JascoJ-810分光旋光計(JascoCorporation,Tokyo,Japan)記錄遠紫外CD光譜(260-190run)。所有測定均利用光路長度為O.lcm的比色杯在室溫下進行。通過301/min的氮氣來洗滌光學器械。光譜的掃描速度為50nm/min，解析度為0.2nm以及譜帶寬度為2nm。每個光譜掃描6次，取平均值後減去基線。利用50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)來監控不同濃度的hemextinA以及hemextinB的構象。為了研究複合物的形成，我們釆用了將hemextinA濃度保持為0.5mM，而變化hemextinB濃度的滴定試驗。i^f苴徑闢,/定——hemextinAB複合物以及單一hemextin的分子直徑都釆用氣相和液相兩種方式來測定。^)氣#冶^遷參^義分^^浙議廣G五MM4」一一利用GEMMA(71,72)的納微分遷移率分析儀，3980模型(TSI，StPaul,MN，USA)以及標準的CPC3025型(TSI,StPaul,MN，USA)來測定分子直徑。儀器的操作設置為"錐形噴射"模式，電壓大小為2.5-3.0kV,產生的電流大小為200-300nA。為了穩定電噴射，消除電暈放電，我們釆用21/min的過濾大氣氣體以及0.11/min的濾過C02氣體的同心鞘氣流。在試驗前，用20mM醋酸銨(pH7.4)配製hemextinA(4ng/ml)和hemextinB(4ng/ml)樣品溶液，現配現用。將hemextinAB複合物(4.5ng/ml)在上述緩衝液中重新配成溶液，37'C孵育IO分鐘。另外一種從相同毒液中分離純化得到的三指蛋白毒素C,在GEMMA試驗中用作對照。將樣品按照流速為100nl/min注入電噴射室。在整個EM直徑範圍內(0到25nm)記錄掃描20次，並取平均數獲得GEMMA光譜。數據的表示釆用非平滑算法。—用BI200SM儀(BrookhavenInstrumentsCorporation,Holstvile，NY，USA)在25°C條件下通過DLS來研究複合物的形成。試驗光源為一垂直偏振氬離子雷射器(514.2nm，70mW;NECGLG-3112型)。在試驗前，配置hemextinA(4mM)，hemextinB(4.1mM)以及hemextinAB複合物。,3mM)樣品溶液，現配現用。記錄hemextinAB複合物以及單一hemextin在不同離子強度以及不同甘油濃度溶液中，25。C條件下的水動力學直徑。通過添加NaCl來改變離子強度。測定平移擴散係數("T)可以利用Stokes-Einstein關係式計算出流體半徑(iH):。T=A:B:r/67niiH...................(Eq.3)，這裡Ab是Boltzmann常數，r是開(爾文)氏溫度，"是溶劑的粘滯度。利用儀器本身自帶的BI-9000數字相關器獲得強度-強度時間相關函數。通過分析利用約束正則化CONTIN方法(73)的相關函數Ig(1)(T)l來獲得顆粒大小以及大小的分布情況。#f為了研究複合物形成的質子作用，我們還釆用了在PBS,pH7.4或10mMMOPS，pH7.4溶液中的量熱試驗。#,冶#互伊^遊《^—通過釆用不同離子強度的50mMTris-HCl緩衝液的ITC試驗來評估複合物形成的靜電相互作用的功能。通過添加氯化鈉(NaCl)來改變緩衝液中的離子強度(35mM到150mM)。i^絲^互伊^闢^^—通過釆用50mM含有不同濃度甘油(125mM-250mM)的Tris-HCl緩衝液(pH7.4)來研究複合物形成的疏水性相互作用的功能。》Yf,浙法漆法"五C,試'-發一釆用AKTA純化系統(AmershanBiosciences,Uppsala，Sweden)的預先裝好的Superdex75凝膠過濾柱(1.6x60cm)，所有SEC試驗均在室溫下進行。使用50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)或特定的洗脫液洗柱，流速為lml/min。樣品上柱體積為4ml。用卵類粘蛋白(28KD),核糖核酸酶(15.6KD),細胞色素C(12KD)，apoprotinin(7KD)以及pelovaterin(4KD)(20)作為過濾柱的分子量標準。通過跑葡聚糖藍測定空白的體積。在每循環之前用至少2個柱床體積的洗脫緩衝液平衡過濾柱。通過檢測利用含有不同濃度NaCl(75mM-150mM)的50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)的洗脫物來研究在hemextinAB複合物形成中的靜電作用。通過記錄50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)的洗脫物來確定在複合物形成中的疏水作用。在兩個試驗中，先用目的緩衝液平衡柱，再將用各自緩衝液重懸的hemextinAB複合物溶液上柱。通過280nm處的吸光值來檢測蛋白質的洗脫。/Z)-7VMii^^裔試'發一利用裝備有現代冷凍探針的Bruker600MHz核磁共振波譜儀以及電子變溫元件來進行一維質子NMR試驗。利用光譜儀接口的Topspin軟體(Bruker)獲得光譜。用50mMTris-HCl緩衝液(pH7)配置HemextinA(0.5mM)和hemextinB(0.5mM)溶液，然後將溶液轉入5mmWillmadNMR管。所有的氘化試劑都購自Aldrich實驗室，其同位素純度為99.9%。&20試驗的譜寬設置為16p.p.m，傳感器/輸送器置於水信號的位置，最大限度的降低假象。通過WATERGATE脈搏來連續抑制水質子引起的大量共振現象。典型地，每個FID掃描128次，再切趾之前先平均，然後進行傅立葉轉化。^化學位移以2,2-二甲基-2-矽戊烷-5-磺酸鈉(DSS)溶液為參考。結果拔凝多冷遊i嶽必一天然的Aflemac/^^毒液同時在再鈣化試驗以及凝血酶原時間分析試驗中都具有有效的抗凝血活性(圖1A和圖1B)。天然毒液通過凝膠過濾色譜(法)按照粒級純化抗凝蛋白(圖2A)。通過凝血酶原時間試驗確定了對應於峰2和3的成分含有抗凝蛋白。峰2對應的蛋白質，大多數含有已經鑑定的PLA2(31)。而峰3含有較緩和的抗凝血活性(插圖2A)。因此，我們目標集中到分離峰3中含有的抗凝蛋白，其用UnoS柱通過陽離子交換色譜法進一步分離(圖2B)。只有峰A表現出緩和的抗凝血活性。初步研究表明，峰A的抗凝血活性是由峰B加強的(見下)。因此，抗凝血複合物特異地抑制外在的tenase複合物(描述如下)，將其命名為hemextin(//ewac/w^sextrinsictenaseinhibitor),其單體蛋白分另'j命名為hemextinA和B。對應於hemextinA和B的部分各自混合，並用RP-HPLC(圖2Cand圖2D)以及毛細管液相色譜法(圖2Eand圖2F)純化。利用ESI-MS來確定單一蛋白質的同質性以及質量。hemextinsA和B的質譜具有3次質/荷比的峰值，其範圍為3-6個電荷(數據未顯示)，其質量量經計算分別為6835.00±0.52和6792.56士0.32道爾頓(圖2G和圖2H)。資差^^^闢讀^一利用埃德曼降解來測定hemextinsA和B前37個胺基酸殘基序列(圖3)。通過測定吡啶基乙醇酯蛋白的序列確定該兩種蛋白質的半胱氨酸的位置。這兩種蛋白質都與心臟毒素、突觸後神經毒素、纖維束以及其它三指毒素家族成員類似(圖3),因此它們屬於蛇毒蛋白家族。//ewex"朋闢拔凝i潘絲一利用凝血酶原時間試驗來測定hemextinsA和B的抗凝血活性(圖4A)。HemextinA凝固時間延長，並具有較緩和的抗凝血活性，相反地，hemextinB即使在較高濃度下都不對凝血時間產生顯著效果。更有趣地是hemextinsA和B等摩爾混合之後具有更有效的抗凝血活性，因此表明這兩種蛋白質具有協同作用(圖4A)。抗凝血活性如此的增加可能是由於凝血連鎖反應的兩個獨立步驟的任一抑制或由於它們之間複合物的形成。而hemextinB自身在凝血酶原時間上不具有顯著作用，它不能抑制獨立的步驟；因此，hemextinsA和B形成複合物的可能性很大。//eme;c"'朋^，5之為了研究這兩種蛋白質之間複合物的形成，將滴定試驗用於凝血酶原時間測定。在該試驗中，保持hemextinsA濃度4.4不變，利用hemextinB濃度增加來監控其抗凝血活性(圖4B)。抗凝血活性隨著hemextinB濃度的增加，直到比率為1:1。進一步濃度增加並不能增加抗凝血活性。這些結果顯示hemextinsA和B之間按1:l形成複合物，並且複合物形成是抗凝血活性有效的關鍵。通過凝膠過濾色譜法進一步確定了hemextinsA和B之間複合物的形成。如圖5所示，單一hemextinA和B的滯留時間為約70min。然而，重構的複合物洗脫物在滯留時間約40min時具有較大的峰值，在滯留時間約70min時的峰值較小。滯留時間減少的主峰的出現與兩種hemextins之間複合物的形成是一致的。拔凝i麥絲設^一如前所述，hemextinA及其與hemextinB形成的複合物，可以延長凝血酶原時間(圖4A)。我們釆用簡單的"分割方法，，來確定外源性凝血途徑的特定時期(32'33)。釆用三種名為凝血酶原時間，蛇毒止血時間以及凝血酶時間的常規實驗來進行凝血時間試驗(圖6A)。該方法基於的原理是啟動抑制步驟"上遊"級聯反應將延長凝固時間，而啟動抑制步驟"下遊"級聯反應就不會影響凝固時間。因此，單一蛋白質以及複合物的抗凝血活性可以定位在級聯反應一定的活性階段(圖6B-D)(詳情請參閱參考文獻32,33)。在凝血酶原時間試驗中，hemextinA能夠延長凝血時間，具有緩和的抗凝血作用，但是卻不能延長蛇毒止血時間以及凝血酶時間(圖6B)。如我們所預料的，hemextinB在凝血酶原時間試驗、蛇毒止血時間試驗以及凝血酶時間試驗中都不能延長凝血時間(圖6C)。在凝血酶原時間試驗中，hemextinAB複合物具有延長凝血時間的有效抗凝血活性。然而，在其它2種試驗中，凝血時間卻不受影響(圖6D)。這些結果表明hemextinA和hemextinAB複合物僅僅影響外在的複合物，而不能影響凝血酶原酶複合物或不能將纖維蛋白素原轉換成纖維蛋白凝塊。為了確定抑制作用位點，因此測定了hemextinsA和B以及它們的複合物對TF-FVIIa複合物的作用(圖7A)。在高濃度時，hemextinA具有更為緩和的抑制活性。與其相反地，hemextinB對外源的tenase複合物的酶促作用不具有任何抑制活性。然而，hemextinAB複合物在ICs。(抑制50%活性的抑制劑的濃度)的值為100nM時，具有完全的抑制外源性tenase活性(圖7A)。在後面的篩選試驗中，都未觀察到單一蛋白或複合物介導的對FXa醯胺酶活性的抑制作用(見下文)。我們釆用類似的滴定試驗來確定hemextinAB複合物形成對TF-FVIIa複合物的抑制。HemextinsA的濃度保持50不變，通過增加hemextinB的濃度來確定其對外源性的tenase活性的抑制作用。如圖7B所示，hemextinA的抑制活性隨著hemextinB濃度的增加，直到比率為1:1。額外繼續添加並不能增加抗凝血作用。該結果表明，hemextinsA和B形成1:1的複合物，並且該複合物形成是抗凝血活性有效的關鍵。hemextinsA和B等摩爾比值後額外增加並不能增加抑制活性。這些發現進一步確定了hemextinsA和B之間複合物形成的重要性。為了解磷酯的作用，我們監測了存在或不存在sTF情況下，hemextinA和hemextinAB複合物對FVIIa醯胺酶活性的抑制作用。在兩種情況下，我們觀察到劑量依賴方式的有效抑制活性(圖8A和圖8B)。#^闢##絲一釆用12種絲氨酸蛋白酶來篩選確定hemextinA和B以及它們的複合物來確定抑制的特異性。如圖9所示，除FVIIa以及血漿激肽釋放酶外，對任何其它的絲氨酸蛋白酶都不具有抑制活性。在FVIIa存在情況下，hemextinA和hemextinsAB複合物以劑量依賴的方式抑制血漿激肽釋放酶(圖10)。hemextinB不具有抑制血漿激肽釋放酶活性。然而，對FVIIa(存在或不存在sTF情況下)抑制的有效性至少比對血漿激肽釋放酶高50倍。一一為了確定抑制的機制，採用測定hemextinAB複合物對sTF-FVIIa複合物在底物S-2288醯胺酶活性的抑制動力學。動力學試驗顯示hemextinAB複合物非竟爭性的抑制FVIIa-sTF的活性。Lineweaver-Burk圖顯示隨著抑制劑濃度的增加，V皿x減少，而Km保持不變(圖IIA，表2)，該特徵是非竟爭性抑制劑的特徵。測定的抑制K,值為25nM(圖IIB)。同時計算了不同濃度抑制劑的酶變率(Keat)(每分鐘每產生一摩爾酶的底物的摩爾數)。在觀察到經典的非竟爭性抑制中，Kw隨著hemextinAB複合物濃度的增加而降低(表2)。由於單獨地FVIIa醯胺酶活性非常低(34),因此我們沒有單獨研究hemextinAB複合物對FVIIa醯胺酶活性的抑制動力學。表2tableseeoriginaldocumentpage56ITC試驗一我們同時還監測了隨著hemextinAB複合物與FVIIa結合引起的熱力學變化(圖12)。該結合為放熱過程，其中////=-7.931kcal.M"^G;7.543kcal.M"，AS;1.25kcal.]Vr1。計算獲得的結合尺值為4.11xl05M"。複合物形成過程中的構象變化一研究表明hemextinA和hemextinB相互作用形成1:1四聚體複合物，該複合物的形成具有能夠抑制FVIIa以及凝血啟動的能力，因此非常重要(74)。我們利用遠UV-CD來檢測hemextinAB複合物形成過程中的構象變化。首先，記錄了單一hemextinA和B在不同濃度下的單個CD譜(圖14A和圖14B)。hemextinA和hemextinB在217nm處為負的最小，在196nm處為正的最大，這主要是由於各自醯胺生色團的；c—兀*以及11—兀*的轉變，具有代表性的是P-摺疊結構(圖14A和圖14B)。然而，在高濃度時的兩種蛋白質中都觀察到了聚集作用(圖14A和圖14B)。接著，採用滴定CD試驗來研究兩種蛋白質複合物的形成。在該試驗中，hemextinA的濃度保持0.5mM不變，記錄添加不同濃度的hemextinB時hemextinA的構象發生變化(圖14C和圖14D)。隨著hemextinB的增加，P-摺疊結構數量增加。因此，hemextinAB複合物表現出更穩定的(3-摺疊結構。當hemextinA與hemextinB的濃度達到1:1時，再添加hemextinB，光譜並未觀察到明顯變化(圖14C)。因此CD試驗表明hemextinAB複合物的形成伴隨著P-摺疊構象的穩定，並確定了L1的化學量論。複合物形成過程中分子直徑的改變一利用氣相和液相來測定單一hemextins以及hemextinAB複合物的直徑。利用GEMMA氣相來測定它們的電泳遷移率，hemextinA和hemextinB具有近似的大小分別為10.2±0.38nm和8.82±0.42nm的分子直徑(圖15)。hemextinsAB複合物的直徑較大，為16.3士0.43nm。由於GEMMA是研究蛋白質互作的較新技術(75),因此通過測量位於hemextinA和hemextinB的分子直徑上的另外一種蛋白質(毒素C，從R力aemac/wrt^毒液中分離的到)來進一步驗證實驗結果。通過凝血酶原時間試驗(數據來顯示)確定毒素C不影響抗凝血活性，也不與hemextinA形成複合物。利用GEMMA技術，毒素C在等摩爾濃度下不影響hemextinA或hemextinB的分子直徑(圖14)。釆用DSL技術測定了位於50mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)的單一hemextin以及hemextinAB複合物的鈴動力直徑。通過對hemextinA，hemextinB和hemextinAB複合物的單一態散射(單眾數分布)的觀察，顯示樣品製備的同質性，流體直徑分別為10.3nm，9.9nm和16.8nm(圖16A)。HemextinA和hemextinB—混合，就出現了單分散性大分子(表現為分布較狹窄)，由此說明了定義明確的複合物的形成。然而，hemextinAB複合物的大小與估計的四聚體大小相比小很多，由此說明該複合物為剛性結構(76)。//ewW/"JS,^參^4'欣煞力夢一利用ITC技術來測定複合物形成的熱力學。每次注射都是放熱反應(圖17)。結合等溫線擬合為單一的結合位點模型，由此說明hemextinA和B之間為等摩爾結合。hemextinA和hemextinB的互作在熱力學上是允許的(由放熱自由能改變表明)(表3)。有利的焓放熱，但是不利的熵變放熱，說明該複合物的形成受焓驅動。另夕卜，正如通過GEMMA和DLS試驗數據表明，放熱熵變確定了剛性複合物的形成。hemextinAB複合物形成中觀察到的結合常數(《。)為2.23x106M",在生物學有關過程中《。值隨著蛋白質互作而降低，其範圍為104to至1016M"(70)。表3tableseeoriginaldocumentpage59^參,M^參裙一試驗溫度可能影響若干蛋白質與蛋白質、蛋白質與肽的互作的量熱焓。採用溫度範圍為10-45。C來研究hemextinA與hemextinB結合的溫度依賴性，在圖18A和表3中顯示了體現溫度作用的熱力學參數焓(zl//)、熵(AS)和自由能(z/G)。在所有溫度下，複合物的形成都是焓驅動的。依賴於溫度的數據可以用作測定複合物形成熱容量的改變(zfC^5A///57)。在這個溫度範圍內zf/Z對溫度的曲線是線性的(圖18A)。HemextinA與hemextinB結合的線性產率的傾斜JCP為-nVcalmorideg^結合反應得z/Cp較小表明剛性複合物的形成(77'78),這也同樣支持了前面的試驗觀察結果。同樣地，在蛋白質與蛋白質互作中經常可觀察到負的熱容量變化，這主要歸因於溶劑的易疏水表面被覆蓋(7Q'。不同溫度下，hemextinA與hemextinB結合的d/Z與z!5"比值的曲線圖顯示約1.1的斜率(#激，圖18B)，該斜率是蛋白質與蛋白質結合過程中常見的(79—83),它主要是由於焓/熵的代償作用。這由大量的高zlCp值直接導致的，因為(&d//"A57)p=z/Cp並且f^T^S」/^r入zi(^+z^,因此如果^Cp》zf/f和TAS隨溫度變化大體上應一致(=^(^),並且可以相互補償。在測定的溫度範圍內，z/G變化最小(圖18A)。通常AH和AS的值為負值，這再一次說明了hemextinA與hemextinB的結合傾向於焓變而不是熵變。z/H對溫度呈線性相關表明解離和結合形式平衡的兩種狀態的結合過程。菱冷放漆子眾伊^^/,^參^^'闢,裙一這種觀察到的量熱焓變是由於結合反應以及其它所有的相關反應導致的(水結合(解離)作用、物質的電離作用、稀釋以及混合的產熱等)。為了利於結合，內表面胺基酸殘基可以質子化或去質子化，從而導致緩衝液中質子的交換。在這種環境下，由於量熱焓主要依賴於緩衝液電離作用焓，所以量熱滴定主要在磷酸鹽以及MOPS，pH7.4的緩衝液中進行。在複合物形成過程中，觀察到焓變C^U,)(表3)隨著緩衝液離子化焓變(^"。)的增加而增加。量熱焓對應於參與互作的質子("h+)的電離作用焓以及結合焓按照下面關係式被校正為質子化作用(zl/4.)曲線。=J/4+"h+JMo"……(Eq.4)正性斜率表明從緩衝液中攝取質子的傾向，負值表明釋放質子到緩衝液的傾向。該曲線(圖19A)表明了複合物形成的值"h+為-0.57,結合焓0d/4J為-3.638kcal/mole。因此，hemextinAB複合物形成與純質子釋放到緩衝液相關。/^附e勸力爿5^^參#^教,^#互伊^—靜電相互作用對蛋白質與蛋白質的互作起著重要作用，它提供了結合界面的特異性。利用ITC、SEC以及DLS來評估複合物的靜電相互作用。首先，hemextinAB複合物形成的結合常數是通過ITC在增加離子強度的緩衝液中完成的。利用不同濃度的NaCl來改變緩衝液的離子強度。複合物形成的log&值隨著NaCl濃度的增加線性下降(圖19B，表3),表明複合物形成過程中靜電作用參與的可能性。其次，通過SEC來測定緩衝液離子強度對hemextinAB複合物組合的影響。如前所述(74)，hemextinA和B洗脫物為四聚體複合物，而單一的hemextins洗脫物為單體(圖20A)。利用含有不同濃度的NaCl的緩衝液洗脫的複合物來研究複合物形成的靜電相互作用的功能。如圖20B所示，75mMNaCl可以促使四聚體解離成二聚體。在高離子強度下(NaCl150mM)的複合物洗脫物大多數為二聚體和單體形式。利用ESI-MS和HPLC分析得出二聚體的峰值表明同時含有兩種hemextinA和B(數據未顯示)。該結果再次說明了靜電相互作用可能參與了hemextinAB複合物的形成。有趣的是，另外的峰值蛋白質洗脫速度比單體慢，表明在高離子強度的緩衝液中hemextinA和/或hemextinB經歷了構象的變化。因此，我們分析了高離子強度下的緩衝液對單一hemextinA和B的洗脫譜。hemextinA在75mMNaCl濃度下具有2個峰；第二個峰蛋白洗脫比單體要慢。利用150mMNaCl濃度洗脫hemextinA大多數位於第二個峰。利用ESI-MS和HPLC分析第二個峰表明結構上是完整的hemextinA(數據未顯示)。因此，高離子強度緩衝液的hemextinA洗脫譜的改變暗示了蛋白質構象的改變，並用1DNMR試驗進一步驗證了該結果(見下文)。然而，緩衝液離子強度的增加，對hemextinB的洗脫沒有影響(圖20A和圖20B)。利用DSL同樣測定了高離子強度緩衝液中的hemextinAB複合物以及單一hemextin的流體直徑(圖16B)。在高鹽濃度下，hemextinAB複合物表現出高多分散性表明不同形式物質的存在。在75mMNaCl濃度下，至少存在3種不同形式的物質；除了單體和四聚體外，還存在表觀分子直徑為12.4nm的一類物質。基於SEC的結果(圖20B)，直徑為12.4nm的物質可能是二聚體hemextinAB複合物。正如所預料的，當NaCl濃度增加到150mM時，直徑為12.4nm的物質的數量增加(圖16B)。並且，DLS數據同樣也表明四聚體複合物向二聚體的解離。有趣的是，在高離子強度緩衝液中的hemextinA也存在多分散性(圖16B)。另外對於它本身大小10.4nm外，還存在一類大小為11.57nm的微粒。通過SEC(圖20B)以及ID-NMR(見下)可以表明11.57nm的這類物質可能是hemextinA構象改變的形式。隨著緩衝液離子強度的改變，並未觀察到hemextinB流體直徑的變化(圖16B)。這些結果表明，隨著濃度的增加，四聚體複合物解離為二聚體和單體。解離很可能是由於亞基靜電相互作用的幹擾和/或hemextinA構象的改變所致。我們利用測定高離子強度緩衝液的複合物和單一hemextin的抗凝血活性來解釋hemextinA構象的變化以及四聚體複合物的解離。隨著NaCl離子強度增加到100mM(圖21A),hemextinAB複合物的抗凝血活性降低。然而，鹽濃度的進一步增加並不能顯著影響抗凝血活性。在150mMNaCl濃度時，複合物存在的混合物有二聚體，單體以及構象改變的hemextinA(圖20B)。然而，高濃度的NaCl不影響hemextinA的抗凝血活性(圖21A)。因而，儘管構象發生了改變(見下)，hemextinA仍然維持其抗凝血活性。因此，由於hemextinA的存在，在NaCl為150mM濃度時仍然觀察到了抗凝血活性。從這些結果可以得出如下結論在高鹽濃度下形成的二聚體對抗凝血活性無任何意義。/zemex"",^參、闢處^絲*互#^—疏水性相互作用是複合物形成的驅動力。仍然用ITC，SEC和DLS測量複合物形成的疏水性相互作用的重要性。ITC試驗在濃度增加的甘油緩衝液中進行。甘油在蛋白質周圍形成疏水層，因此抑制疏水性相互作用。隨著甘油濃度的增加，結合常數下降(圖19C和表3)，表明複合物形成時疏水性相互作用的重要性。通過Superdex75過濾柱來測定hemextinAB複合物在含有甘油的緩衝液中的洗脫(圖20C)。在含有高甘油濃度的緩衝液中，四聚體解離成二聚體或單體。ESI-MS和HPLC方法分析得到的二聚體峰表明其含有hemextinsA和B兩種物質(數據未顯示)。然而，未觀察到構象改變的hemextinA所對應的另外的峰。單一hemextin在甘油中的洗脫保持不變(圖20C)。在DSL試驗中還觀察到在甘油存在下hemextinAB複合物的解離(圖16C)。在125nM甘油濃度下，除了觀察到單體和四聚體複合物外，還觀察到大小為12.8nm的一類物質。根據SEC試驗推測12.8nm的這類物質為二聚體。大小為12.8nm的這類物質隨甘油濃度的增加而增加(圖16C)。值得注意的是，這類二聚體與在高離子緩衝液條件下形成的二聚體的表觀分子直徑不同(12.8nm比12.4nm;圖16B和圖16C)。(由於GEMMA工作原理基於納-ESI，因此不能用此方法測量含有高鹽以及高甘油緩衝液的分子直徑)。在甘油緩衝液中，未能觀察到單一hemextin的多分散性(圖16C)。這些研究表明疏水性相互作用對hemextinAB複合物的形成起著重要作用。釆用測定含有不同濃度甘油的緩衝液的單一hemextin來進一步理解hemextinAB複合物的解離以及其抗凝血活性。隨著甘油濃度的增加，hemextinAB複合物的抗凝血活性降低(圖21B)。當甘油濃度為125mM時，複合物的抗凝血活性沒有降低。當甘油濃度為250mM時，複合物的抗凝血活性雖然有所降低，但是其仍然比單一hemextinA的活性高。此外，單一hemextin的抗凝血活性不受甘油的影響(圖21B)。SEC分析顯示在甘油濃度為250mM時，複合物的組成為二聚體和單體的混合形式(圖20C)。當甘油濃度為250mM時，二聚體的抗凝血活性高於單一的hemexdnA,但是低於四聚體。因此，甘油中形成的二聚體與在鹽溶液中形成的不同；並且甘油中形成的二聚體的抗凝血活性比單一的hemextinA高，而後者中形成的二聚體卻不是。菱^放殺/f身/^me;c"ra——前面SEC(圖20B)和DLS(圖16B)的研究表明，在鹽溶液緩衝液中，hemextinA的構象發生了變化。因此，利用ID-NMR試驗來分析不同緩衝液條件下hemextinA和B構象的變化(圖22)。在NaCl存在的條件下，在4.8ppm和6ppm之間的Ha共振峰數量減少(圖22A)。不同胺基酸殘基之間形成所有三指毒素中常見的反平行|3摺疊結構，這樣使得Ha之間胺基酸殘基出現NOE交叉峰，進而引起化學位移(84)。因而，在NaCl存在情況下觀察到了hemextinAp摺疊結構減少。另外，側鏈化學位移也發生了幾處改變。一個顯著的改變就是，鹽存在的情況下，在負的化學位移值(-0.38ppm)處出現一個高的隔離的甲基峰。這些發現更有力地支持了在NaCl存在下，hemextinA的構象發生改變。在添加甘油後(氘化的)，hemextinA的ID質子核磁共振光譜整體分布仍然抑制，只是在醯胺區域發生微小的改變(圖22A)。因此，在添加甘油後，hemextinA的構象並未發生明顯的改變。對hemextinB釆用相同的試驗，結果顯示在NaCl或甘油存在下，由於光譜頻率幾乎都是一一配對的，所以其構象都未發生任何改變(圖22B)。討論在機體受傷或創傷之後，凝血的啟動是生物體存活的保證。然而，非必要血塊的形成是有害的，因此需要抗凝治療。目前釆用的治療此類病症的抗凝藥都是非特異性的，並且有效藥濃度範圍很窄，因此需要嚴格仔細的實驗監控來達到最佳的藥效以及最大限度的減少出血。其還並發於其它因素如飲食(35)。因此，人們努力尋求一種新的抗凝劑以及抗血小板試劑。由於FVIIa是血液凝固的關鍵啟動因子，並且其在血漿中濃度非常低，因此其是抗凝劑設計以及研製的藥靶。到目前為止，僅鑑定出兩種能特異性的抑制TF-FVIIa的蛋白質，它們分別是組織因子通道抑制劑(TFPI)以及線蟲抗凝肽c2(NAPc2)。TFPI是該複合物的內源性的抑制劑(36),而NAPc2是外源性的抑制劑，它分離自犬十二指腸蟲」wc_y/oWomaca"/m/m(37)。TFPI大小為42kDa，其是由三個串聯的Runitz型結構域組成的一種血漿糖蛋白。其第一和第二結構域能夠分別抑制TF-FVIIa和FXa。該分子的第三個Runitz結構域以及C-端的鹼性區域具有肝素的結合位點'38'。TFPI的抗凝血作用分為兩步。首先第二Runitz結構域與分子FXa結合使其失去活性。接著第一結構域迅速與臨近的TF-FVIIa複合物結合，阻止FX的進一步的激活(3941)。另外，NAPc2是一種大小為8kDa的短肽。它作用的機制是其首先必須與FXa或酶原FX結合形成一種二元的複合物，然後才能與膜結合的TF-FVIIa互作並抑制其活性"2)。因此，儘管結構上存在差異，這兩種抑制子都與TF-FVIIa-FXa形成四元的複合物。然而，在兩種複合物中，FVIIa的活性位點被各自的抑制子覆蓋而不暴露在外。由於缺乏天然能夠特異性幹擾FVIIa活性的抑制子存在，所以人們設計和製造了大量的人工合成抑制子。它們包括那些能夠阻止TF和FVIIa結合的蛋白質，諸如抗TF或FVIIa的抗體，TFAA(對FX不具有輔助因子作用的TF突變體)，FFR-VIIa(比天然的FVIIa對TF具有髙5倍親和力的非活化形式的FVIIa)以及來自TF或FVIIa的肽類""，另外，還發現了兩個系列的肽外結合位點抑制子，它們條選自噬菌體展示文庫，具有與TF-FVIIa複合物結合的能力"3-44)。它們與FVIIa的絲氨酸蛋白酶結構域的兩個不同的外結合位點結合，表現出空間及其構象的抑制(46)。儘管兩類肽能夠有效並選擇性地抑制TF-FVIIa複合物，但是即使在飽和濃度下也不能100%的抑制其活性。這個問題已經通過兩類肽的融合(47)或利用蛋白酶調控底物噬菌體(45)解決了。人們設計了大量的能夠抑制FVIIa以及TF-FVIIa複合物活性位點的合成化合物(48'51—54)。近來，有報導多種甲萘脒對FVIIa活性具有抑制作用。它們是通過脒基苯甲醛類似物與聚苯乙烯樹脂偶聯而成。然而，雖然這些合成的化合物能夠抑制FVIIa的活性，但是它們卻仍然對其它凝血絲氨酸蛋白酶具有非特異性的抑制(55)。這裡介紹了來自力aemac/^/M毒液的兩類蛋白質hemextinA和hemextinB的分離和鑑定，以及由於協同作用引起的抗凝血作用。hemextinA和hemextinB都屬於蛇毒蛋白三指家族(圖3)。尤其地，只有hemextinA具有較為緩和的抗凝血活性，而hemextinB不具有抗凝血活性(圖4A)。然而，hemextinB能夠協同增強hemextinA的抗凝血活性，並且它們的複合物表現出更有效的抗凝血活性。在添加hemextinB後hemextinA抗凝血效果的增加(圖4A)說明兩種蛋白質之間可能形成複合物。利用凝血酶原時間試驗分析得出1:1的複合物的形成對有效的抗凝血活性至關重要(圖4B)。利用凝膠過濾色譜法進一步確定了複合物的形成(圖5)。禾擁"剖分法"(32'33),鑑定出hemextinA及其增效複合物的抗凝血作用位點(圖6A)。利用三種普通的凝血時間試驗得出，hemextinA和hemextinAB複合物能夠抑制外源性的tenase複合物，但在外源途徑中沒有其它的步驟(圖6B-D)。利用hemextinA及其複合物對重組的TF-FVIIa複合物的作用進一步驗證了該結果。hemextinAB複合物以及hemextinA都能抑制依賴於重組的外源性的tenase複合物的FXa的形成(圖7A)。有趣的是，hemextinA和hemextinAB在sTF存在與否的條件下都能抑制FVIIa的醯胺酶活性，其IC5Q分別約為100nM和105nM(圖8A和圖8B)。幾乎相同的ICso值表明hemextinA和hemextinAB複合物並沒有與FVIIa的輔助因子結合位點結合。hemextinA和hemextinAB複合物的抑制活性可能不是由於hemextinA或hemextinAB複合物與外源性的tenase複合物的磷脂的非特異互作，由於它們不能抑制磷脂表面仍然形成的促凝血球蛋白複合物，所以不能延長蝰蛇毒止血時間。該結果通過測定hemextinA和hemextinAB複合物對利用sTF和FVIIa重組的外源性的tenase複合物的醯胺酶活性來進一步驗證了(圖8A)。此外，hemextinA和hemextinAB複合物能夠抑制FVIIa的醯胺酶活性。然而，hemextinB在缺乏hemextinA的情況下不具有任何的抑制活性。為了進一步的鑑定抑制特性以及確定抑制的特異性，我們將hemextinsA和B以及hemextinAB複合物進行抗12種絲氨酸蛋白酶篩選。除了FVIIa及其複合物外，hemextinA以及hemextinAB複合物還具有依賴於劑量方式的對激肽釋放酶的醯胺酶的活性的抑制。然而，激肽釋放酶的抑制IC5o值為約5(iM，而FVIIa/FVIIa-TF/FVIIa-sTF的抑制ICso值為約100nM。動力學研究顯示hemextinAB複合物對FVIIa-sTF複合物的抑制是非竟爭性的，其Ki值為25nM。ITC試驗表明hemextinAB複合物能夠直接與FVIIa互作。FVIIa和hemextinAB複合物之間的結合互作伴隨著自由能的負變化，由此表明該複合物形成是有利的。結合的熵負向變化表明兩組分之間緊密摺疊複合物的形成(56)。因此，這些數據更有力的表明hemextinAB複合物是FVIIa的高特異性的天然抑制因子。一些其它的來自蛇毒的抗凝血劑同樣能夠抑制外源性tenase複合物。然而，它們不具有特異性。例如，CMIV，其是一種來自A^a"/ghco/fc的強抗凝血磷脂酶A2(PLA2)，它能通過抑制兩步連續的凝血連鎖反應從而能夠延長凝血時間。它對TF-FVIIa複合物的作用具有酶的和非酶的兩種機制(57),然而其對凝血酶原酶複合物的抑制只有非酶的機制(58'59)。這裡首次介紹了hemextinA及其增效複合物，它們能夠特異性的抑制來自蛇毒的FVIIa。相同的對TF-FVIIa複合物和FVIIa的劑量依賴性抑制表明，hemextinAB複合物的抑制活性既不需要TF的參與也不幹擾TF和FVIIa的結合。與TFPI和NAPC2不同的是，它與FVIIa的結合不需要以FXa為支架，因此對FVIIa的抑制不需要FX或FXa的參與。此外，TFPI和NAPC2能夠與FVIIa的活性位點結合。相反，hemextinAB複合物是一種非競爭性的抑制子，所以它不通過與活性位點結合而互作。因此，hemextinA以及hemextinAB複合物是FVIIa以及TF-FVIIa複合物的新的抑制因子。CD研究表明該複合物形成使得(3-摺疊結構趨於穩定(圖14)。這種相互作用也導致剛性結構的形成。這反映在構象熵損失與hemextinAB複合物的形成相關聯(表3)。GEMMA和DLS研究表明在氣相和液相實驗，複合物形成期間表觀分子直徑均增加(圖15和16)。由這些技術得到的分子直徑幾乎是同等的。然而，表觀的分子大小比天然蛋白質理論估計的直徑大許多，並比完全"伸展構造"的估計長度小很多(85,86)。這種異常應歸於該蛋白質的非球狀結構(87)。ITC為研究大分子在溶液中的相互作用提供了可能，並且它是唯一能夠分辨結合親合性的焓和熵部分並由此分辨在初始和最終狀態之間的吉布斯自由能差異。由d/Z傾向於負變化鑑定了hemextinA和hemextinB之間的相互作用。因而，範德華相互作用和氫鍵在該複合物的形成中起著重要的作用。hemextinA和hemextinB之間相互作用觀察到的有力參數顯示其對試驗溫度的具有強依賴性。儘管在焓和熵隨著溫度改變中觀察到差異，自由能變化仍然是最小(圖18A)5暗示焓-熵的補償。弱的分子間相互作用經歷不斷地重排實現結合自由能降低(91-93),這種現象在蛋白質-肽相互作用中是一種常見特徵。圖18B顯示大量蛋白質-蛋白質系統互相作用的熵和焓之間的這種相關性(一=0.956)。hemextinAB複合物形成的數據沿於這條相關線。根據熱力學定律，對J//和的溫度依賴性是由於z!CP的改變。在幾乎所有的蛋白質關聯過程中，如果以游離組分作為基準則z!Cp為負號(94)。在hemextinAB複合物形成中觀察到結合的JQ為-177-calmol-deg"。負z/Q的改變顯示非極性溶劑可及表面積的減少，其按照如下方程式(95):zlC>=6U50掘，J-0.26(2L4;/」cfl//mo/K..........(Eq.5)其中，z^W—和z^5^。p。,分別是極性和非極性可及表面面積的變化。大的負的JQ變化已在蛋白質-肽相互作用、受疏水作用支配的蛋白質摺疊(96'97)以及與溶劑暴露的疏水殘基的掩埋相關的複合物形成(8'81'98'99)中觀察到。相反，極表面面積的掩埋有助於產生弱的正JO。hemextinAB複合物形成的z/Q是負值，雖然弱於典型蛋白質-蛋白質相互作用(7)。負的^Q支持這種由Tanford提出的疏水作用標準模型，並且其隨著溶劑分子的重組，從而增加溶解熵。這個過程與在hemextinA-hemextinB相互作用中觀察到的不利zLS相矛盾。然而，這種現象在蛋白質-蛋白質相互作用中並不是罕見的，111Q)。這種觀察到的不利JS可能是由於發生在hemextinA和/或hemextinB的結合(圖14)和/或由於在互相作用蛋白質接觸面的水分子的結合。Ladbury等認為這種在高度水化的特定內表面內水分子的自由度的限制將會對JCp產生實質的負面影響，如同在多個蛋白質-蛋白質複合物中觀察到的那樣(8，112-114)。水分子在內表面通過氫鍵擔當介於蛋白質和配體之間相互作用的分子橋(113'115)或改變蛋白和配位體表面形狀互補性(116,117)。hemextinAB四聚體在高鹽的情況下解離為二聚體和單體(圖19B,20B,16B,21A和表3)。因而，直覺地懷疑庫倫相互作用參與複合物形成。然而，當由極性基團之間的相互作用支配結合時，將產生弱的正zlC屍。相反，觀察到的JQ負值與通過螯合水分子形成的包含"橋"氫鍵的一種結合界面形成相一致，或與發生的結合構象變化相一致。如同hemextinA在鹽存在的情況下發生構象變化(圖22A和23A),四聚體在高離子強度緩衝液中的解離可能是由於hemextinA的構象變化。然而，靜電相互作用在複合物形成中的作用是不能被排除的。hemextinAB四聚體在有甘油參與的情況下也解離成二聚體和單體(圖20C，19C,16C和21B)。因而疏水性相互作用在該複合物形成中起重要作用。這同時支持在ITC實驗中不同溫度下觀察到的負的z/Cp的變化(圖18A)。此外，這種解離不是由於hemextins的構象變化，因為甘油不影響單一hemextin的構象(圖22和23)。因此，疏水性相互作用可能提供該複合物形成的驅動力。Aeme勸'"爿5——分別來自hemextinA和B的各兩如前所述，hemextinAB二聚體在高鹽中不同於在有甘油參與的情況下成形的二聚體。前者二聚體表觀的分子直徑為12.4nm且缺乏抗凝血活性，而後者二聚體表觀的分子直徑為12.8nm並且展現出稍微較高的抗凝血作用(圖23)。因而，四聚體解離為二聚體可能發生在hemextinA和B之間相互中用的兩個不同面中。一個面對其環境的離子強度靈敏，而另一個對甘油靈敏(圖23)。此外，在有鹽參與的情況下，hemextinA經歷一種能干擾四聚體形成的構象變化(圖23)。在高離子狀態下成形的二聚體缺少抗凝血位點(圖23中由虛線半圓形標記)。相反，在第二個面中疏水性相互作用佔優勢。因此，甘油離解四聚體成二聚體。然而，這樣唯一的微小變化發生在複合物的抗凝血位點(如圖23所示)，由此生成的二聚體是具有活性的。四聚體形成很可能穩定hemextinA的抗凝血位點。在蛇毒蛋白中特別是突觸前神經毒素，複合物形成和增效作用已為大家所熟知。一些蛇毒複合物是一來源於Crato/Mdwn^ms^r^a^的響尾蛇毒素(6)，來源於a^wra"w^o^〃a^s的泰攀蛇毒素(61),來源於Ca〃(we/OTmaAocfoWomfl的紫紅殺菌素(rhodocetin)(64)，來源於澳大利亞的蛇的C組凝血酶原激活劑。從Crato/w^nhw^T7yo^毒液中分離得到的響尾蛇毒素，包含兩個亞單位；鹼性的亞單位是一種PLA2酶，而酸性的亞單位無催化活性(雖然它源自於一種PLA2類似蛋白),。單一組分只有鹼性亞單位略有毒，而其複合物顯示出有效毒性。酸性亞單位看起來作用就象侶伴蛋白並提高鹼性亞單位特異結合到突觸前的位點上。類似地，其他突觸前的神經毒素，諸如源自(9x，raw^scw/e〃art^的泰攀蛇毒素(61)和源自/^eWowq/a^勸'fc的組織毒素(textilotoxin),毒液分別包含三個和四個亞單位。所有這些亞單位在結構上均類似於PLA2酶。這種在這些毒素亞單位之間的非共價相互作用對他們的有效毒性是重要的。因此，許多蛇毒突觸前毒素是與作為整合部分的PLA2的蛋白質複合物。另一種從(9.so^〃aft^毒液中分離的蛋白複合物泰傑蛇毒素阻遏鉤通道，並且它具有PLA2、蛋白酶抑制因子和神經毒素(一種三指毒素)亞單位(63)。在蛇毒中只有少數非共價蛋白複合物不包含作為整合部分的PLA2。例如，一種來自Ca〃ose/oswaMo必Woma毒液中的抗血小板蛋白質複合物紫紅殺菌素，包含兩個亞單位，其顯示與C-型外源凝集素具有結構相似性。源自澳大利亞的蛇的C組凝血酶原激活物是促凝血的蛋白質複合物，其在結構上和功能上類似於哺乳動物血液凝結劑FXa-FVa複合物(65—67)。紫紅殺菌素是一種抗血小板的蛋白質複合物，其是一種C型凝集素有關蛋白質的異源二聚體^"。PseutarinC是一種在在結構和功能上類似於哺乳動物FXa-FVa複合物的促凝血複合物"5—66)。在剩餘的情況中，各亞單位通過未鑑定的非共價相互作用結合在一起。HemextinAB複合物是第一個從蛇毒中分離的抗凝血複合物，其hemextinA的抗凝血活性通過hemextinB的協同作用得以加強(74)。在不需要FX支架的條件下，其特異性地並非竟爭地抑制FVIIa。因而，這是首次獲知FVIIa的天然蛋白抑制劑。在結構上，其是唯一獲知的由兩個三指毒素形成的四聚體複合物(74)。由於複合物形成對凝結啟動的協同作用是必不可少的，因而闡明支配這種獨特複合物形成的分子間相互作用是重要的。總之，這裡介紹了一種來自蛇毒的獨特抗凝蛋白複合物，其能特異性和非竟爭地抑制FVIIa活性。其結果有力地支持了hemextinA和B之間的相互作用對有效抗凝血活性是必不可少的。通過多種生物學手段鑑定了這種介於兩種緊密關聯的三指毒素之間的獨特蛋白-蛋白複合物。圓二色性研究表明複合物形成使得P摺疊趨於穩定。HemextinAB複合物是剛性的，其形成由焓驅動。熱容量為負值表明氫鍵的存在以及構象變化的發生。疏水性相互作用主要驅動複合物形成的過程，但是複合物的穩定性也依賴於其環境的離子強度。在甘油或鹽存在的情況下四聚體解離成二聚體。在鹽存在的情況下而具體的形成似乎不同於甘油；他們的表觀分子直徑不同，並且表現出不同的抗凝血特性。在鹽存在的情況下複合物的解離可能是由於hemextinA的構象變化。基於這些結果，現提出一種定義hemextinAB複合物裝配的模型。有益地，這種新抗凝血劑能促進不同策略和抑制血液凝固啟動藥物的發展。本研究還使得這種蛋白複合物的結構-功能關係更為透徹。應能理解，實施例僅用於說明本發明，在不背離本發明範圍和精神的情況下仍可對其進行修改。參考文獻1.Davie，E.W"Fujikawa,K.,和Kisiel,W.(1991)所oc/^w&^y30,10363-103702.Mann，K.G.，Butenas,S.，和Bru匪el，K.(2003)爿Wen'oyc/^:J7/rom6.P^2wc.5z'o/.23，17-253.Davie，E.W.(1995)T7畫6.i/畫oW.74，1-64.Rapaport,S.I.和Rao,L.V.(1995)77zraw6.//aemoW.74，7-175.Morrissey,J.H.，Macik，B.G"Neuenschwander,P.F.，和Comp，RC.(1993)5/oM81,734陽7446.Nemerson,Y.(1988)萬W71,1-87.Mann，K.G.，Butenas，S.，和Brummel,K.(2003)爿Wen.asc/eKrArowiZj.腸c.廳.23，17-258.Gustafsson,D.，Bylund,R.，Antonsson,T,，Nilsson,L,Nystrom，J.E.,Eriksson,U.,Bredberg,U.，和Teger-Nilsson,A.C.(2004)iV^ev.Z^wg.rfecov-3,649-6599.Hirsh,J.(1991)iV.五"g/./.MW.324,1565-157410.Hirsh，J.(1991)A^wgL/.MW.324,1865-187511.Hirsh,J.和Weitz，J.I,(1999)丄a"c^353，1431-143612.Mol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