具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的多肽及其編碼基因與應用的製作方法

2023-06-01 16:14:06

專利名稱：：具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的多肽及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的多肽及其編碼基因與應用，特別是涉及一種來源於大豆NAC類轉錄因子家族的抑制轉錄因子的轉錄激活活性的相關多肽及其編碼基因與應用。
背景技術：
：轉錄因子又稱反式作用因子，它可以通過結合特異的DNA元件來調控下遊基因的轉錄。一些轉錄因子起轉錄激活作用，一些起轉錄抑制作用，而另外一些既有轉錄激活活性，也有轉錄抑制活性。研究轉錄因子的轉錄調控域，對於了解轉錄因子的作用方式和生物功能非常重要，既有理論意義，也非常有應用價值。例如當已知某一序列與抑制轉錄因子的轉錄激活活性相關時，就可將其加在某個轉錄因子的前/後面，使其失去轉錄激活活性，分析表型的改變即可了解其功能；同時通過調控該基因的轉錄水平，可達到所需植物表型的目的。
發明內容本發明的一個目的是提供一種來自大豆NAC轉錄因子的具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的多肽及其編碼基因與應用。本發明所提供的抑制轉錄激活活性多肽，名稱為NARD(NAC-Active-Impression-Domain)，來源於大豆屬大豆(Glycinemax(L.))，是如下l)或2)的多肽1)名稱為NARD，由序列表中SEQIDNs:2所示的胺基酸殘基組成的多肽；2)序列表中SEQIDNs:2的胺基酸殘基序列經過一個或十幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的由SEQIDNS:2衍生的多肽。上述2)的多肽可以是下述A)、B)或C)之一A)名稱為NARD(1/16)，由SEQIDN2:2的自氨基末端第1-16位胺基酸殘基組成的多肽；B)名稱為NARD(1/22)，由SEQIDNs:2的自氨基末端第1-22位胺基酸殘基組成的多肽；C)由序列表中SEQIDNq:2的胺基酸殘基序列經過一個到十九個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的由SEQIDN2:2衍生的多肽。上述C)具體可以是如下a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)的多肽之一a)名稱為GmNACll(110-140)，由SEQIDNa:3的自氨基末端第1-31位胺基酸殘基組成的多肽；4b)名稱為NST1(113-146)，由SEQIDNq:4的自氨基末端第1-34位胺基酸殘基組成的多肽；c)名稱為AtNAC2(114-147)，由SEQIDNq:5的自氨基末端第1-34位胺基酸殘基組成的多肽；d)名稱為ATAF1(100-133)，由SEQID6的自氨基末端第1-34位胺基酸殘基組成的多肽；e)名稱為RD26(108-141)，由SEQIDN2:7的自氨基末端第1_34位胺基酸殘基組成的多肽；f)名稱為SNAC(109-142)，由SEQIDN2:8的自氨基末端第1-34位胺基酸殘基組成的多肽；g)由SEQIDNS:2的下列位置之外進行1個到5個的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的由SEQIDNQ:2衍生的多肽自氨基末端第7位、第10位、第12—15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29_34位。實驗證明序列表中的SEQIDNS:2的多肽在酵母系統中抑制轉錄因子轉錄激活活性達到90%以上，在原生質體系統中抑制轉錄因子轉錄激活活性達到約80%;序列表中SEQIDNQ:2的胺基酸殘基序列自羧基末端缺失19個胺基酸殘基(SEQIDn2:2的自氨基末端第17-35位胺基酸殘基)的多肽NARD(1/16)具有抑制轉錄因子轉錄激活活性(在酵母系統中抑制75%);序列表中SEQIDNS:2的胺基酸殘基序列自羧基末端缺失13個胺基酸殘基(SEQIDNs:2的自氨基末端第23-35位胺基酸殘基)的多肽NARD(1/22)仍具有抑制轉錄因子轉錄激活活性(在酵母系統中抑制60%);序列表中SEQIDNS:3所示的胺基酸殘基組成的多肽GmNACll(110-140)在原生質體系統中抑制轉錄因子轉錄激活活性達到75%以上；序列表中SEQIDNS:4所示的胺基酸殘基組成的多肽NST1(113-146)在原生質體系統中抑制轉錄因子轉錄激活活性達到85%以上；序列表中SEQIDNa:5所示的胺基酸殘基組成的多肽AtNAC2(114-147)在原生質體系統中抑制轉錄因子轉錄激活活性達到80%以上；序列表中SEQIDNQ:6所示的胺基酸殘基組成的多肽ATAF1(100-133)在原生質體系統中抑制轉錄因子轉錄激活活性達到卯％以上；序列表中SEQIDN2:7所示的胺基酸殘基組成的多肽RD26(108-141)在原生質體系統中抑制轉錄因子轉錄激活活性達到80%以上；序列表中SEQIDNS:8所示的胺基酸殘基組成的多肽SNAC(109-142)在原生質體系統中抑制轉錄因子轉錄激活活性達到80%以上。為了使所述的NARD便於純化，可在上述多肽的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表l標籤的序列標籤殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)纖RRPoly-His2-10(通常為6個)HH朋HHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述NARD可以人工合成，也可以先合成其編碼基因，再通過生物表達得到。其中，NARD編碼基因可以通過將序列表中SEQIDNs:1自5'末端第1至105位鹼基所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。上述的具有抑制轉錄因子轉錄激活活性的各個多肽的編碼基因屬於本發明的保護範圍。上述具有抑制轉錄激活活性作用多肽的編碼基因，具體可為如下i)或2)或3)的DNA分子之一1)其編碼序列是序列表中SEQIDNS:1的DNA分子；2)與l)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA分子；3)在高嚴謹條件下與與1)或2)限定的DNA序列進行雜交且編碼相同功能多肽的DNA分子。上述高嚴謹條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65T下雜交並洗膜。含有本發明多肽的編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系及重組宿主菌均屬於本發明的保護範圍。擴增NARD全長或其任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內。本發明中，攜帶有NARD編碼基因的植物表達載體可通過使用包含但不限於Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主包含水稻、小麥、玉米等單子葉植物，或者黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等雙子葉植物。本發明的NARD可作為構建植物表達載體的元件，將其連接在目的轉錄因子基因的前或後，均可抑制該轉錄因子的激活活性。因此本發明的NARD對研究具有轉錄激活功能的轉錄因子的生物學功能及通過抑制此類轉錄因子的激活活性達到改變轉基因植物(含有具6有轉錄激活活性的轉錄因子)表型的目的具有重要意義。下面結合實驗及附圖對本發明的要旨做進一步闡述，但本發明並不局限於以下實驗或實施例。圖1為GmNAC在酵母中的轉錄活性分析。圖2為GmNAC20各結構域轉錄激活活性分析。左側為GmNAC20基因不同區段載體構建示意圖，數字表示胺基酸位置，右側為酵母生長狀態和半乳糖苷酶活性分析。圖3為GmNAC20中轉錄抑制結構域(NARD)的鑑定，圖左側為6fe7^ICi^不同區段載體構建示意圖，數字表示胺基酸位置，圖右側為酵母生長狀態和半乳糖苷酶活性分析。圖4為6半乳糖苷酶定量分析NARD不同區段的抑制作用。圖5為!3半乳糖苷酶定量分析NARD對不同類型轉錄因子的抑制作用。圖6A為原生質體瞬時表達系統的驗證報告基因表達質粒和內參基因表達質粒共轉化活性測定。圖6B為原生質體系統中的效應基因表達載體pGAL4DBD的部分結構示意圖。圖6C為原生質體系統中的效應基因表達載體pGAL4DBD-目的片段的部分結構示意圖。圖6D為雙螢光素酶定量分析NARD在原生質體系統中對VP16的抑制作用。圖7為不同NAC多肽中NARD同源胺基酸序列比對。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法；下述實施例所涉及的所有實驗材料，如無特別說明，均從商業途徑得到。實施例1、NARD的發現及NARD基因的克隆與製備1.1.酵母系統中GmNAC基因的轉錄活性分析該實驗中，選擇了3個GmNAC基因GmNAC11、GmNAC20和GmNAC35作為分析對象。將上述基因全長開放閱讀框(0RF)分別克隆到pBDGAL4(pBD-GAL4Cam，Stratagene)載體並轉化酵母菌株YRG2(Stratagene)，經過色氨酸缺陷培養基篩選陽性克隆，再將陽性克隆塗在組氨酸缺陷並加入3-AT的SD培養基平板上生長。同時利用X-Gal和ONPG對0-半乳糖苷酶酶活性進行定性及定量分析。結果如圖l所示，表明3個基因中，GmNACll具有轉錄激活活性，轉化子能在SD/-His+3-AT培養基平板上生長，且X-Gal分析I3-Galactosidase酶活也呈陽性。GmNAC20沒有轉錄激活活性。1.2.GmNAC20基因不同區域的轉錄活性分析及NARD的發現、命名與克隆根據已有的報導，NAC類基因的保守NAC結構域一般為DNA結合域，而呈多態性的C末端一般為轉錄激活域，在本發明的實施例中，將GmNAC20(其胺基酸序列是序列9，其7編碼基因是序列10)分成N端和C端兩部分，分別包含1-175(序列表中序列9的第1到175位)、162-268(序列表中序列9的第162到268位);和141-268(序列表中序列9的第141到268位)胺基酸區段。轉錄活性分析表明，C端都具有很強的轉錄激活活性，是作為轉錄激活域起作用的，將胺基酸序列是序列表中序列9的第162到268位的多肽命名為20AD，而N端均沒有檢測到轉錄激活活性。又將C末端向N端延伸20個胺基酸測定其轉錄活性，它們仍然具有很強的激活活性(圖2)。圖2中，左側為GmNAC基因不同區段載體構建示意圖，數字表示胺基酸位置，右側為酵母生長狀態和半乳糖苷酶活性分析。該實驗中，為了進一步闡述GmNAC20編碼蛋白N端中存在的轉錄抑制域，如圖3所示，將GmNAC20劃分為更細的若干個區段進行轉錄活性的分析。圖3左側為GmNAC20不同區段載體構建示意圖，數字表示胺基酸位置，右側為酵母生長狀態和半乳糖苷酶活性分析。"GAL4"表示轉入pBDGAL4質粒的重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4作為空質粒對照。"None"表示酵母菌株YRG2作為空菌對照。結果表明C端延伸至141位，141/268(序列表中序列9的第141到268位)仍然具有轉錄激活活性，而延伸至100位或49位，100/268(序列表中序列9的第100到268位)和49/268(序列表中序列9的第49到268位)均沒有轉錄激活活性，看來100/140(序列表中序列9的第100到140位)具有類似轉錄抑制域的功能。為了驗證其它區段是否有轉錄抑制功能，分別將1/61(序列表中序列9的第1到61位)和55/106(序列表中序列9的第55到106位)連接到轉錄激活域162/268(序列表中序列9的第162到268位)的N端，結果表明這兩段序列不能抑制162/268的轉錄激活活性。為了證明100/134區段-GmNAC20(100/134)(其胺基酸序列是序列表中的SEQIDN2:2,即NARD)(該胺基酸序列區段也是序列表中序列9的第100到134位，故以100/134表示)可使轉錄活性域喪失激活活性，進行如下實驗。1.2.1.GAL4DBD-GmNACs融合基因表達載體的構建1)pBDGAL4-162/268及pBDGAL4-100/134*162/268等重組載體的構建pBDGAL4-162/268的構建方法如下提取大豆南農1138-2(南京農業大學國家大豆改良中心)幼苗經lOOmMNaCl處理12小時後提取的總RNA，將RNA用逆轉錄酶合成cDNA。以反轉錄得到的cDNA為模板，用表1中的相應引物對PCR擴增GmNAC20(102/268)，將擴增產物連接到pBD-GAL4Cam的限制性內切酶EcoRI和Pstl的位點間得到重組載體pBDGAL4-162/268。pBDGAL4-162/268中含有序列9的第162到268位胺基酸殘基的編碼DNA(序列表10中486—804位核苷酸)。pBDGAL4-100/134'162/268的構建方法如下提取經100mMNaCl處理12小時的南農1138-2幼苗的總RNA，將RNA用逆轉錄酶合成cDNA。以反轉錄得到的cDNA為模板，用表l中的相應引物對(正向引物中帶有EcoRI識別序列，反向引物中帶有SalI識別序列)經PCR擴增GmNAC20(100/134)。用表1中的相應引物對(正向引物中帶有Sail識別序列，反向引物中帶有Pstl識別序列)經PCR擴增GmNAC20(162/268)。GmNAC20(100/134)和GmNAC20(162/268)兩個片段以Sail位點相連，再以EcoRI和Pstl位點插入pBD-GAL4Cam的相應位點，得到重組載體pBDGAL4-100/134'162/268。重組載體pBDGAL4-100/134'162/268中含有序列9的第100到134位胺基酸殘基的編碼DNA(序列表10的298至402位核苷酸)與序列9的第162到268位胺基酸殘基的編碼核苷酸(序列10的484—804位核苷酸)相連接。2)其它GAL4DBD-GmNACs融合基因表達載體的構建分別含有GmNAC20(141/268)、GmNAC20(100/268)、GmNAC20(1/175)、GraNAC20(49/268)、GmNAC20(1/61)、GmNAC20(55/106)、GmNAC20(162/268)、GmNAC20(100/134)和GmNAC20(55/106*162/268)等蛋白編碼基因的重組載體參照pBDGAL4-162/268和pBDGAL4-100/134162/268的構建方法，將這些蛋白編碼基因擴增產物分別連接到pBD-GAL4Cam的相應限制性內切酶位點，得到重組載體。表1.pBDGAL4載體克隆所需引物列表引物方酶切位基因名稱_^_^_引物序列_正向引GmNAC20(162/268)物EcoRIGCAGAATTCGCAATTGAGAAGCAGCAACC反向引_^_PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(141/268)物EcoRICGTGAATTCCGCAAAAAGAACAGCTTAAGG反向弓l_^_PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(100/268)物EcoRIGAGGAATTCGGCAAACCGAAACCTGTTGG反向弓(_^_PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(1/175)物.EcoRITTCGAATTCATGGCCGCAGCAACACAACTCC反向引_^_^_TTTCTGCAGCCCACTCGGTGGTGGCGGTGCT正向引GmNAC20(49/268)物EcoRIGAGGAATTCTACGACCCATGGGACCTTCC反向引物PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(1/61)物反向弓lEcoRITTCGAATTCATGGCCGCAGCAACACAACTCC物SailCGTGTCGACTCCGTACAAAGCCATTCCTGG正向引GmNAC20(55/106)物反向引EcoRICGTGAATTCCCAGGAATGGCTTTGTACGGA物SailCGTGTCGACCCCAACAGGTTTCGGTTTGCC正向引GmNAC20(162/268)物反向引SailGCAGTCGACGCAATTGAGAAGCAGCAACC物PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(100/134)物反向引EcoRIGAGGAATTCGGCAAACCGAAACCTGTTGG物SailATCGTCGACGGCGAGACGATACTCGTGCATG正向引GmNAC20(100/134)物反向引SailGAGGTCGACGGCAAACCGAAACCTGTTGG物PstlATCCTGCAGGGCGAGACGATACTCG丁GCATG正向引GmDof4物反向引SailTCATCGTCGACATGCAGCAAATACACTCCATG物PstlATCCTGCAGTCAGGGAGATGAAGAGAGAAG正向引DREB1A物反向引SailCTTGTCGACATGAACTCATTTTCTGCTTT物PstlCTTCTGCAGTTAATAACTCCATAACGATAC正向引GmWRKY53物反向引SailATCAGTCGACATGGAGAATTATTCCATGTT物PstlGATGCTGCAGTCAGAAGGGAGTGTATATTT正向弓lVP16物反向引EcoRIGGGGAATTCACCGATGTCAGCCTGGGGGAC物SailGCTGTCGACCCCACCGTACTCGTCAATTCC正向弓lVP16物SailGGGGTCGACACCGATGTCAGCCTGGGGGAC反向引_^__GCTCTGCAGCCCACCGTACTCGTCAATTCC正向引ATAF1RD物EcoRICGTGAATTCCCTAAACCGGTCGGAATTAAG反向弓l_^_§^_CGTGTCGACGTCGGCGAGACGGTACTCGTG正向引RD26RD物EcoRICGTGAATTCGGTCGTCGTGTCGGGATT反向弓l_^__CGTGTCGACTTCTATTAAGCGATACTCG正向引SNACRD物EcoRICGTGAATTCGGGCGCACGCTTGGGATCAAG反向引_^_^_CGTGTCGACATCGGCGAGCCGGTACTCATG正向引A維C2RD物EcoRICGTGAATTCAAATCACTTGTGGGTATGAAG反向引_物Sail_CGTGTCGACGCCTTCTAAACGATATTCATG正向引NST1RD物EcoRICGTGAATTCGGCCGTAGAATTGGGATGAG反向引_^_^_CGTGTCGACGTCATCGAGTCTATATTCATG正向引GmNACllRD物EcoRICAAGAATTCGTTGGTGTGAAGAAGGCTTTG反向弓l物SailCAAGTCGACGTCTACAAGGCGATATTCATG1.2.2.轉化酵母及功能分析將1.2.1.構建的GAL4DBD-GmNACs融合基因表達載體導入酵母菌株YRG-2(蒯7^ZKS^.'.'〃A^"-7>!7>L"-〃i^做M.',〃A,'7脂幼-7^7Xcra-7ac》(Stratagene))。同時將來自GAL4Two-HybridPhagemidVectorKit(Stratagene)的正對照質粒pGAL4controlplasmid、負對照質粒pBD-WTcontrolplasmid分別轉化酵母細胞YRG2。分別將在SD/Trp—培養基上(Stratagene,美國)(生長出的轉化子塗於SD/His—11(Stratagene，美國)平板上培養，3(TC培養3天，然後對能夠生長的酵母細胞進行B-Galactosidase活性分析。其中，酵母菌株YRG2的基因組中含有兩個報告基因/Z/5^和7acZ，每個報告基因啟動子中包含重複拷貝的GAL4結合位點(UAS,)(Stratagene，美國)。RT-PCR驗證酵母轉化子中基因的表達情況。酵母轉化子用YPAD培養基培養8小時，取lml菌液收集酵母菌，然後按照酵母總RNA小量提取試劑盒(華舜，中國上海)提取酵母總RNA。然後用M-MLV反轉錄酶反轉錄得到cDNA，稀釋25倍取lpl作為模板，用pBDGAL4通用引物(5'-GCCTCTAACATTGAGACAGC-3'，5，-AAGAGTTACTCAAGAACAA-GAA-3，)擴增目的片段；酵母Actin作為對照，引物序列為5，-CAGCCAACT-TTCTCAAATCAG-3'，5'-GCCAAGGGTCACTACAC-3'。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。將轉入pBDGAL4-162/268的重組酵母菌株命名為YRG2/pBDGAL4-l62/268,轉入pBDGAL4—100/134'162/268的重組酵母菌株命名為YRG2/pBDGAL4_100/134*162/268，轉入pGAL4的重組酵母菌株命名為YRG2/pGAL4。實驗結果表明酵母Actin基因參照基因得到約1128bp的PCR產物；酵母轉化子YRG2/pBDGAL4-162/268中得到約300—400bp的PCR產物；酵母轉化子YRG2/pGAL4作為陽性對照，由於無多克隆位點，因此沒有檢測到PCR產物；酵母轉化子YRG2/pBDGAL4—100/134162/268得到約450bp的PCR產物；不轉質粒的酵母菌株YRG2空菌對照"None"因為沒有外源質粒導入，故沒有PCR產物的條帶出現。再將陽性克隆塗在組氨酸缺陷並加入3-AT的SD培養基平板上(Stratagene,美國)檢測其生長情況。並利用X-Gal和ONPG對e-半乳糖苷酶酶活性進行定性及定量分析。根據酵母實驗手冊(Yeasthandbook,Clonetech)ONPG顯色法對!3-Galactosidase活性進行定量分析。具體步驟如下取酵母轉化子陽性克隆至3mlYPAD培養基(Stratagene,美國)中搖8-12小時，OD值在1.2左右；取lml測定0D6。。；取1.5ml菌液收集酵母菌，12000rpm離心1分鐘；去上清，用Z-Buffer0.3ml重懸；取重懸液0.lml至新離心管，在液氮中速凍1分鐘，迅速取出在37'C溫育1分鐘，重複此操作4-5次；菌體裂解後加入0.7ml含巰基乙醇的Z-Buffer;混勻後加入4mg/ml的ONPG溶液0.2ml;30。C反應，記錄開始時間，待溶液變為黃色加入0.4ml1MNa2C03溶液終止反應，記錄終止反應時間，計算得顯色反應時間T(反應終止時間-反應開始時間)；12000rpm離心5分鐘去除沉澱；取上清液測定0D42。(沒有菌體的空白組為對照)；利用公式(1000XOD42。)/(0.5XTXOD600)計算13-Galactosidase活性。其活性單位為OD42。/(培養物0D600的光密度X測定體積X時間)。實驗設三次重複。同時分別以pGAL4controlplasmid的重組酵母菌株YRG2/pGAL4(圖3中以"GAL4"表示)作為空質粒對照以檢驗質粒系統的可靠性，以未轉質粒載體和12基因的酵母菌株YRG2(圖3中以"None"表示)作為空菌對照以檢驗酵母菌株的可靠性。在圖3中，"162/268"表示重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268的實驗結果；"100/134162/268"表示重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4_100/134*162/268的實驗結果。實驗結果如下A)在YPAD培養基上以上各重組菌及其對照均能生長，平均每皿約50個菌落。B)在組氨酸缺陷並加入3-AT的SD培養基平板(圖3中以"-His"表示)上"GAL4"重組酵母菌株YRG2/pGAL4作為陽性對照，每皿>50個菌落；"None"未轉基因的酵母菌株YRG2無菌落；"162/268"重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-l62/268每皿>50個菌落；"100/134*162/268"重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4—100/134162/268無菌落;C)在X-Gal培養基平板(Stratagene，美國)(圖3中以"X—Gal"表示)"GAL4"重組酵母菌株YRG2/pGAL4每皿>50個菌落；"None"未轉基因的酵母菌株YRG2無菌落；"162/268"重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268每皿>50個菌落；"100/134*162/268"重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4—100/134162/268無菌落;D)e-半乳糖苷酶酶活性其活性單位為0D42。/(培養物0D600的光密度X測定體積X時間)。重組酵母菌株YRG2/pGAL4的e-半乳糖苷酶酶活性為19±4;未轉基因的酵母菌株YRG2的對照0-半乳糖苷酶酶活性為0;重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268P-半乳糖苷酶酶活性為22士5;重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-100/134*162/268的e-半乳糖苷酶酶活性為1.5±0.2。上述實驗證明100/134(即NARD)具有顯著抑制轉錄因子激活活性的作用，抑制率達到90%以上。NARD編碼基因的編碼序列長度為105bp，編碼35個胺基酸殘基的多肽(即SEQIDN2:2)。1.3.NARD分段功能分析在本發明中，為了進一步對NARD中具體起作用的胺基酸進行描述，將NARD進一步分段，其中一段是NARD(1/16)(胺基酸序列是序列表中SEQIDNs:2的自氨基末端第1-16位胺基酸殘基的NARD)、一段是NARD(1/22)(胺基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第1-22位胺基酸殘基的NARD)、一段是NARD(23/35)(胺基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第23-35位胺基酸殘基的NARD)、一段是NARD(1/9)(胺基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第1-9位胺基酸殘基的NARD)、一段是NARD(1/12)(胺基酸序列是序列表中SEQID他2的自氨基末端第1-12位胺基酸殘基的NARD)。分別將其連接GmNAC20的激活域20AD(其胺基酸序列是序列9的自氨基末端第162-268位胺基酸殘基)。將NARD(1/16)的編碼序列(序列表1的1至48位核苷酸)、NARD(1/22)的編碼序列(序列表1的1至66位核苷酸)、NARD(23/35)的編碼序列(序列表1的67至105位核苷酸)、NARD(1/9)的編碼序列(序列表1的1至27位核苷酸)、NARD(1/12)的編碼序列(序列表1的1至36位核苷酸)分別與20AD的編碼序列(序列10的484—804位核苷酸)的5'端連接後插入pBD-GAL4Cam的多克隆位點，得到重組載體pBDGAL4—NARD(1/16).162/268，pBDGAL4—NARD(1/22).162/268，pBDGAL4—NARD(23/35).162/268，pBDGAL4—NARD(1/9).162/268，pBDGAL4—NARD(1/12).162/268。將重組載體pBDGAL4—NARD(1/16).162/268，pBDGAL4—NARD(1/22).162/268，pBDGAL4—NARD(23/35).162/268，pBDGAL4—NARD(1/9).162/268，pBDGAL4—NARD(1/12)162/268分別導入酵母菌株YRG-2，得到重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/16).162/268，YRG2/pBDGAL4—NARD(1/22).162/268，YRG2/pBDGAL4—NARD(23/35).162/268，YRG2/pBDGAL4—NARD(1/9).162/268，YRG2/pBDGAL4—NARD(1/12).162/268。按照1.2.2.所提供的方法進行13-Galactosidase定量檢測，實驗設三次重複。同時分別以重組酵母YRG2/pBDGAL4-162/268和未轉基因的酵母菌株YRG2作為對照。轉錄活性檢測表明它們都無法如完整的NARD—樣抑制20AD的激活活性，因此NARD只是在序列完整時才能起到最強的轉錄抑制作用。表達胺基酸序列為序列9的自氨基末端第1-22位胺基酸殘基組成的NARD(1/22)抑制了55%以上20AD的活性，其B-Galactosidase值下降了一半以上。NARD(1/16)可以將20AD的活性抑制75%，而證D(1/9)卻沒有太大影響(圖4)。圖4中，陽性對照"20AD"表示表達胺基酸序列是序列9自氨基末端第162-268位胺基酸殘基的20AD的重組酵母YRG2/pBDGAL4-162/268的活性檢測結果；陰性對照"None"表示未轉基因的酵母菌株YRG2;"NARD(1/35).20AD"表示表達胺基酸序列是序列表中SEQIDNa:2的自氨基末端第1-35位胺基酸殘基的NARD和序列9自氨基末端第162-268位胺基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—100/134162/268的活性檢測結果；"NARD(1/22).20AD"表示:表達胺基酸序列是序列表中SEQIDNs:2的自氨基末端第1-22位胺基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位胺基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/22).162/268的活性檢測結果；"NARD(23/35).20AD"表示表達胺基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第23-35位胺基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位胺基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(23/35).162/268的活性檢測結果；"NARD(1/9).20AD"表示表達胺基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第1-9位胺基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位胺基酸殘基組成的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/9).162/268;的活性檢測結果；"NARD(1/12).20AD"表示表達胺基酸序列是序列表中SEQID2的自氨基末端第1-12位胺基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位胺基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/12).162/268的活性檢測結果；"NARD(1/16).20AD"表示表達胺基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第1-16位胺基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位胺基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/16).162/268的活性檢測結果。實施例2.NARD的功能驗證2.1.NARD抑制作用的普遍性本發明的上述實驗已證明來自GmNAC20的NARD對GmNAC20中的轉錄激活域有很強的抑制作用。為了證明NARD抑制作用的普遍性，檢測了NARD對其它類型轉錄因子是否也具有抑制作用，以pBD-GAL4Cam(Stratagene，美國)為出發載體，構建了NARD與其它轉錄因子融合的重組載體，在酵母系統中驗證了它們的轉錄激活活性。結果表明GmDof4、DREB1A、GmWRKY53和GmNACll的轉錄激活活性均能被NARD強烈抑制。本實驗中選用以下的轉錄因子GmDof4屬於Dof類轉錄因子，可以提高種子油脂含量，其胺基酸序列如GenBankAccessionNoDQ857254所示；DREB1A和GmWRKY53分別屬於AP2/EREBP和WRKY家族，均與植物的非生物脅迫耐性相關，它們在GenBank中的AccessionNo分別為FJ169302和DQ322693。根據表l所列出的相應引物，以大豆南農1138—2cDNA為模板進行PCR擴增，分別得到Gm沐RKY53,GmNACll和GmDof4的cDNA;以擬南芥cDNA為模板，經PCR擴增，得到DREB1AcDNA。將這些PCR擴增產物插入pBD-GAL4Cam的Sail和Pstl酶切位點，得到重組載體pBD-GmWRKY53、pBD-GmNAC11、pBD-GmDof4、pBD-DREB1A。pBD-NARD'GmWRKY53、pBD-NARD'GmNACll、pBD-NARD'GmDof4和pBD-NARD'DREB1A的構建方法如下提取經100mMNaCl處理12小時的南農1138-2幼苗的總認A，將RNA用逆轉錄酶合成cDNA。以大豆南農1138—2cDNA為模板進行PCR擴增，用表1中的相應引物對(正向引物中帶有EcoRI識別序列，反向引物中帶有SalI識別序列)PCR擴增GmNAC20(100/134)，得到的100/134片段，再分別與上述各擴增片段以Sail位點相連，之後再以EcoRI和Pstl位點與載體pBD-GAL4Cam連接獲得重組載體pBD-NARD'GmWRKY53、pBD-NARD*GmNACll、pBD-NARD'GmDof4或pBD-NARD'DREB1A。15將重組載體pBD-GmWRKY53、pBD-GmNACll、pBD-GmDof4、pBD-DREBlA、pBD-NARD'GmWRKY53、pBD-NARD*GmNACll、pBD-NARD*GmDof4和pBD-NARD*DREB1A分別導入酵母菌株YRG-2，得到重組酵母YRG2/pBD-GmWRKY53、YRG2/pBD-GmNACll、YRG2/pBD-GmDof4、YRG2/pBD-DREB1A、YRG2/pBD-NARD*GmWRKY53、YRG2/pBD-NARD'GmNACll、YRG2/pBD-NARDGmDof4和YRG2/pBD-賺D'DREB1A。按照1.2.2.所提供的方法進行B-Galactosidase定量檢測，實驗設三次重複。同時以未轉基因的酵母菌株YRG2作為對照。實驗結果表明未轉基因的酵母菌株YRG2的I3-Galactosidase活性為0.8±0.1，YRG2/pBDGAL4—GmDof4的13-Galactosidase活性為12.5±0.1，YRG2/pBDGAL4—NARDGmDof4fi-的Galactosidase活性為2.5±0.8，YRG2/pBDGAL4—DREBIA的13-Galactosidase活性為16.5±4，YRG2/pBDGAL4—NARDDREBIA的13-Galactosidase活性為2.3±1，YRG2/pBDGAL4—GmWRKY53的fi-Galactosidase活性為4.5±1，YRG2/pBDGAL4—NARDGmWRKY53的13-Galactosidase活性為l土O.1，YRG2/pBDGAL4—GmNAC11的13-Galactosidase活性為9.2±0.3，YRG2/pBDGAL4—NARDGmNACll的13-Galactosidase活性為0.5±0.1。說明NARD可以將所檢測的不同類型轉錄因子的轉錄激活活性抑制90%以上。該實驗證明NARD對轉錄激活域的抑制作用是普遍的。在圖5中，陰性對照"None"表示未轉基因的酵母菌株YRG2的活性檢測結果；"GmDof4"表示表達GmDof4轉錄因子的重組酵母YRG2/pBD—GmDof4的活性檢測結果；"NARDGmDof4"表示表達胺基酸序列是序列表中SEQIDNq:2的NARD和GmDof4轉錄因子連接的重組酵母YRG2/pBD—NARD■GmDof4的活性檢測結果；"DREBIA"表示表達DREBIA轉錄因子的重組酵母YRG2/pBD—DREBIA的活性檢測結果；"NARDDREBIA"表示表達胺基酸序列是序列表中SEQIDNq:2的NARD和DREBIA轉錄因子相連接的重組酵母YRG2/pBD_NARD'DREB1A的活性檢測結果；"GmWRKY53"表示表達GmWRKY53轉錄因子的重組酵母YRG2/pBD_GmWRKY53的活性檢測結果；"NARD.GmWRKY53"表示表達胺基酸序列是序列表中SEQIDNs:2的NARD和GmDof4轉錄因子相連接的重組酵母YRG2/pBD—NARD'GmWRKY53的活性檢測結果；2.2.NARD在原生質體轉錄活性系統中的抑制作用16近年來，原生質體轉錄活性分析系統因為其靈敏度高、更接近於植物本體分析等優點逐漸成為植物轉錄因子活性分析強有力的工具之一。在前面的實驗中，分析證明了NARD在酵母系統中具有很強的轉錄抑制作用，為了提供更深入的實驗證據，利用原生質體分析系統作進一步研究。首先做了一系列實驗來驗證原生質體系統的可行性。根據JanSheen實驗室提供的操作流程(http:〃genetics.mgh.harvard,edu/sheenweb/protocols/)，分離了哥倫比亞生態型擬南芥葉肉細胞原生質體，單質粒GFP轉化結果表明PEG轉化效率可以達到90%;報告基因表達質粒(螢火蟲螢光素酶基因表達質粒(Promega，E6651))和內參基因表達質粒(海腎螢光素酶基因表達質粒(Promega，E6881))轉化哥倫比亞生態型擬南芥葉肉細胞原生質體，按照雙螢光素酶報告試劑盒(Dual-LuciferaseR印orterAssaySystem,Promega，E1910)的操作規程檢測報告基因和內參基因的螢光素酶活性。報告基因和內參基因的螢光素酶活性比值即為螢光素酶相對活性。檢測儀器為GlomaxT20/20(Promega,美國)。實驗結果表明隨著質粒比例的變化雙螢光素報告系統的比值呈線性，表明質粒的量與報告基因的表達呈正相關(圖6A)。圖6A中，質粒比為報告基因表達質粒和內參基因表達質粒的摩爾比。其中，上述轉化方法採用PEG-CaCl2方法轉染質粒。10|^1質粒(總計10-20嗎)加入100|al原生質體MMg懸液(0.4Mmannitol，15mMMgCl2，4mMMES，約含原生質體150-200Pg)，再加入11(V1PEG-CaCl2(4gPEG4000,3mlH20，2.5ml0.8MMannitol，lmllMCaCh)溶液，吹吸混勻，轉化20分鐘。轉化完後，加入440jxlW5溶液(154mMNaCl，125mMCaCl2，5mMKCl，2mMMESpH5.7)混勻後100g緩慢離心3分鐘，去上清後加入lmlW5溶液過夜培養16h。然後用上述原生質體系統來驗證NARD的作用。構建原生質體系統的載體報告基因表達載體、效應基因表達載體和內參基因表達載體。報告基因表達載體為報告基因表達質粒(螢火蟲螢光素酶基因表達質粒(Promega，E6651))。效應基因表達載體中的效應基因(effecter)為35S啟動子驅動的包含GAL4結合域的融合蛋白，GAL4DBD可以結合GAL4結合位點，依靠轉錄因子的作用來調控螢火蟲螢光素酶的表達。在本發明實施例中構建了一系列效應基因的載體(effectors)來分析它們的轉錄活性。效應基因載體包含35S啟動子和NOS終止子。將GAL4DNABindingDomain(GAL4DBD，其編碼基因如序列12)和所分析的全基因或部分基因序列構建的融合基因克隆到35S啟動子後面。以單獨GAL4DBD為負對照，以VP16為正對照，然後分別將NARD按照讀碼框拼接在VP16的前端或後端，來闡述NARD的作用。1)作為負對照的效應基因表達載體pGAL4DBD(圖6B)的具體構建方法如下pUC19-35S-N0S的構建方法如下用分別含有Kpnl和Sail位點的引物，以植物雙元表達載體pBin438(李太元，田穎川，秦曉峰，等.高效抗蟲轉基因菸草的研究[J].中國科學(B輯)，1994,24(3):276-282.)為模板PCR擴增CaMV35S、Q和N0S片段，再以上述酶位點插入pUC19的相應位點中，得到重組載體pUC19-35S-N0S。用分別含有EcoRI和Pstl位點的引物將GAL4DNABindingDomain的編碼基因(序列12)構建到pUC19-35S-N0S中Q和NOS點間，得到重組載體pGAL4DBD(圖6B)。2)效應基因表達載體pGAL4DBD-目的片段(圖6C)的具體構建方法如下A)pGAL4DBD-VP16的構建用表1中的引物從HSV病毒中PCR擴增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11)，將該擴增產物連入pGAL4DBD的EcoRI和Sail位點，得到重組載體pGAL4DBD-VP16。B)pGAL4DBD-VP16VP16的構建用表1中的兩對引物分別從HSV病毒中PCR擴增VP16激活域的cDNA(序列表中序列ll)，將2個VP16以SalI相連再以EcoRI和PstI位點與pGAL4DBD連接得到重組載體pGAL4DBD-VP16VP16。C)pGAL4DBD-NARDVP16的構建利用表l中的引物對(正向引物具有EcoRI位點，反向引物具有SalI位點)PCR擴增NARD(GmNAC20(100/134))，利用表l中的引物對(正向引物具有Sail位點，反向引物具有PstI位點)PCR擴增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11)，再將NARD和VP16的擴增產物以Sail位點相連再以EcoRI和Pstl位點與pGAL4DBD連接得到重組載體pGAL4DBD-NARDVP16。D)pGAL4DBD-VP16NARD的構建利用表l中的引物對(正向引物具有SalI位點，反向引物具有PstI位點)PCR擴增賺D(GmNAC20(100/134))，利用表1中的引物對(正向引物具有EcoRI位點，反向引物具有SalI位點)PCR擴增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11),再將VP16和NARD的擴增產物以Sail位點相連再以EcoRI和Pstl位點與pGAL4DBD連接得到重組載體pGAL4DBD-VP16證D。內參基因表達載體pPTRL(中國科學院遺傳與發育生物學研究所)按照如下文獻中描述的方法構建OhtaMOhme-TakagiM,ShinshiH(2000)Threeethylene-responsivetranscriptionfactorsintobaccowithdistincttransactivationfunctions.PlantJ22:29-38。將報告基因表達載體、上述一種效應基因表達載體和內參基因表達載體pPTRL以6:10:1的摩爾比採用上述PEG-CaCl2方法轉化哥倫比亞生態型擬南芥葉肉細胞原生質體。按照雙螢光素酶報告試劑盒(Promega，E1910)的操作規程檢測報告基因和內參基因的螢光素酶活性。報告基因和內參基因的螢光素酶活性比值即為螢光素酶相對活性。檢測儀器為GlomaxT20/20(Promega，美國)。實驗結果如圖6D所示，圖中的數據為3次重複實驗的均值土標準差。表明VP16具有很強的轉錄激活活性，VP16VP16的轉錄激活活性高於VP16，表明兩個轉錄激活域融合在一起時具有一定的疊加效應；而NARDVP16和VP16NARD的轉錄激活活性下降了約80%。說明在原生質體瞬時轉化系統中NARD可以強烈抑制VP16的轉錄活性，而且這種抑制作用沒有位置的選擇性，也即NARD無論在VP16的前端或後端均具有轉錄抑制的作用。圖6D中，"GAL4DBD"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD作為陰性對照和pPTRL共轉染原生質體的檢測結果；"VP16"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD-VP16作為陽性對照和pPTRL共轉染原生質體的檢測結果；"VP16'VP16"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD-VP16.VP16和pPTRL共轉染原生質體的檢測結果；"NARDVP16"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD-NARD.VP16和pPTRL共轉染原生質體的檢測結果；"VP16NARD"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD-VP16.NARD和pPTRL共轉染原生質體的檢測結果。實施例3、nard同源序列的轉錄抑制作用Blast分析表明NARD序列僅存在於NAC類蛋白中。NARD位於NAC類蛋白的N端，在NAC類蛋白中具有一定保守性，本發明選擇了GmNACll、NST1、AtNAC2、ATAF1、RD26、SNAC等6個NAC蛋白，克隆其中NARD的同源序列NACsRD(NACActiveR印ressionDomain,)，它們都具有同nard—致的保守序列，如。其序列分別為GmNAC20(100-134):見SEQIDNa2，GmNAC11(110-140):見SEQIDNa3，nst1(113-146):見SEQIDNq4，AtNAC2(114-147):見SEQIDNs:5，ATAF1(100-133):見SEQID6，RD26(108-141):見SEQIDNa:7，SNAC(109-142):見SEQIDN28。其中，NST1，來自擬南芥，Ara6油;w'st/ah'a朋,ACCESSIONQ84WP6;AtNAC2，來自擬南芥，Jra&Wo/^i'st/a"a朋，ACCESSIONNM—123323;19ATAF1，來自擬南芥，^raW叩w'st力ah'a朋，ACCESSIONNM_100054;RD26,來自擬南芥，AraWoA^s^ah'a朋，ACCESSIONBAB63913;SNAC，來自水稻，firj^asWira，ACCESSIONABD52007.1。如圖7所示，以上多肽是由SEQIDN2:2的下列保守位置之外進行1個到5個的取代和/或缺失和/或添加所得到的具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的由SEQID2衍生的多肽自氨基末端第7位、第10位、第12—15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29—34位。這些與NARD在上述位點具有100%同源性且編碼相同功能的多肽，總稱為NACsRD，將GmNACl1(110-140)、NST1(113-146)、AtNAC2(114-147)、ATAF1(100-133)、RD26(108-141)和SNAC(109-142)分別命名為GmNACllRD，NST1RD,AtNAC2RD,ATAF1RD,RD26RD和SNACRD)。實驗結果表明這些NACsRD與NARD—樣具有相同程度的對轉錄因子激活的轉錄抑制作用。效應基因表達載體pGAL4DBD-目的片段(圖6C)pGAL4DBD-GmNACllRDVIP16、pGAL4DBD-NST1RDVP16、pGAL4DBD-AtNAC2RDVP16、pGAL4DBD-ATAFlRDVP16、pGAL4DBD-RD26RDVP16和pGAL4DBD-SNACRDVP16的構建方法同實施例2.2.的2)。GmNACllRD,NST1RD，AtNAC2RD，ATAF1RD,RD26RD和SNACRD的PCR引物見表1.按照實施例2的方法，用報告基因表達載體、內參基因表達載體pPTRL和下述一種效應基因表達載體轉化哥倫比亞生態型擬南芥葉肉細胞原生質體pGAL4DBD、pGAL4DBD-VP16、pGAL4DBD-VP16VP16、pGAL4DBD-NARDVP16、pGAL4DBD-GmNACllRDVIP16、pGAL4DBD-NSTlRDVP16、pGAL4DBD-AtNAC2RDVP16、pGAL4DBD-ATAFlRDVP16、pGAL4DBD-RD26RDVP16和pGAL4DBD-SNACRD'VP16。按照實施例2的方法，並檢測報告基因和內參基因的螢光素酶活性。報告基因和內參基因的螢光素酶活性比值即為螢光素酶相對活性。結果表明，轉染效應基因表達載體pGAL4DBD的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為1.5±0，轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-VP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為20.0±3.0;轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-VP16VP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為33.0±4.5;轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-NARDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為4.2±0.8;轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-GmNACllRDVIP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為2.6±0.3;轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-NSTlRDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為2.8±0.5;轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-AtNAC2RDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為3.0±0.9;轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-ATAFlRDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為2.5±0.8;轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-RD26RDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為3.2±0.8;轉染效應基因表達載體pGAL4DBD-SNACRDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質體的螢光素酶相對活性為4.2±0.8。上述螢光素酶相對活性均為3-5次重複實驗的均值土標準差。說明圖7所示的6個NACsRD與NARD—樣可以分子內明顯地抑制VP16的活性，起到轉錄抑制的作用。序列表<110〉中國科學院遺傳與發育生物學研究所〈120〉具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的多肽及其編碼基因與應用12〈210〉1〈211〉105<212〉畫CDS〈222>(1)..(105)1ggcaaaccgGlyLysPro1ggaaaagcgGlyLysAlacgtetcgccArgLeuAla35aaacctgttgggateaagaaagcattggttttttacgccLysProValGlylieLysLysAlaLeuValPheTyrAla51015cccaagggagtgaaaactaactggateatgcacgagtatProLysGlyValLysThrAsnTrplieMetHisGluTyr2025304896105〈210〉2〈211〉35〈212>PRT〈213>大豆屬大豆[Glycine隨(L.)Merr]<400〉2GlyLysProLysProValGlylieLysLysAlaLeuValPheTyrAla151015GlyLysAlaProLysGlyValLysThrAsnTrplieMetHisGluTyr202530ArgLeuAla35〈210〉331<212〉PRT〈213〉大豆屬大豆[Glycinemax(L.)Merr]〈400〉3ValGlyValLysLysAlaLeuVal15GlyValLysThrAsnTrplieMet20PheTyrLysGlyArgProProLys1015HisGluTyrArgLeuValAsp2530434PRTPRT〈213〉擬南芥"raWc/o/wis5LysSerLeuValGlyMetLysLys15AlaProLysGlyValLysThrAsn20GluGlyThrLeuValPheTyrLysGlyArg1015TrpValMetHisGluTyrArgLeu2530<210〉6〈211〉34<212〉PRT<213〉擬南芥(v4ra6Wop^血//朋6ProLysProValGlylieLysLys15AlaProLysGlyGluLysThrAsn20AlaAspAlaUuValPheTyrAlaGlyLys1015TrplieMetHisGluTyrArgLeu2530PRT擬南芥(爿ra6油/757^7GlyArgArg1AlaProLyslieGluValGlylieLysLysAla5GlyThrLysThrAsnTrp2025LeuValPheTyr10lieMetHisGluAlaGlyL>ys15TyrArgLeu308〈211〉34〈212〉PRT<213〉水稻(Oyza^m'va)8GlyArgThrUuGlylieLysLysAlaLeuValPheTyrAlaGlyLys151015AlaProArgGlyValLysThrAspTrplieMetHisGluTyrArgLeu202530AlaAsp〈210〉9〈211〉268〈212〉PRT大豆屬大豆[Glycinemax(L)Merr]〈400〉9MetAlaAlaAlaThrGinUuHisLeuProProGlyPheArgPheHis151015LeuThrAspGluGluLeuValValHisTyrLeuCysArgLysCysAla202530SerGinGlulieAlaValProlielieAlaGlulieAspLeuTyrLys354045TyrAspProTrpAspLeuProGlyMetAlaLeuTyrGlyLysLysGlu505560TrpTyrPhePheThrProArgAspArgLysTyrProAsnGlySerArg65707580ProAsnArgSerAlaGlyThrGlyTyrTrpLysAlaThrGlyAlaAsp859095LysProValGlyLysProLysProValGlylieLysLysAlaLeuVal100105110PheTyrAlaGlyLysAlaProLysGlyValLysThrAsnTrplieMet115120125HisGluTyrArgLeuAlaAspValAspArgSerValArgLysLysAsn130135140SerLeuArgLeuAspAspTrpValLeuCysArglieTyrAsnLysLys145150155160GlyAlalieGluLysGinGinProAlaProProProProSerGlyVal165170175HisLyslieGluCysTyrGluMetGluAspValLysProGluTyrThr180185190AlaAlaAspCysLeuTyrPheGluAlaSerAspSerValProArgLeu195200205HisThrThrGluSerSerCysSerGluGinValValSerAlaGluPhe210215220AlaSerGluValGinSerGluArgLysArgGinGlyAsnSerGluPhe225230235240SerTyrAsnTyrMetAspAlaThrLeuGlyAsnAsnGinMetSerPro245250255LeuGinAspliePheMetTyrLeuSerArgProPhe260265<210〉10〈211〉807腿〈213>大豆屬大豆[Glycinemax(L)Merr]〈220>〈221〉CDS〈222〉(1)..(807)10atggccgcagcaacacaaetccacttaccccctggattccgattccac48MetAlaAlaAlaThrGinLeuHisLeuProProGlyPheArgPheHis151015etcaccgatgaagaaetcgtcgttcactatetctgccgcaaatgcget%LeuThrAspGluGluLeuValValHisTyrLeuCysArgLysCysAla202530tcgcaagaaategcagttccaataategccgaaategatetctacaag144SerGinGlulieAlaValProlielieAlaGlulieAspLeuTyrLys354045tacgacccatgggaccttccaggaatggetttgtacggaaagaaagag192TyrAspProTrpAspLeuProGlyMetAlaLeuTyrGlyLysLysGlu505560tggtattttttcacgccgagggaccgcaagtacccgaacggttcgegg240TrpTyrPhePheThrProArgAspArgLysTyrProAsnGlySerArg65707580ccgaaceggtecgcggggaccggatactggaaggcaaccggagcggat288ProAsnArgSerAlaGlyThrGlyTyrTrpLysAlaThrGlyAlaAsp859095aaaccggttggcaaaccgaaacctgttgggateaagaaagcattggtt336LysProValGlyLysProLysProValGlylieLysLysAlaLeuVal100105110ttttacgccggaaaagcgcccaagggagtgaaaactaactggateatg384PheTyrAlaGlyLysAlaProLysGlyValLysThrAsnTrplieMet115120125cacgagtatcgtetcgccgacgtggatcgttcggttcgcaaaaagaac432HisGluTyrArgLeuAlaAspValAspArgSerValArgLysLysAsn130135140agettaaggctggatgactgggtgctgtgtcgaatttacaacaagaaa480SerLeuArgLeuAspAspTrpValLeuCysArglieTyrAsnLysLys14515015516026ggtgcaattgagaagcagcaaccagcaccgccaccaccgagtggggtc528GlyAlalieGluLysGinGinProAlaProProProProSerGlyVal165170175cacaaaattgaatgttacgaaatggaagacgtgaagccggagtatacg576HisLyslieGluCysTyrGluMetGluAspValLysProGluTyrThr180185190gcggcggattgcctgtacttcgaggettecgactcggtgccgeggctg624AlaAlaAspCysLeuTyrPheGluAlaSerAspSerValProArgLeu195200205cacacgacggagtcgagetgttcggagcaggtggtgtcggcggagttt672HisThrThrGluSerSerCysSerGluGinValValSerAlaGluPhe210215220gcgagegaggtgcagagegageggaagaggcagggcaacagegagUt720AlaSerGluValGinSerGluArgLysArgGinGlyAsnSerGluPhe225230235240tcgtataattacatggatgccactetcgggaataatcagatgtcgccg768SerTyrAsnTyrMetAspAlaThrLeuGlyAsnAsnGinMetSerPro245250255etccaggatatettcatgtacetctecaggcccttctga807LeuGinAspliePheMetTyrLeuSerArgProPhe260265<210〉11<211〉837〈212〉醒<213〉HSV病毒〈400〉11atg33gCt3Ctgtcttctatcg犯c犯gcatgcgatatttgecgacttaaaaagctcsag60tgctccaaaggtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctac120tctcccaaaacca已a已ggtctccgctgactagggcacstctgax^gaagt180tggaacagctatttctactgatttttcctcg已ga^gaccttgacatgatt240ttgaaaatggattctttacagcattgttaacaggattatttgtacaagat300aagatgccgtcacagatsgattggcttcagtgg卿ctgatatgectcta360acattgagacagcatagaat犯gtgcgacateatcategg420ca犯gacagttgactgt已tcgattgaattcgsaccagaaaca已ctacggc480tctaccatcgagggcttgetcgacctcccagacgacgacgacgctccagccgaagcaggt540ctcgttgctccaagaatgtctttcctctccgctggac卿gaccaag犯gactttctacc600accgctccaatcaccgacgtttctttggttgacgaattgagattggaeggcgagg已ggtt660tableseeoriginaldocumentpage28權利要求1.一種多肽，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中SEQID№2所示的胺基酸殘基組成的多肽；2)序列表中SEQID№2的胺基酸殘基序列經過一個或十幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的由SEQID№2衍生的多肽。2.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於所述2)的多肽為下述A)、B)或C)之一A)由SEQIDNs:2的自氨基末端第1-16位胺基酸殘基組成的多肽；B)由SEQIDN2:2的自氨基末端第卜22位胺基酸殘基組成的多肽；C)由序列表中SEQIDNQ:2的胺基酸殘基序列經過一個到十九個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的由SEQIDN2:2衍生的多肽。3.根據權利要求2所述的多肽，其特徵在於所述C)是如下a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)的多肽之一a)由SEQIDNs:3的自氨基末端第1-31位胺基酸殘基組成的多肽；b)由SEQIDn2:4的自氨基末端第1-34位胺基酸殘基組成的多肽；c)由SEQID5的自氨基末端第l-34位胺基酸殘基組成的多肽；d)由SEQIDN"6的自氨基末端第l-34位胺基酸殘基組成的多肽；e)由SEQIDNq:7的自氨基末端第1-34位胺基酸殘基組成的多肽；f)由SEQIDN2:8的自氨基末端第1-34位胺基酸殘基組成的多肽；g)由SEQIDN"2的下列位置之外進行l個到5個的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的由SEQIDNa:2衍生的多肽自氨基末端第7位、第10位、第12—15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29—34位。4.權利要求1、2或3所述多肽的編碼基因。5.根據權利要求4所述的編碼基因，其特徵在於所述編碼基因是如下l)或2)或3)的DNA分子之一1)其編碼序列是序列表中SEQID1的DNA分子；2)與1)限定的DNA分子具有90y。以上同源性，且編碼相同功能多肽的麗A分子;3)在高嚴謹條件下與l)或2)限定的DNA序列進行雜交且編碼相同功能多肽的DNA分子。6.擴增權利要求4或5所述基因的全長或其任一片段的引物。7.含有權利要求4或5所述基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。8.權利要求4或5所述基因在抑制植物轉錄因子激活活性中的應用。9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於所述應用為將權利要求3或4所述基因連接到具有轉錄激活活性的轉錄因子的前或後。10.權利要求4或5所述基因在改變轉基因植物表型中的應用，所述轉基因植物中含有具有轉錄激活活性的轉錄因子。全文摘要本發明公開了具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的多肽及其編碼基因與應用。該多肽，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中SEQID№2所示的胺基酸殘基組成的多肽；2)序列表中SEQID№2的胺基酸殘基序列經過一個或十幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉錄因子的轉錄激活活性的由SEQID№2衍生的多肽。該多肽對研究具有轉錄激活功能的轉錄因子的生物學功能及通過抑制此類轉錄因子的激活活性達到改變轉基因植物(含有具有轉錄激活活性的轉錄因子)表型具有重要意義。文檔編號C12N15/82GK101538322SQ20091007862公開日2009年9月23日申請日期2009年2月27日優先權日2009年2月27日發明者張萬科,張勁松,晴林,郝宇鈞,陳受宜申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所