控制植物病毒病的基因工程方法
2023-10-27 14:53:57
專利名稱：控制植物病毒病的基因工程方法
技術領域：
本發明屬基因工程領域，是一種控制植物病毒病的基因工程方法。已有的技術1.D.C.Baulcombeelal，Nature321446-449(1986)所述，在宿主細胞中表達產生致病病毒的衛星RNA來抑制該病毒在植物中的增殖和擴散。此法能延緩病毒病的發生，但僅適合於極少數帶有能抑制該病毒增殖的衛星RNA的病毒引起的植物病害的控制，而且還可能造成難以預測的環境汙染結果。一種衛星RNA在某一種宿主有抑制致病病毒的危害程度，而在另一植物就可能增強該病毒對那種宿主的危害程度。且RNA容易變異，原來能控制該病毒對某宿主危害有益的衛星RNA有可能在變異後加重該病毒對原宿主植物的危害程度。
2.A.P.Powelletal，Science232738-743(1986)所述，在宿主植物中表達病毒外殼蛋白基因來抑制該病毒在宿主中的增殖。這方法能延緩該病毒病的發生，但只能控制一年生植物中由非種傳性病毒引起的病毒病的發生和發展。為達到和增強控制病毒病效果，宿主植物需累積大量該病毒的外殼蛋白，這對植物不利，如用於直接食用的植物，人們心理上也難接受。
3.R.NBeachyetal，InD.EvereddS.Harnett(eds)Plantresistancetoviruses，151-158，JohnWileydSons，(1987)所述，在宿主植物中表達病毒基因組的一段反意RNA片段，以此控制該病毒在宿主中的增殖。但這種方法對病毒病控制效果很差。
本發明的目的在於克服已有技術不足之處。通過病毒誘導方法，使原來已導入植物未表達成蛋白的毒蛋白基因表達成毒蛋白，引起病毒感染細胞「自殺」，可以達到控制病毒在植株中增殖和擴散的目的。
本發明的內容本發明利用抑制宿主植物蛋白質合成的毒蛋白基因讀碼框取代病毒亞基因組cDNA的一種基因讀碼框，在此讀碼框原5′端保留可被該病毒複製酶識別的鹼基序列，或換上可被其它病毒複製酶識別的鹼基序列，或串聯接上幾種病毒各自複製酶識別的鹼基序列，或接上幾種病毒的複製酶共同識別的同源鹼基序列，插在可在植物中表達的啟動子和3′末端間，導入植物，表達成負鏈毒蛋白RNA。在相關病毒感染的細胞中，負鏈RNA轉變成正鏈毒蛋白RNA，翻譯產生控制相應的病毒在宿主植物中的增殖和擴散的毒蛋白，如在毒蛋白基因讀碼框5′端接的是正鏈RNA病毒包括不帶亞基因組正鏈RNA病毒5′端非轉譯區cDNA片段，按此方法組成嵌合基因，導入植物，這種植物也能抗不帶亞基因組的正鏈RNA病毒引起的病毒病。
本發明的根本特徵是向植物導入平時不能表達成蛋白質但在被病毒感染細胞中才能表達成毒蛋白的嵌合基因。一些DNA病毒中只有被該病毒另一些基因產物誘導才能表達的基因的讀碼框和植物中只在某病毒入侵後才在感染細胞中誘導表達的基因的讀碼框用毒蛋白讀碼框取代，組成嵌合基因，導入植物，由於這些嵌合基因只在這些病毒感染的宿主細胞中轉錄和轉譯產生毒蛋白，這樣的植物也能獲得對這些病毒引起的病毒病的抗性。
本發明的具體技術路線是1.把一種帶亞基因組病毒cDNA的外殼蛋白基因讀碼框換上一種能強烈抑制宿主植物蛋白質合成的毒蛋白基因讀碼框。
2.保留這段cDNA原外殼蛋白基因讀碼框5′端可被該病毒複製酶識別從負鏈基因組RNA產生正鏈外殼蛋白RNA的片段和病毒3′端確保原病毒正鏈RNA穩定性的片段，以能在植物中轉錄成負鏈RNA的形式，插入植物啟動子和3′末端間，組成嵌合基因。
3.將嵌合基因插入帶植物篩選標記基因如嵌合的新黴素磷酸轉移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因的質粒載體T-DNA區內，通過接合轉移，把此質粒導入無T-DNA區而帶Vir區的Ti質粒的農桿菌中。
4.通過植物葉碟片或原生質體和農桿菌共培養的辦法，把帶此嵌合基因和篩選標記基因的T-DNA區導入植物染色質基因組，產生抗某抗菌素的帶此毒蛋白基因的工程植株。
5.從工程植株中篩選出最抗該病毒病的植株，通過有性繁殖、繼代培育，得到遺傳上穩定的抗該病毒的種子後代。從完全抗病毒的工程植株還可得到用於生產的無性繁殖材料。
6.在此毒蛋白基因讀碼框前，該病毒複製酶識別片段的cDNA兩側各有一特定的限制性內切酶切口，可用該病毒其它為複製酶識別的片段的cDNA，其它病毒複製酶特異識別片段的cDNA，甚至不帶亞基因組正鏈RNA病毒RNA的5′端非轉譯區片段的cDNA取代;也可用串聯起來的幾種病毒的複製酶各自識別片段的cDNA或共同識別的同源鹼基片段的cDNA取代;組成導入植物能抗一種或多種病毒病的嵌合基因。
7.除了用這裡使用的二元型Ti載體與農桿菌共培養法把嵌合毒蛋白基因導入植物的方法之外，還可用一元型Ti載體經農桿菌共培養或DNA直接轉移法，把嵌合的毒蛋白基因導入植物，得到工程植株。
8.用於抑制植物蛋白質合成的毒蛋白基因有白喉毒素片段A基因、綠膿假單胞桿菌外毒素A基因等細菌的修飾延長因子2的酶蛋白基因;資源植物商陸抗病毒蛋白等和食用植物小麥、玉米、苦瓜等的核糖體失活蛋白基因。用於轉負鏈毒蛋白RNA為正鏈毒蛋白RNA的片段有各種帶亞基因組正鏈RNA病毒(如菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯病毒X、馬鈴薯病毒Y、苜蓿花葉病毒、雀麥花葉病毒、大麥條斑花葉病毒等)複製酶從各自病毒的負鏈RNA轉錄為正鏈亞基因組RNA所需鹼基片段的cDNA和各正鏈RNA病毒包括無亞基因組正鏈RNA病毒5′端非轉譯區片段的cDNA。
本發明的作用機制是1.在病毒未感染的工程植株中都有一定數量的毒蛋白負鏈RNA，這些RNA不能變成正鏈RNA和產生相應的毒蛋白。當植物被病毒感染後，病毒利用宿主蛋白質合成系統來合成複製酶;這些複製酶識別和轉錄負鏈毒蛋白RNA，產生mRNA;這些mRNA又利用植物蛋白質合成系統翻譯生成相應的毒蛋白;這些毒蛋白又反饋地抑制被感染宿主細胞的蛋白質合成。這裡的毒蛋白具酶的性質，有很強的抑制蛋白質合成的能力。這樣，不論宿主細胞原來蛋白質合成的活力如何，利用這種反饋機制，在病毒感染的宿主細胞中，蛋白質合成都會迅速地被嚴重抑制。
2.帶亞基因組的正鏈RNA病毒從感染細胞轉移到相鄰細胞或較遠的組織，需要合成一定數量的病毒的和轉移相關的蛋白。這些蛋白往往是從亞基因組RNA翻譯而來。病毒進入宿主細胞生成複製酶後，先要轉錄生成負鏈的基因組RNA，再由它們轉變為各正鏈亞基因組RNA。在工程植株中預存有一定數量帶有能被病毒複製酶識別和轉錄所需片段的毒蛋白負鏈RNA的條件下，病毒感染宿主細胞後將優先地生成毒蛋白mRNA，翻譯成毒蛋白。在還未能積累病毒轉移所需各轉移蛋白之前，該蛋白迅速反饋地抑制感染細胞中蛋白質的合成。這樣，病毒既不能增殖也不能擴散到鄰近細胞中去。如工程植物中預存一定數量帶有病毒複製酶能識別的該病毒負鏈基因組RNA的3′端(即原來正鏈基因組RNA的5′端)的毒蛋白負鏈RNA，在該病毒入侵後，病毒感染細胞中也會以類似機制優先生成毒白和把病毒限制於原初感染的細胞中。
3.在病毒感染的宿主細胞生成少數毒蛋白從而使細胞蛋白質合成基本被抑制和病毒複製被抑制後，該細胞還有RNA和蛋白質降解活性。如它的RNA酶能把病毒RNA完全降解，則毒蛋白和病毒蛋白也將隨之被清除，該細胞有可能恢復到未被病毒感染前的狀態。
本發明的優點和效果由於本法通過病毒自身誘導，反饋地抑制它自己繁殖和擴散所依賴的宿主蛋白質合成而達到控制病毒病的作用，所以，與過去的方法相比，1.本法可完全控制病毒病的發展。例如，可以用本法得到的一種工程植株能抵制菸草花葉病毒在工程植株中的擴散，2.本法適於控制一年生和多年生、有性繁殖和無性繁殖等多種植物抗病毒。3.農業上最主要的病毒病害大部份由帶亞基因組的正鏈RNA病毒引起，本發明適於控制這些病毒引起的植物病害，也適於控制不帶亞基因組的正鏈RNA病毒引起的病毒病害，經延伸使用本法，還可控制絕大多數病毒引起的致植物病毒病害的目的。4.使用本發明得到的工程植株，平時不含毒蛋白，病毒感染後只在被感染細胞中暫時累積幾個毒蛋白分子，它們也不會侵入人畜細胞。這樣的工程植株對植物本身、對人、畜和對環境都不會帶來不良影響。
具體實施例方式本發明以菸草抗菸草花葉病毒(TMV)引起的花葉病為例。使用的毒蛋白是白喉毒素片段A，它不能進入人畜細胞，只要幾個分子就足以迅速地嚴重抑制一個細胞的蛋白質合成。這裡使用的可被TMV複製酶識別的片段是外殼蛋白基因讀碼框前的片段。在進行重組時，為確保嵌合基因有高轉錄能力和得到正鏈RNA後有高轉譯能力，選用了花椰菜花葉病毒強啟動子(CaMV355啟動子)和它的3′末端，保留了原TMV外殼蛋白mRNA5′端完整的非轉譯區鹼基。為了保持負鏈RNA和由它轉錄產生的正鏈RNA有相當好的穩定性，我們用原外殼蛋白讀碼框前0.6Kb長的鹼基片段放在3′端，而5′端保留了原TMV3′端生成正鏈RNA高級結構所要的鹼基序列。這裡嵌合基因是通過二元型Ti載體經農桿菌導入植株的。整個操作流程如下面所示1.嵌合基因重組流程(1)帶TMV3′末端包括外殼蛋白基因cDNA的pOM5Ⅱ2經HindⅢ酶切，用Klenow酶填平，ApaⅠ部份酶切，取所需HindⅢ-ApaⅠ-ApaⅠ片段，導入載體pRT100花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子和它的3′末端間的ApaⅠ、SmaⅠ切口中，得pKC503。
(2)pKC503用SacⅠ及ClaⅠ酶切，去除原外殼蛋白基因片段，與合成的SacⅠ-NcoⅠ-SalⅠ-DraⅠ多聚接頭及pKC503上原來的DraⅠ-ClaⅠ的61個鹼基對的片段相連，得pKC505。
(3)pTH-1的帶白喉毒素(DT)片段A基因的NcoⅠ到EcoRI片段，先導入pRAJ275的NcoⅠ、EcoRI切口中，使NcoⅠ前接上SacⅠ切口，得pRAJ275DT。將pRAJ275DT用SalⅠ和HpaⅠ酶切並把帶DT片段A基因的SalⅠ-HpaⅠ片段導入pKC505的SalⅠ和SacⅠ切口間，SacⅠ已預先用T4DNA聚合酶填平，得pKC525。
這裡和後面的重組操作均按T.Maniatis等人所著「MolecularCloningALaboratoryManual」(ColdSpringHarborLaboratory1982)一書所敘方法進行。
2.嵌合基因導入農桿菌和導入菸草產生抗菸草花葉病毒工程植株的方法(1)將pKC525中的嵌合基因，用HindⅢ切出，導入Bin19載體的HindⅢ切口，得pKC545。這樣，嵌合的毒蛋白基因就被置於能使植物抗卡那黴素的嵌合的新黴素磷酸轉移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因邊上;二者均在Bin19載體的T-DNA區內。
(2)pKC545通過pRK2013的協助，經常規接合轉移操作，導入帶LBA4404的農桿菌中，用混有卡那黴素、鏈黴素和利福黴素的LB培養基篩選，抑制對卡那黴素敏感的僅帶LBA4404的農桿菌和對鏈黴素、利福黴素敏感的帶pKC545或pPK2013的大腸桿菌，就篩出所需的帶LBA4404和pKC545的農桿菌pAKC545。LBA4404為含Vir區而不含T-DNA區的Ti質粒，農桿菌與受傷的植物組織、細胞接觸時，它的Vir基因表達產物將使pKC545的T-DNA區進入植物細胞。
(3)農桿菌pAKC545接種於LB液體培養基中，在28℃下培養12小時，以LB液體培養基稀釋一至三倍，與不抗卡那黴素的無菌菸草葉新切的碟片接觸5至10分鐘，經無菌濾紙吸去菌液後，葉碟片轉到MS0固體培養基，在每天連續照光12小時的25℃培養箱中放置三天，轉於帶6-卞基嘌呤(1μg/ml)、頭孢
肟鈉(300μg/ml)和卡那黴素(100μg/ml)的MS固體培養基上，再在相同培養條件下放置約20天，得很多轉化菸草的幼芽;切取這些幼芽，轉到帶上述抗菌素但無6-苄基嘌呤的MS固體培養基上生根，約20天後得抗卡那黴素的轉化菸草苗，把這些菸草苗從培養基中移栽到溫室，待成活後，用TMV感染，即可篩出完全抗TMV的工程煙株。
權利要求
1.本發明屬基因工程領域，是一種控制植物病毒病的基因工程方法，其特徵在於向植物導入平常不能表達成蛋白質，但在被病毒感染的細胞中能表達成毒蛋白的嵌合基因，使被感染細胞「自殺」，從而控制病毒病。具體方法是(1)毒蛋白基因讀碼框5′端接上一段或串聯接上幾段被一或幾種病毒的複製酶利用來從負鏈RNA產生正鏈亞基因組RNA所要的鹼基序列，重組成在宿主植物中能表達為負鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(2)毒蛋白基因讀碼框5′端接上被幾種病毒的複製酶共同識別和利用來從負鏈RNA產生正鏈亞基因組RNA所要的同源鹼基序列，重組成在宿主植物中能表達為負鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(3)毒蛋白基因讀碼框5′端接上病毒RNA完整的5′端非轉譯區，重組成在宿主植物中能表達為負鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(4)用DNA病毒的一個必需在該病毒產物誘導下才表達的基因的被該病毒產物識別順序和毒蛋白基因讀碼框組成在植物中能表達為正鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(5)用植物中只在病毒入侵後才特異誘導表達的基因的啟動子或增強子加啟動子與毒蛋白讀碼框組成在植物中能表達為正鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(6)嵌合基因有強啟動子，使正鏈毒蛋白RNA高效轉譯的鹼基順序和使負鏈和正鏈RNA穩定的順序，嵌合基因通過農桿菌Ti載體或DNA直接轉移法導入植物。
2.根據權利要求1所述的一種控制植物病毒病的基因工程方法，其特徵在於所述的毒蛋白基因是白喉毒素片段A基因，綠膿假單胞桿菌外毒素A基因等細菌的修飾延長因子2的酶蛋白基因;資源植物商陸抗病毒蛋白等和小麥、玉米、苦瓜等的核糖體失活蛋白基因。
3.根據權利要求1所述的一種控制植物病毒病的基因工程方法，其特徵在於所述的病毒是菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯病毒X、馬鈴薯病毒Y、苜蓿花葉病毒、雀麥花葉病毒、大麥條斑花葉病毒等帶亞基組的正鏈RNA病毒和不帶亞基因組的正鏈RNA病毒和DNA病毒。
全文摘要
本發明是一種控制植物病毒病的基因工程方法。通過向植物導入平常不表達或只表達成負鏈RNA的能強烈抑制宿主蛋白質合成的毒蛋白嵌合基因，在病毒感染的細胞中經病毒誘導轉錄轉譯生成毒蛋白，反饋地抑制該病毒的複製和在植物中的擴散。適於控制含亞基因組正鏈RNA病毒或不含亞基因組正鏈RNA病毒、以及DNA病毒引起的一年生、多年生、無性繁殖、有性繁殖的植物的病毒病。此法對植物本身、人畜和環境無不良影響。
文檔編號A01H1/00GK1033645SQ8810559
公開日1989年7月5日 申請日期1988年10月22日 優先權日1988年10月22日
發明者王鈞 申請人:中國科學院上海植物生理研究所