篩選光肩星天牛引誘成分及製備光肩星天牛引誘劑的方法與流程
2023-10-10 07:10:39 4
本發明涉及林業森林保護學技術領域。
背景技術：
現有技術確認，伴隨著化學、生態及分子生物技術和研究方法的成熟，昆蟲綜合治理技術也發生了質的飛躍，這種飛躍體現在綜合利用昆蟲與寄主植物間、種間等的化學通訊基礎，從而從生態學、化學及生物技術領域開展昆蟲的防治措施研究，即利用寄主昆蟲、寄主植物、天敵等均可以釋放特定的具有吸引、拒避或不吸引寄主昆蟲對寄主植物選擇的揮發性化學物質來實現預防昆蟲的目的。
光肩星天牛是一種蛀幹類雜食性昆蟲，但寄主植物對光肩星天牛的吸引作用、危害程度具有一定的差異性，在同一地點栽植不同寄主樹種，存在只危害優勢寄主樹種，而不危害其他樹種的情況。如糖槭作為優勢寄主樹種，當與榆樹、白樺、楊樹、柳樹等樹種在同一地點栽植時，對糖槭都危害非常嚴重，而對其他樹種不危害或危害但不成災。研究也證明，糖槭揮發物對光肩星天牛的引誘作用明顯高於其他樹種揮發物。
從現有研究技術來看，國內外相關光肩星天牛引誘劑的內容也比較多，主要從單純的光肩星天牛性信息素成分提出性引誘劑的製作方法及現有其它的植物源引誘劑應用到光肩星天牛的防治中，以上方法均從單一方面的寄主植物或植食性昆蟲角度提出，然而昆蟲在實際的生存環境中，昆蟲對寄主植物的定向選擇，是對寄主植物釋放的揮發物和昆蟲自身釋放的聚集信息素成分混合物的一種綜合反映。同時，作為光肩星天牛寄主樹種揮發物和聚集信息素成分較多，利用常用單一的嗅覺行為測試，很難篩選出高效的引誘活性成分。
技術實現要素：
本發明的目的是為了解決現有技術均從單一方面的寄主植物或植食性昆蟲角度提出，很難篩選出高效的引誘活性成分的缺點，而提出一種篩選高效引誘成分及製備光肩星天牛引誘劑的方法。
一種篩選光肩星天牛引誘成分的方法包括以下步驟：
步驟一：提取及純化光肩星天牛觸角感器的總rna；
步驟二：獲取光肩星天牛氣味結合蛋白全長；
步驟三：構建光肩星天牛氣味結合蛋白的原核表達載體；
步驟四：光肩星天牛重組氣味結合蛋白的誘導及純化；
步驟五：光肩星天牛引誘成分的篩選。
一種製備光肩星天牛引誘劑的方法的具體過程為：
將9種糖槭揮發物與8種光肩星天牛聚集信息素揮發物以體積比2:1混合後，按照體積比1:2溶於液體石蠟，製成光肩星天牛引誘劑；
所述9種糖槭揮發物順-3-己烯醇、4-己烯，1-乙酸酯、十六烷酸甲酯、乙酸己酯、3-己烯，1-乙酸酯、4-己烯，1-丁酸酯、4-己烯，1-戊酸酯、2-二丙基-己二酸酯、鄰苯二甲酸二異辛酯的質量百分比依次為：2.78：34.70：5.06：2.07：0.38：12.36：6.38：5.74：0.79；
所述8種光肩星天牛聚集信息素揮發物2-甲基-二十二烷、順式-9-二十三烯、順式-9-二十五烯、順式-7-二十五烯、順式-9-二十七烯、順式-7-二十七烯、4-庚氧基-丁醛、4-庚氧基-正丁醇的體積比為：0.5：1：2：1：0.5：0.5：1:1。
本發明的有益效果為：
本發明在現有研究的基礎上，選擇從綜合趨性行為和分子生物學手段篩選光肩星天牛優勢寄主樹種糖槭的揮發物和光肩星天牛聚集信息素中高效的引誘活性成分，通過誘捕試驗從而確立引誘劑的最佳配方。對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方為糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。
本發明的目的在於提供一種利用觸角氣味受體蛋白篩選光肩星天牛優勢寄主樹種糖槭揮發物和聚集信息素的高效引誘成分方法及利用高效的植物源引誘成分及聚集信息素成分製備光肩星天牛引誘劑的方法。其創新點在於利用具有引誘作用的光肩星天牛優勢寄主樹種特定比例的糖槭揮發物及光肩星天牛特定比例的聚集信息素中揮發物成分按不同比例混合，篩選出具有高效引誘作用的特定比例的高效引誘成分的引誘劑混合物。
附圖說明
圖1為觸角總rna0.01瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2為目標蛋白pet-32a(+)-agla-obp1電泳圖；
圖3為目標蛋白pet-32a(+)-agla-obp2電泳圖；
圖4為純化後目標蛋白pet-32a(+)-agla-obp1電泳圖；
圖5為純化後目標蛋白pet-32a(+)-agla-obp2電泳圖；
圖6為不同配比引誘劑配方對光肩星天牛的eag反應圖；
圖7為不同配比的引誘劑配方對光肩星天牛嗅覺趨性圖；
圖8為野外誘捕光肩星天牛防治效果。
具體實施方式
具體實施方式一：一種篩選光肩星天牛引誘成分的方法包括以下步驟：
步驟一：提取及純化光肩星天牛觸角感器的總rna；
步驟二：獲取光肩星天牛氣味結合蛋白全長；
步驟三：構建光肩星天牛氣味結合蛋白的原核表達載體；
步驟四：光肩星天牛重組氣味結合蛋白的誘導及純化；
步驟五：光肩星天牛引誘成分的篩選及鑑定。
具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：所述步驟一中光肩星天牛觸角感器的總rna的提取及純化的具體過程為：
利用trizol試劑提取光肩星天牛觸角總rna，利用非酶dna清除-a(dna-be-gone-a)清除總rna中殘留的dna，並利用0.01瓊脂糖凝膠電泳檢測總rna完整性；利用smartivoligonucleotide和cdsⅲ/3′pcrprimer(引物)反轉錄，42℃繁育1h，生成cdna第一鏈。
其它步驟及參數與具體實施方式一相同。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：所述步驟二中獲取光肩星天牛氣味結合蛋白全長的具體過程為：
agla-obp1、agla-obp2的引物設計，
agla-obp1引物序列：
forward：5'-atgaaactttttgtattcgtcc-3'
reverse：5'-ttagggcaagaaataattcgag-3'
agla-obp2引物序列：
forward：5'-atgtcgctcagaatcgttatcg-3'
reverse：5'-ctataccaggaaccagttctcc-3'
光肩星天牛氣味結合蛋白agla-obp1和agla-obp2cdna的擴增、克隆和測序。以反轉錄酶合成cdna第一鏈為模板，用引物對其進行pcr擴增；反應體系：pfu0.5μl，pfubuffer+mg2+(so42-)5.0μl，dntp4.0μl，cdna1.0μl，agla-obp1-forward1.0μl，agla-obp1-reverse1.0μl，ddh2o37.5μl；pcr擴增程序：95℃3min；95℃30s、62.1℃30s、72℃40s，35個循環；72℃10min；將pcr產物4℃保存，經瓊脂糖凝膠電泳並割膠純化，克隆於pmd18-tvector載體內，鑑定並送生物公司進行測序，從而獲得目的基因序列。
其它步驟及參數與具體實施方式一或二相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：所述步驟三中構建光肩星天牛氣味結合蛋白的原核表達載體的具體過程為：
光肩星天牛氣味結合蛋白agla-obp1和agla-obp2屬於氣味結合蛋白minusc亞蛋白家族，含有6個保守的cys，形成3對二硫鍵。利用原核表達載體構建融合蛋白表達系統方法，對pet-32a(+)載體進行改造，去除載體自帶的thrombin酶切位點；設計帶有xhai和xhoi兩個酶切位點的引物，利用橋式pcr的方法將含有thrombin的一段鹼基去除，重新克隆出一段不含thrombin的載體序列。然後將從xbai-xhoi目的片段(不含thrombin)搭橋pcr擴增；對擴增的cdna片段使用xbai和xhoi對pet-32a(+)和cdna片段進行酶切，後與經過相同酶切處理的pet-32a(+)載體進行連接，轉化宿主菌trans5α後，挑取單菌落、提質粒並進行酶切鑑定。
其它步驟及參數與具體實施方式一至三之一相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：所述光肩星天牛重組氣味結合蛋白的誘導及純化的具體過程為：
通過iptg誘導光肩星天牛重組氣味結合蛋白表達，並通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對其進行純化；
目的蛋白的原核表達：將構建好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2質粒轉化進bl21(de3)感受態細胞，挑取單克隆或甘油菌接種至5ml含相應抗生素的lb培養液中，37℃，230r/min震蕩培養過夜；取1ml過夜培養物接入50ml含適量相應抗生索的lb培養液中，37℃，搖床230r/min培養，3h後取培養物20ml轉接至1l含適量相應抗生素的lb培養液中，37℃，搖床230r/min培養至od6000.6-0.8；在篩選出的誘導條件16℃，iptg濃度為0.5mm，誘導過夜，誘導表達靶蛋白；於4℃以6000r/min離心15min收集細胞，將溼菌體保存於-80℃繼續後面的純化；
目標蛋白pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的純化：將400ml誘導好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2菌體重懸於裂解液buffera中，buffera由ph7.0，40mmtris，300mmnaci，5％glycerol組成，按照菌液:buffera＝2l：50ml的比例溶解菌體；再加入psmf(100mm),50ml菌體溶液加入50μlpsmf，mgc12(1m)，5oml溶液加入50μlmgci2，和dnase(24mg/ml)，1l菌加入10μldnase混勻後高壓破菌，壓力為1200bar，直至菌液呈水滴狀流出即可(3-4遍)，再於4℃，6000r/min，1h，取上清至平衡好的鎳nta瓊脂糖凝膠柱，並依次用不同咪唑梯度(0mm,10mm,50mm，100mm,250mm,500mm(100％bufferb)的溶液進行洗脫，共計七次，收集7管洗脫液後，每管各取10ul進行sds-page分析，檢測目的蛋白的純度；
收集含有純pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重組蛋白的洗脫液後，將其轉移至透析袋中，在500ml含濃度遞減尿素(初始濃度7mol/l)的pbs緩衝液(ph7.4)中，在4℃下透析72h，且每隔8h更換一次pbs緩衝液。
其它步驟及參數與具體實施方式一至四之一相同。
具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：所述步驟五中光肩星天牛引誘劑成分的篩選的具體過程為：
利用競爭性螢光結合方法獲得光肩星天牛重組氣味蛋白與糖槭揮發物及光肩星天牛聚集信息素揮發物的結合反應譜，篩選出高效引誘光肩星天牛的糖槭揮發物及聚集信息素成分，9種糖槭揮發物和光肩星天牛聚集信息素8種揮發物均能和光肩星天牛pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2產生結合反應。
其它步驟及參數與具體實施方式一至五之一相同。
具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是：所述9種糖槭揮發物具體為：
順-3-己烯醇(3-hexen-1-o1,(z))、4-己烯，1-乙酸酯(4-hexen-1-o1,acetate)、十六烷酸甲酯(methylpalmitate)、乙酸己酯(aceticacid,hexylester)、3-己烯，1-乙酸酯((z)-3-hexen-1-olacetate)、4-己烯，1-丁酸酯(butanoicacid,4-hexen-1-ylester)、4-己烯，1-戊酸酯(pentanoicacid,4-hexen-1-ylester)、2-二丙基-己二酸酯(hexanedioicacid,bis(2-methylpropyl)ester)、鄰苯二甲酸二異辛酯(diisooctylphthalate)。
其它步驟及參數與具體實施方式一至六之一相同。
具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：所述8種揮發物發物具體為：
2-甲基-二十二烷(2-methyldocosane)、順式-9-二十三烯((z)-9-tricosene)、順式-9-二十五烯((z)-9-pentacosene)、順式-7-二十五烯((z)-7-pentacosene)、順式-9-二十七烯((z)-9-heptacosene)、順式-7-二十七烯((z)-7-heptacosene)、4-庚氧基-丁醛(4-(heptyloxy)-butana)、4-庚氧基-正丁醇(4-(heptyloxy)-butan-1-ol)。
其它步驟及參數與具體實施方式一至七之一相同。
具體實施方式九：一種製備光肩星天牛引誘劑的方法的具體過程為：
選擇將相對螢光強度降低至50％以下，且結合常數在13-45umol/l的糖槭揮發物及光肩星天牛聚集信息素成分作為引誘劑的成分；通過不同比例的糖槭揮發物成分與聚集信息素成分的混合，通過gc-eag、室內嗅覺趨性測定及野外誘捕試驗，確定最佳引誘劑配方。
按照篩選出的9種糖槭揮發物含量比例設定糖槭揮發物混合物、8種光肩星天牛聚集信息素揮發物含量比例設定聚集信息素混合物；以糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合後1:2溶於液體石蠟，形成不同比例配方，以液體石蠟為作為對照(ck)，利用gc-eag篩選出對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。室內趨性測定：利用y型嗅覺儀以液體石蠟作為對照(ck)，測定引誘劑糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合後1:2溶於液體石蠟對光肩星天牛的嗅覺趨性，結果顯示，對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方為糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。
採用以下實施例驗證本發明的有益效果
實施例一：
篩選(高效)光肩星天牛引誘劑成分及製備光肩星天牛引誘劑的方法包括以下步驟：
1)光肩星天牛觸角感器總rna的提取及純化：
①供試光肩星天牛成蟲採於哈爾濱市糖槭綠化樹，與7月中旬至8月期間，現採現用，利用trizol試劑提取光肩星天牛觸角總rna。
②利用非酶dna清除-a(dna-be-gone-a)清除總rna中殘留的dna，並利用0.01瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，如圖1所示。
③利用smartivoligonucleotide和cdsⅲ/3′pcrprimer反轉錄，42℃繁育1h，生成cdna第一鏈。
2)利用rt-pcr獲得光肩星天牛氣味結合蛋白的具體步驟。
①光肩星天牛氣味結合蛋白agla-obp1、agla-obp2的引物設計。根據genbank中光肩星天牛氣味結合蛋白agla-obp1、agla-obp2(2010，王偉)的基因序列，利用軟體oligo7.0進行引物設計。
②agla-obp1引物序列:
forward：5'-atgaaactttttgtattcgtcc-3'.
reverse：5'-ttagggcaagaaataattcgag-3'.
③agla-obp2引物序列：
forward：5'-atgtcgctcagaatcgttatcg-3'.
reverse：5'-ctataccaggaaccagttctcc-3'.
④光肩星天牛氣味結合蛋白agla-obp1和agla-obp2cdna的擴增、克隆和測序。以反轉錄酶合成cdna第一鏈為模板，用引物對其進行pcr擴增。反應體系：pfu0.5μl,pfubuffer+mg2+(so42-)5.0μl,dntp4.0μl,cdna1.0μl,agla-obp1-forward1.0μl,agla-obp1-reverse1.0μl,ddh2o37.5μl。pcr擴增程序：95℃3min；95℃30s、62.1℃30s、72℃40s，35個循環；72℃10min。
⑤將pcr產物4℃保存，經瓊脂糖凝膠電泳並割膠純化，克隆於pmd18-tvector載體內，鑑定並送生物公司進行測序，從而獲得目的基因序列，如圖1所示。
3)光肩星天牛氣味結合蛋白原核表達載體的構建。
①二硫鍵的異源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達：光肩星天牛氣味結合蛋白agla-obp1和agla-obp2屬於氣味結合蛋白minusc亞蛋白家族，含有6個保守的cys，形成3對二硫鍵。利用原核表達載體構建融合蛋白表達系統方法，對pet-32a(+)載體進行改造，去除載體自帶的thrombin酶切位點。
②設計帶有xhai和xhoi兩個酶切位點的引物，利用橋式pcr的方法將含有thrombin的一段鹼基去除，重新克隆出一段不含thrombin的載體序列。然後將從xbai-xhoi目的片段(不含thrombin)搭橋pcr擴增；對擴增的cdna片段使用xbai和xhoi對pet-32a(+)和cdna片段進行酶切，後與經過相同酶切處理的pet-32a(+)載體進行連接，轉化宿主菌trans5α後，挑取單菌落、提質粒並進行酶切鑑定。
4)通過iptg誘導光肩星天牛重組氣味結合蛋白表達，並通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對其進行純化。
①目的蛋白的原核表達：將構建好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2質粒轉化進bl21(de3)感受態細胞，挑取單克隆或甘油菌接種至5ml含相應抗生素的lb培養液中，37℃,230r/min震蕩培養過夜。取1ml過夜培養物接入50ml含適量相應抗生索的lb培養液中，37℃,搖床230r/min培養，3h後取培養物20ml轉接至1l含適量相應抗生素的lb培養液中,37℃，搖床230r/min培養至od6000.6-0.8。在篩選出的最佳誘導條件16℃，iptg濃度為0.5mm，誘導過夜，誘導表達靶蛋白，如圖2和圖3所示。於4℃以6000r/min離心15min收集細胞，將溼菌體保存於-80℃繼續後面的純化。
②目標蛋白pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的純化：將400ml誘導好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2菌體重懸於裂解液buffera中，buffera由ph7.0,40mmtris，300mmnaci,5％glycerol組成，按照菌液:buffera＝2l：50ml的比例溶解菌體。再加入psmf(100mm),50ml菌體溶液加入50μlpsmf,mgc12(1m),5oml溶液加入50μlmgci2,和dnase(24mg/ml),1l菌加入10μldnase混勻後高壓破菌，壓力為1200bar，直至菌液呈水滴狀流出即可(3-4遍)，再於4℃,16000r/min,1h,取上清至平衡好的鎳nta瓊脂糖凝膠柱，並依次用不同咪唑梯度的溶液進行洗脫，共計七次，收集7管洗脫液後，每管各取10ul進行sds-page分析，檢測目的蛋白的純度，其中1-7為收集管位置，如圖4和圖5所示。
③收集含有純pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重組蛋白的洗脫液後，將其轉移至透析袋中，在500ml含濃度低減尿素(初始濃度7mol/l)的pbs緩衝液(ph7.4)中，在4℃下透析72h，且每隔8h更換一次pbs緩衝液。然後利用bradford法對透析好的融合蛋白測定濃度，轉移至1.5mleppendorf微量離心管內，保存於-80℃冰箱備用。
5)利用競爭性螢光結合方法獲得光肩星天牛重組氣味蛋白與糖槭揮發物及光肩星天牛聚集信息素揮發物的結合反應譜，篩選出高效引誘光肩星天牛的糖槭揮發物及聚集信息素成分。
①將螢光配基1-npn溶於甲醇中，配製成1mmol/l的溶液，4℃條件下避光保存，取1.5μmol/lpet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2置於1cm四通的螢光比色皿中，向比色皿中逐次加入1mmol/l的1-npn溶液進行螢光掃描，每次加入後反應2min，在282波長下激發，記錄螢光發射光譜，及最大發射波長328nm處的螢光強度根據scatchard方程(1)線性化光譜數據：
其中dt和d分別表示總的和體系中游離的1-npn濃度，pt為pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重組蛋白的濃度，k為1-npn與pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的結合常數，n為結合位點數。可得到1-npn與agla-obp1/agla-obp2的解離常數。
其中ic50為競爭配基能替換50％的1-npn時的濃度，1-npn為未結合1-npn的濃度，k1-npn為pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2與1-npn的解離常數。
②選取不同糖槭葉片氣味揮發物及光肩星天牛聚集信息素揮發物進行競爭性螢光結合試驗，對利用gcsm鑑定出的26種糖槭揮發物，篩選出9種糖槭揮發物和光肩星天牛聚集信息素8種揮發物均能和光肩星天牛pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2產生結合反應，具體結果如1、表2。
表1糖槭揮發物配基與1-npn和重組pet-32a(+)-agla-obp1、pet-32a(+)-agla-obp2(a1/a2)蛋白的競爭結合
表2光肩星天牛聚集信息素配基與1-npn和重組pet-32a(+)-agla-obp1、pet-32a(+)-agla-obp2(a1/a2)蛋白的競爭結合
6)光肩星天牛引誘劑配方的提出：
①gc-eag篩選最佳配方：按照上述篩選出的高效的9種糖槭揮發物含量比例設定糖槭揮發物混合物、8種光肩星天牛聚集信息素揮發物含量比例設定聚集信息素混合物；而後以糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合後1:2溶於液體石蠟，形成不同比例配方，以液體石蠟為作為對照(ck)，利用gc-eag篩選出對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝2:1，如圖6。
②室內趨性測定：利用y型嗅覺儀以液體石蠟作為對照(ck)，測定引誘劑糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合後1:2溶於液體石蠟對光肩星天牛的嗅覺趨性，結果顯示，對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方為糖槭揮發物混合物：聚集信息素混合物＝2:1，如圖7所示。
7)野外誘捕試驗：利用上述所得到的的引誘劑配方，採用實用新型專利cn201620147068.7中誘捕器及誘捕方法，於2016年7月下旬於9月上旬進行野外誘捕光肩星天牛，分別調查對照區(ck)和誘捕區(yb)30株糖槭樹上光肩星天牛成蟲數量，對照區共計11頭，而誘捕區共計189頭，平均單株蟲口數降低了5.93頭，說明本發明所獲得的引誘劑配方對光肩星天牛的防治效果明顯，如圖8所示。與現有單純的以性信息素及植物揮發物作為光肩星天牛引誘劑比較，具有明顯的引誘效果。
本發明還可有其它多種實施例，在不背離本發明精神及其實質的情況下，本領域技術人員當可根據本發明作出各種相應的改變和變形，但這些相應的改變和變形都應屬於本發明所附的權利要求的保護範圍。