用作細胞穿膜肽的肽的製作方法

2023-10-04 22:10:44 3

專利名稱：用作細胞穿膜肽的肽的製作方法
用作細胞穿膜肽的肽
細胞穿膜肽(CPPs)例如觸角足來源的穿膜肽 (antennapedia-derived penetratin)(Derossi 等人，J. Biol. Chem. ， 269， 10444-10450, 1994)和Tat肽(Vives等人，J. Biol. Chem. ， 272， 16010-16017， 1997)是廣泛用於將貨物分子(cargo molecule)例如肽、蛋白質和寡核苷酸(Fischer等人，Bioconjug. Chem. ， 12， 825-841， 2001)遞送入細胞的工具。應用領域從純細胞生 物學到生物醫學研究(Dietz和Bahr， Mol. Cell.， Neurosci， 27， 85-131， 2004)。最初，細胞吸收據認為是通過質膜的直接滲透而發生 的(Prochiantz， Curr. Opin. Cell Biol.， 12， 400-406， 2000)。 過去，已積累的證據表明對於幾種CPP，細胞內吞作用至少明顯促成 幾種CPP的細胞吸收(關於綜述，參見Fotin-Mleczek等人，Curr. Pharm. Design, 11， 3613-3628， 2005)。基於這些近年來的結果， 作為CPP的肽的詳細說明因而不牽涉特定的細胞輸入機制，而是指作 為肽的功能，即當所述肽與貨物共價或非共價輟合時，增加貨物分子 的細胞p及收。
儘管已證明此類CPP原則上適合用於將肽、蛋白質和寡核苷酸遞 送入細胞，但仍然存在對提供允許遞送此類分子如貨物分子的其他 CPP的需要。特別地，存在對(i)允許從內吞溶酶體(endolysosomal ) 途徑快速釋放貨物分子和(ii)避免在人中應用時產生免疫反應的CPP 的需要。
通過肽解決了第一方面中的本發明背後的問題，所述肽具有包含 人乳鐵蛋白或牛乳鐵蛋白的至少8個連續胺基酸的胺基酸序列，其中 所述肽適合用作細胞穿膜肽。
在第一方面的實施方案中，肽包含至少4個陽離子胺基酸。 在第一方面的實施方案中，人乳鐵蛋白具有SEQ. ID. No. l所
示的胺基酸序列，牛乳鐵蛋白具有SEQ. ID. No. 2所示的胺基酸序列。 在第一方面的實施方案中，肽包含至少2個Cys殘基或其類似物。 在第一方面的優選實施方案中，肽包含由2個Cys殘基產生的二
硫鍵或由半胱氨酸類似物形成的類似的鍵。
在第一方面的實施方案中，肽包含具有長度為大約12至20個氨
基酸的ct螺旋構象的部分和具有長度為大約8至12個胺基酸的P摺疊
片構象的部分。
在第一方面的實施方案中，肽包含大約8至大約60個胺基酸殘基。
在第一方面的優選實施方案中，肽包含大約20至大約45個氨基 酸殘基。
在第一方面的實施方案中，肽具有相應於SEQ. ID. No. 1所示的氨 基酸序列的胺基酸位置20至64的胺基酸序列。
在第一方面的實施方案中，肽具有胺基酸序列，其中肽的N末端 是相應於SEQ. ID. No. 1或SEQ. ID. No. 2所示的胺基酸序列的胺基酸 位置20至64的胺基酸。
在第一方面的實施方案中，肽選自
具有胺基酸序列KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR(SEQ. ID. No. 3)的肽， 具有胺基酸序列CFQWQRNMRKVRGPPVSC (SEQ. ID. No.4)的肽， 具有胺基酸序列FQWQRNMRKVRGPPVS (SEQ. ID. No. 5)的肽， 具有胺基酸序列FQWQRNMRKVR (SEQ. ID.No. 6)的肽, 具有胺基酸序列KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR(SEQ ID No. 29)的肽，
和
具有胺基酸序列CRRWQWRMKKLGAPSITC (SEQ ID No. 30)的肽 和其衍生物。
在本發明的優選實施方案中，細胞穿膜肽包含SEQ IDNo. 3、 SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 30所示的胺基酸序列或具 有對所述序列至少40%，優選至少50%和特別優選至少75%或至少90% 的同一性的序列。
以至少40。/。的同一性包含SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 30的肽優選特徵在於，SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 29各自1至13個胺基酸的置換或缺失，SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 30各自1至10個胺基酸的置換或缺失。其中具有用同源胺基酸 產生的一個或更多個胺基酸的置換的序列具有增加的吸引力。
包含SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 30所示的胺基酸序列或具有至少40%的同一性的序列的肽各自包含至 少8個胺基酸(來源於SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 30的肽)、9個 胺基酸(來源於SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 29的肽)。所述肽具有 優選10至45個胺基酸和優選14至25個胺基酸。
包含SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 30的胺基酸序列的優選肽具有陽離子電荷，特別是至少4個位於SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 30中的陽 離子胺基酸的陽離子電荷。所述肽的其他優選特徵是存在可形成二硫 鍵或類似的鍵的至少2個半胱氨酸或半胱氨酸類似物。2個半胱氨酸 或其類似物包圍至少6個胺基酸，優選12至43個胺基酸。
在第一方面的優選實施方案中，肽是SEQ. ID. No. 2至5中任一 個的肽的衍生物，其中曱硫氨酸殘基被選自纈氨酸、異亮氨酸、正纈 氨酸、亮氨酸和正亮氨酸的胺基酸置換。
在第一方面的更優選實施方案中，肽是具有選自下列序列的氨基 酸序列的肽
KCFQWQR證KVRGPPVSCIKR (SEQ. ID. No. 7)
KCFQWQRNIRKVRGPPVSCIKR (SEQ. ID. No. 8)
KCFQ,證KVRGPPVSCIKR (SEQ. ID. NO. 9),其中X是正纈氨酸，
KCFQWQRNLRKVRGPPVSCIKR (SEQ. ID. No. 10)，
KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR(SEQ. ID. No. 28)，其中X是正亮氨酸，
CFQWQRNVRKVRGPPVSC (SEQ. ID. NO. 11)，
CFQWQRNIRKVRGPPVSC (SEQ.ID.NO. 12)，
CFQWQR證KVRGPPVSC (SEQ. ID. NO. 13)，其中X是正纈氨酸，CFQWQRNLRKVRGPPVSC (SEQ. ID. NO. 14)， CFQWQRNXRKVRGPPVSC(SEQ. ID. No. 15)，其中X是正亮氨酸， FQWQRNVRKVRGPPVS (SEQ. ID. NO. 16)， FQWQRNIRKVRGPPVS (SEQ. ID. No. 17)，
FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ. ID. No. 18)，其中X是正纈氨酸， FQWQRNLRKVRGPPVS (SEQ. ID. No. 19)，
FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ. ID. No. 20)，其中X是正亮氨酸， FQWQRNVRKVR (SEQ. ID. NO. 21)， FQWQRNIRKVR (SEQ. ID. NO. 22)， FQWQRNXRKVR(SEQ. ID. NO. 23)，其中X是正纈氨酸， FQWQRNLRKVR (SEQ. ID. NO. 24)，和 FQWQRNXRKVR (SEQ. ID. No. 25)，其中X是正亮氨酸。 在第一方面的實施方案中，衍生物具有優選選自硫醚的連接基團 (linkage group),其中連接基團取代了由這些Cys殘基形成的二硫 鏈。
在第一方面的實施方案中，優選通過整合放射性標記的胺基酸來 對肽進行放射性標記，其中更優選放射性標記的胺基酸是氮標記的氨 基酸。
在第一方面的實施方案中，肽還包含適合使用用於檢測的方法進 行檢測的部分，其中該部分優選選自螢光基團、放射性示蹤劑和半抗 原，其中優選半抗原是生物素。
也通過複合物在第二方面解決本發明背後的問題，所述複合物包 含選自第一方面的肽的肽、人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白和貨物分子。
在第二方面的實施方案中，貨物分子與肽共價或非共價結合。
在第二方面的實施方案中，貨物分子選自核酸、胺基酸、肽、蛋 白質、糖類、脂質和小分子以及其任意的混合物。
在第二方面的實施方案中，貨物分子以結構或結構的部分的形式 存在，其中結構選自納米顆粒、微粒、脂質體和微團。
在第二方面的優選實施方案中，核酸是選自DNA分子、RNA分子、 PM分子、siRNA分子、反義分子、核酶、適配體(aptamer )、 spiegelmer
和諫餅分子(decoy molecules)的核酸。
在第二方面的可選擇的優選實施方案中，肽選自用於接種的肽。 在第二方面的其他可選擇的優選實施方案中，核酸是基於核酸的疫苗。
在第二方面的其他可選擇的優選實施方案中，納米顆粒和/或微 粒包含或由藥物活性化合物組成。
也通過組合物在第三方面解決本發明背後的問題，所述組合物包 含至少選自第一方面的肽的肽、人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白以及貨物分 子。
通過包含第二方面的複合物的組合物在第四方面解決本發明背 後的問題。
也可通過核酸在第五方面解決本發明背後的問題，所述核酸編碼 第一方面的肽，且所述核酸優選具有SEQ. ID. No. 26或SEQ. ID. No. 27 所示的核酸序列。
通過包含第五方面的核酸和貨物分子的組合物在第六方面解決 本發明背後的問題。
在第六方面的優選實施方案中，貨物分子是核酸，更特別地是適 合用於接種的RNA。
在第六方面的優選實施方案中，貨物分子是編碼肽的核酸。
在第六方面的優選實施方案中，第五方面的核酸與編碼肽的核酸 可操作地連接。
在第六方面的更優選實施方案中，第五方面的核酸與編碼肽的核 酸符合讀框地連接。
在第六方面的實施方案中，肽是藥物活性劑。 也通過將第一方面的肽用作細胞穿膜肽來在第七方面解決本發 明背後的問題。
也通過將人乳鐵蛋白或其功能性衍生物或牛乳鐵蛋白或其功能 性衍生物用作細胞穿膜肽來在第八方面解決本發明背後的問題。
在第八方面的實施方案中，人乳鐵蛋白具有包含SEQ. ID. No. 1 所示的胺基酸序列的胺基酸位置20至711的胺基酸序列或其功能性衍 生物和/或牛乳鐵蛋白具有包含SEQ. ID.No. 2所示的胺基酸序列的氨 基酸位置20至708的胺基酸序列或其功能性衍生物。
也通過將第一方面的肽用作轉染劑來在第九方面解決本發明背 後的問題。
也可通過將人乳鐵蛋白或其功能性衍生物或牛乳鐵蛋白或其功 能性衍生物用作轉染劑來在第十方面解決本發明背後的問題。
在第十方面的實施方案中，人乳鐵蛋白具有包含SEQ. ID. No. 1 所示的胺基酸序列的胺基酸位置20至711的胺基酸序列和/或牛乳鐵 蛋白具有包含SEQ. ID.No. 2所示的胺基酸序列的胺基酸位置20至708 的胺基酸序列或其功能性衍生物。
也通過將第三、第四和第六方面的組合物用於生產藥物來在第十 一方面解決本發明背後的問題。
在第十一方面的實施方案中，貨物分子是藥物活性劑。
通過將第三、第四和第六方面的組合物用於生產診斷劑來在第十 二方面解決本發明背後的問題。
在第十二方面的實施方案中，貨物分子是診斷標記。
本發明者令人吃驚地發現人和牛乳鐵蛋白和更特別地其肽(此處 也稱為本發明的肽)適合用作細胞穿膜肽(CPP)，從而可將貨物分子遞 送至細胞的細胞質。CPP優選是適合穿透細胞膜，更優選哺乳動物細 胞的質膜的任何肽或蛋白質。然而要理解，優選術語CPP不牽涉特定 的細胞輸入機制。更特別地，本發明者已認識到特定的來源於人乳鐵 蛋白的肽以高效的方式從內吞溶酶體區室釋放出來，這反過來伴隨著 任何貨物分子的高效釋放。 一旦在細胞質中可獲得貨物分子時，它們 就可發揮與其相關的任何作用。就此而言，本發明的多肽提供了用於影 響細胞的生物學機制和途徑的有效手段，其可用於研究以及治療和診 斷應用。如本文所用的和除非另外指出，本發明的肽優選還包括優選 本文定義的人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白。
本發明的肽基本上是人或牛乳鐵蛋白的片段，或其衍生物。因為 該來源，本發明的肽，除了它們適合用於將貨物分子遞送至細胞質外， 就各肽將不在暴露於本發明的各肽的人或牛宿主中引發免疫反應而 言，還展示有益的免疫特徵。
人乳鐵蛋白(hLF)是77 kDa、 692個胺基酸的鐵結合性糖蛋白， 該蛋白構成了人母乳中包含的蛋白質量的15%,還可發現該蛋白以低 濃度存在於血漿中(Nemet和Simonovits， Haeraatologia (Budap. ) 18， 3-121985)。牛同源物(bLF)由688個胺基酸構成，其與hLF共有68% 的胺基酸同 一性(Crichton， Adv. Protein Chem. 40, 281-363， 1990)。然而，只有0. 5-1%的牛奶蛋白質是bLF。對於兩種蛋白質，已 報導了抗菌(0rsi， Biometals 17， 189-196， 2004; Ward和Conneely， Biometals 17， 203-208， 2004)、抗真菌、LPS結合(Vogel等人， Biochem. Cell Biol. 80， 49-63， 2002)和抗病毒特性(Berkhout等 人，Biometals 17， 291-294， 2004)以及幾個酶活性如DNA酶、RNA 酶、ATP酶和磷酸酶活性(Kanyshkova等人，Eur. J. Biochem. 270， 3353-3361， 2003)。乳鐵蛋白(LF)還可充當轉錄因子(He和Furmanski, Nature 373， 721-724， 1995)，和通過誘導白細胞介素的分泌而對免 疫調節起作用(Sorimachi等人，Biochem. Mol. Biol. Int. 43， 79-87， 1997; Vogel等人，2002)。
本發明的肽優選是人或牛乳鐵蛋白的N末端區域的片段。下面公徵。
優選，此類片段和從而本發明的肽包含至少4個陽離子胺基酸殘 基。更優選，此類片段是陽離子性的，即在生理pH值下具有總的正電荷。
本發明的肽可共有二級結構例如ot螺旋和P摺疊片的組合。特別 地此類螺旋和此類摺疊形成肽的單獨部分。最優選，肽包含螺旋-轉角 -摺疊片結構。此類部分的長度對於具有oc螺旋和P摺疊片的部分通常 分別在12至20個胺基酸和8至12個胺基酸的長度範圍內。
本發明的肽的優選實施方案固有的其他特徵是存在至少2個Cys 殘基。所述Cys殘基相互之間在空間上間隔許多間隔胺基酸。優選許 多此類間隔胺基酸的範圍在8至20個胺基酸，更優選14至18個氨基 酸和最優選16個胺基酸之間。在其他實施方案中，2個Cys殘基位於 本發明的多肽的N末端和C末端。在本發明的範圍之內的是，各Cys 殘基，單個地或組合地，位於或接近肽的末端，即形成肽的N末端和 C末端。可選擇地，所述Cys末端中的一個或兩個都不形成肽的各個 末端，但在N末端的情況下肽包含位於各Cys殘基的上遊的其他氨基 酸，或在C末端的情況下包含位於各Cys殘基下遊的其他胺基酸。在 更優選實施方案中，2個Cys殘基形成分子內二硫鍵，其中此類二硫 鍵優選在當應用或使用本發明的肽作為CPP時存在的條件下存在。本 領域技術人員已知在各肽合成後或合成過程中產生此類二硫鍵的方 法。在可選擇的實施方案中，2個Cys殘基形成了分子間二硫鍵。
在其他實施方案中，用結構和功能上取代二硫鍵但不受還原裂解 影響的部分取代二硫鍵(如果存在)。這樣的部分是例如，但不限於， 亞曱基(JACS ，1985， 107， 2986-2987， Bioorg. Med. Chem Letter 1999， 9， 1767-1772， J.Med. Chem， 2002， 45， 1767-1777)、石克醚 橋(thioether bridge) (Yu等人Tetrahedron Lett. 1998， 39， 6633-6636)、羥基橋(carbonyl bridge ) (Pawlak等人J. Pept. Sci. 2001， 7， 128- 140)和更長的脂肪族鏈(Tetrahedron Lett. 2001， 42， 5804-5804)，其中所述部分中的各個部分取代二硫鍵。取決於特定 的方案和用於連接2個胺基酸殘基的部分，用其他建築塊(building block)例如高絲氨酸對半胱氨酸殘基的置換可能是必需的(Yu等人 Tetrahedron Lett. 1998， 39， 6633-6636)，這是本領域寺支術人員所 公認的。優選更長的脂肪族鏈的長度為大約2至大約10個碳原子，其 中該範圍包括兩端之間的任何整數長度。
本發明的肽的長度優選在大約8個胺基酸殘基至大約60個氨基 酸殘基之間。更優選長度在15至45個胺基酸殘基，更優選在18至 22個胺基酸殘基之間。然而，本領域技術人員公認，肽的長度不必受
其限定，可由本領域技術人員使用此處提供的技術指南產生其衍生物。
仍然提供充當或可充當CPP的肽的任何可能的修飾在本發明的範圍之內。
在其他優選實施方案中，本發明的肽是人或牛乳鐵蛋白的片段。
優選人乳鐵蛋白具有SEQ. ID. No. l所示的胺基酸，牛乳鐵蛋白具有 SEQ. ID. No. 2所示的胺基酸序列。更優選，本發明的肽在其胺基酸序 列上相應於由SEQ. ID. No. 1所示的序列或SEQ. ID. No. 2所示的序列 的胺基酸位置20至64包含或定義的胺基酸的序列。然而，也在本發 明的範圍內的是，本發明的肽只有部分位於上面定義的人或牛乳鐵蛋 白的胺基酸序列的範圍之內。
在更優選實施方案中，本發明的肽來源於前面段落中指定的人或 牛乳鐵蛋白，且共有一個或多個，優選所有此處公開的其他結構特徵。
在其他實施方案中，本發明的肽是此處描述的和特別是前面段落 中公開的本發明的肽中的任何一個肽的衍生物。本領域技術人員將認 識到可改變所述肽的胺基酸序列而不使所述肽丟失用作CPP的特徵。 優選對胺基酸序列進行此類改變。更優選此類改變包括不同種類的氨 基酸的置換(通過相同種類的另一個胺基酸進行的置換)。這樣的種 類優選是中性胺基酸、疏水胺基酸(特別地包括脂肪族胺基酸)、陽離 子胺基酸、陰離子胺基酸、包含巰基的胺基酸、芳香族胺基酸和雜環 胺基酸。疏水胺基酸(包括脂肪族胺基酸)優選選自甘氨酸、丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，芳香族胺基酸優選選自苯丙氨酸、酪氨 酸和色氨酸，離子胺基酸優選選自陽離子胺基酸如賴氨酸、精氨酸、 組氨酸和陰離子胺基酸如aspartat和glutamat，中性胺基酸優選選 自絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和曱疏氨酸，包含巰基的氨 基酸優選是半胱氛酸和甲硫氨酸，雜環胺基酸優選是脯氨酸和組氨酸。 特別地位置46中的甲硫氨酸殘基可與脂肪族殘基例如但不限於纈氨 酸、正纈氨酸、亮氨酸或正纈氨酸互換。由於可通過有機合成的方案 獲得肽，因此胺基酸置換不限於蛋白胺基酸的置換。可將可通過合適 的化學方法整合的任何建築塊(包括，但不限於，非蛋白胺基酸和P
胺基酸)包含在肽內。
本發明的特別優選的肽是具有SEQ. ID. No. 3和SEQ. ID. No. 4 所示的胺基酸序列的肽和其各自的衍生物。
在本發明的範圍內的是如果本發明的肽是人或牛乳鐵蛋白，那 麼在優選實施方案中，這樣的肽也包括全長人或牛乳鐵蛋白的片段。 此類片段優選是功能活性片段。如此處所用的，人或牛乳鐵蛋白的功 能活性片段是或包含部分SEQ. ID. No. l或SEQ. ID. No. 2所示的氨基 酸序列，只要此類片段仍然展示CPP活性，優選此處定義的CPP活性。 優選可通過將各肽綴合至焚光色素或半抗原(所述螢光色素或半抗原 在該情況下用作報告基團和貨物分子並且使得能夠通過本領域技術人 員已知的方法檢測和定量細胞吸收)來確定所述肽作為CPP的活性或 CPP活性。此類方法包括但不限於(i)用於用作報告基團的螢光基團的 流式細胞術和螢光顯微鏡術或(ii)固定和透化細胞，然後與適合用於 檢測用作報告基團的半抗原的試劑一起溫育。可選擇地，可以例如通 過整合放射性標記的胺基酸來放射性標記CPP和使用放射照相術確定 細胞吸收。後一方法使得能夠在沒有任何貨物的情況下確定單獨的肽 的吸收和分布。要理解，在各方法所能允許的程度上，也可針對組織 和完整的生物確定和定量吸收和分布。可選擇地，可通過與CPP綴合 的貨物分子的生物學活性確定吸收，且貨物分子只有當分子進入細胞 和到達特定的亞細胞位置例如細胞質或細胞核後才展示其生物學活 性。
在其他實施方案中，本發明的肽還包含適合於檢測的部分。更明 確地，該部分允許進行肽的檢測。所述部分可以是適合於該目的的任 何基團。各部分對於本領域技術人員來說是已知的，然而，其包含但 不限於螢光基團例如羧基螢光素，或生物素。優選，利用螢光進行檢 測。可選擇地，還可例如在按照本領域技術人員已知的方案整合125碘 後利用放射性進行檢測。可在單個細胞、組織、器官或動物的水平上 進行檢測。優選動物是哺乳動物，更優選選自狗、綿羊、山羊、大鼠、 小鼠、牛、馬和人。
在本發明的其他方面，本發明的肽與貨物分子一起形成複合物。 這樣的貨物分子可以是此處定義的任何貨物分子。複合物可以是包含 至少一個本發明的肽和至少一個貨物分子的共價或非共價複合物。也
在本發明的範圍內的是，複合物包含超過一個本發明的肽，即多個此 類肽，其中多個肽可包多個相同的或不同的肽。此外，本發明的複合 物還可包含多個貨物分子，其中多個貨物分子可包含多個相同的或不 同的貨物分子。
在一個實施方案中，通過共價鍵形成本發明的肽和貨物分子之間 的複合物。優選在肽的合適的反應基團與貨物之間，更優選在本發明 的肽的末端與貨物之間形成此類共價鍵。取決於化學性質或貨物分子，
通過其形成此類共價鍵的部分、基團或根(radical )可發生改變，產 生這樣的鍵在本領域技術人員的範圍之內。在一個實施方案中，共價 鍵可以是本發明的肽的C末端的羧基與構成貨物分子的肽的N末端氨 基酸的oc氨基之間形成的醯胺鍵。可選擇地，可基於非共價鍵形成復 合物。此類非共價鍵可以是離子鍵、氫鍵或疏水相互作用或此類鍵的 組合。在一個實施方案中，可通過賴氨酸殘基的延伸形成此類非共價 鍵，所述賴氨酸殘基通過共價鍵附著至本發明的肽和寡核苷酸的磷酸 主鏈。優選賴氨酸的延伸由大約5至15個賴氨酸殘基組成。
貨物分子原則上在大小、化學性質和/或功能方面不受限制。據 此，貨物分子可選自核酸、肽、分子、脂質、糖類、納米顆粒和顆粒 以及其混合物。在優選實施方案中，貨物分子在由細胞生物學中的應 用或治療應設定的邊界範圍之內。
在實施方案中，核酸是由至少2個共價連接的核苷酸構成的任何 聚合物。在實施方案中，核酸可以是DNA分子或RNA分子或其混合物。 也在本發明範圍內的是，核酸由L核苷酸、D核苷酸或混合物組成。 在其他實施方案中，對於形成核酸的每一個或任何一個核苷酸或各自 的類似物，可單獨地和獨立地修飾核苷酸的鹼基部分、糖部分和/或磷 酸部分。特別優選的修飾的糖部分是在糖部分的2，原子上具有曱基、 曱氧基、乙基、乙氧基的糖部分。特別優選的修飾的磷酸酯部分是硫
代磷酸酯類(phosphothioate)。在另一個優選實施方案中，使用肽 核酸。
在另一個優選實施方案中，貨物分子是胺基酸，來源於L或D氨 基酸種類的胺基酸。胺基酸可以是任何胺基酸，無論是天然發生的或 非天然發生的。
在另一個優選實施方案中，貨物分子是肽，其由至少2個共價連 接(優選通過肽鍵連接)的胺基酸構成。在實施方案中，肽由L氨基 酸、D胺基酸或其混合物構成。胺基酸可以是任何胺基酸，無論是天 然發生的還是非天然發生的。因此，在優選實施方案中，術語肽還包 括本領域內通常理解的肽和蛋白質。肽或蛋白質可從天然來源純化而 來，或通過有機合成獲得或通過使用本領域技術人員熟悉的方案(例 如但不限於天然化學連接)將合成的胺基酸或肽綴合至從天然來源獲 得的肽或蛋白質而獲得。優選地，肽具有2至40個胺基酸，更優選2 至20個胺基酸和最優選4至15個胺基酸的長度。如此處所用的，術 語蛋白質優選是指含有二級結構和更優選三級結構的多肽。
在另一個優選實施方案中，貨物分子是小分子，其中小分子優選 是具有1000 D或更小的分子量的分子，更優選代表藥物或藥物候選物。 特別優選小分子種類是雜環小分子。
在另一個優選實施方案中，貨物分子是脂質體或脂質體的亞結構 (substructure)例如其部分。優選地，該種類的分子，當在質膜內
側或質膜中對細胞作用時，展示特定的功能。前者的實例是甘油二酯。 本實例舉例說明展示此特定功能的脂質優選選自細胞內信使。後者和
從而代表可能的貨物分子的實例是脂肽，優選具有S-[2， 3-雙(棕櫚醯 基氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕櫚醯-(R)-半胱氨醯-(S)-絲氨醯-四 -(S)-賴氨酸部分的脂肽和最優選具有S-[2， 3-雙(棕櫚醯基氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕櫚醯-(R)-半胱氨醯-(S)-絲氨醯-四-(S)-賴氨酸、 用作Toll樣受體的激動劑或拮抗劑的肽。
在另一個優選實施方案中，貨物分子是糖類。
在另一個優選實施方案中，貨物是用於磁共振影像學的造影劑
(contrasting agent)。此類照影劑是例如但不限於釓(III)-DTPA (二亞乙三胺五乙酸)或釓(III) -D0TA (1， 4， 7， 10-四氮雜環十二烷基 (Tetraazacyclododecane ) - 1, 4, 7， IO-四乙酸)。在另一個優選實施方案中，貨物分子是顆粒。顆粒可以是由例如 交聯的聚苯乙烯、交聯的N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺、交聯的葡聚糖、 脂質體或微團組成的聚合物顆粒。優選，顆粒用作功能性分子的載體 或容器。功能性分子可以是在細胞內產生功能的任何分子，例如化學 療劑和寡核苷酸以及優選可用作用於本發明的肽的貨物分子的分子。 通常功能性分子與顆粒的偶聯(分別將功能性分子裝栽入顆粒)旨在 例如通過延長其在生物中的循環來提高功能性分子的藥物代謝動力 學，而本發明的肽的偶聯介導此類功能性分子至細胞內的遞送。除了 本發明的肽以外，還可通過介導顆粒至特定細胞的靶向的部分或分子 修飾顆粒。此類靶向的一個實例是抗富集在癌細胞表面上的蛋白的抗 體。在一個實施方案中，顆粒可具有鐵磁核心。此類顆粒可用於應用 例如磁流體熱療(magnet ic fluid hyperthermia ) (Jordan等人，Int J Hyperthermia, 12, 705-722， 1996)。在另一個優選實施方案中，貨物分子是量子點(quantum dot)。 可通過共價偶聯，例如通過肽上的合適的官能團與量子點之間的醯胺 鍵形成，或通過非共價相互作用(例如生物素部分和偶聯至量子點的 鏈黴抗生物素蛋白分子之間的非共價相互作用)來獲得本發明的肽與 量子點的偶聯。在一個實施方案中，通過用半胱氨酸殘基延長細胞穿 膜肽來將細胞穿膜肽與量子點共價連接和使用異雙功能連接體將其偶 聯至氨基功能化(amino-functionalized)的量子點(S. Santra等人， ChemComm， 2005， 3144-3146)。在其他實施方案中，貨物分子可以以功能術語進行定義。 在特定的實施方案中，貨物分子是siRNA分子。 siRNA分子是針對耙核酸，優選編碼耙分子的mRM的小幹擾RNA。 siRM是通常具有大約21至大約23個核苷酸的長度的雙鏈RNA。兩個 RNA鏈中的一個的序列相應於待降解的靶核酸的序列。換句話說，已
知靶分子的核酸序列，優選mRNA的序列，可設計兩條鏈中的一條鏈對 所述靶分子的mRNA互補的雙鏈RNA，當將所述siRNA用於包含編碼靶 分子的基因、基因組DNA、 hnRNA或mRNA的系統時，各相應的把分子 將被降解，從而各蛋白的水平將降低。設計、構建和使用所述siRNA 作為藥物和診斷劑的基本原理，除其他以外，描述於國際專利申請WO 00/44895和W0 01/75164。在特定的實施方案中，貨物分子是核酶。核酶是優選由主要包含2個部分的RNA構成的具有催化活性的核 酸。第一部分顯示催化活性而第二部分負責與靶核酸的特異性相互作 用。在耙核酸和核酶的第二部分之間發生相互作用(通常通過2條雜 交鏈上的大體上配對的鹼基片段的雜交和Watson-Crick鹼基配對產 生的)後，催化活性部分可被激活，這意味著如果核酶的催化活性是 磷酸二酯酶活性，那麼其在分子內或分子間催化把核酸。結果，可發 生靶核酸的進一步降解，最後這導致靶核酸的降解以及由於缺少新合 成的相應於耙核酸的蛋白質和缺乏先前存在的各蛋白質的代謝迴轉 (turn-over)而引起的來源於所述靶核酸的蛋白質的降解。核酶、其 用途和設計原理對於本領域技術人員來說是已知的，且例如描述於 Doherty和Doudna (Ribozym structures and mechanism. Annu ref. Biophys. Biomolstruct. 2001; 30 : 457-75)以及Lewin和Ha歸irth (Ribozyme Gene Therapy: Applications for molecular medicine. 2001 7: 221—8)中。在特定的實施方案中，貨物分子是反義分子。反義寡核苷酸用於生產藥物和作為診斷劑的用途分別基於與 siRNA分子和核酶的作用模型相似的作用模式。基本上，反義寡核苷 酸基於鹼基互補性而與靶RNA (優選與mRNA)雜交，從而激活了 RNA 酶H。 RNA酶H被磷酸二酯和石克代磷酸酯偶聯的DNA激活。然而，除了 磷石危醯偶聯的DNA除例外，磷酸二酯偶聯的DNA被細胞核酸酶快速降 解。在與RNA雜交後，這些具有抗性的、非天然發生的DNA衍生物不 抑制RM酶H。換句話說，反義多核苷酸只有以DNA RNA雜交複合物
的形式存在時才有效。除其他以外，在美國專利US 5， 849， 902和US 5， 989， 912中描述了此類反義寡核苷酸的實例。換句話說，基於各靶列的靶蛋白推導的，或核酸序列本身是已知的)，可基於鹼基互補性 原理設計合適的反義寡核苷酸。特別提及的是具有短磷硫醯DM片段(3至9個鹼基)的反義寡 核苷酸。最小3個DNA鹼基是細菌RM酶H的激活所必需的和最小5 個鹼基是哺乳動物RNA酶H的激活所必需的。在此類嵌合型寡核苷酸 中，存在形成RNA酶H的底物的中心區域，該區域的側翼是由不形成 RNA酶H的底物的被修飾的核苷酸組成的雜交"臂"。可用例如2'-0-曱基或2'-氟修飾嵌合型寡核苷酸的雜交臂。可選擇的方法在所述臂 中使用曱基膦酸酯或磷醯胺(phosphoramidate )鍵。用於本發明的實 踐的反義寡核苷酸的其他實施方是P-曱氧基寡核苷酸、局部P-曱氧基 寡核苷酸脫氧核糖核苷酸或P-甲氧基寡核苷酸。在特定的實施方案中，貨物分子是適配體或spiegelmer。 適配體是為單鏈或雙鏈的且與靶分子特異性相互作用的D-核酸。 在例如歐洲專利EP 0 533 838中描述了適體的製造或選擇。基本上實 現下列步驟。第一，提供核酸即潛在的適體的混合物，其中各核酸通 常包含幾個(優選至少8個)隨後隨機化的核苷酸的片段。然後將該 混合物與靶分子接觸，其中核酸，例如基於與候選混合物相比增加的 對靶的親和力或以對其更大的作用力，與靶分子結合。然後將結合核 酸與混合物的其餘部分分離。任意地，使用例如聚合酶鏈式反應擴增 所獲得的核酸。可重複這些步驟數次，最後產生具有比例增加的對靼 (通過所述靶就可任意地選擇最終的結合核酸)特異性結合的核酸的 混合物。這些特異性結合的核酸稱為適體。很明顯，在用於產生或鑑 定適體的方法的任何階段，可使用標準技術用個體核酸的混合物的樣 品來確定其序列。在本發明的範圍內的是，可以例如通過導入本領域 技術人員已知的產生適體的確定的化學基團來穩定適體。此類修飾可 以例如是在核苷酸的糖部分的2'位置導入氨基。適體目前用作治療
劑。然而，也在本發明範圍內的是，所選擇或產生的適體可用於靶標 確認。可根據本發明使用的或產生的針對靶分子的spiegelmer的產生 和生產基於相似的原理。在國際專利申請WO 98/08856中描述了 spiegelmer的生產。Spiegelmer是L型核酸，這意味著它們由L型核 酸組成而不是(如適體那樣)由D型核苷酸組成的適體。Spiegelmer 的特徵在於它們在生物系統中具有非常高的穩定性且與適體相比，與 它們針對的耙分子特異性相互作用。為了產生spiegelmers，產生D 型核酸的異構群體，然後將該群體與靶分子的旋光對映體即與天然發 生的靶分子的L型對映異構體的D型對應異構體接觸。隨後，分離不 與耙分子的旋光對映體相互作用的D型核酸。然而，對與靶分子的旋 光對映體相互作用的D型核酸進行分離，任意地進行確定和/或進行測 序，然後基於從D型核酸荻得的核酸序列信息合成相應的L型核酸。 在序列方面與前述D型核酸(其與靶分子的旋光對映體相互作用)相 同的此類L型核酸將與天然發生的靶分子而不與其旋光對映體發生特 異性相互作用。類似於用於產生適體的方法，也可能重複不同的步驟 數次，從而富集與靶分子的旋光對映體特異性相互作用的核酸。在特定的實施方案中，貨物分子是通過與細胞內部的轉錄因子特 異性結合而用作誘鉺分子的短雙鏈寡脫氧核苷酸。此類誘斜分子據說 能夠被細胞有效吸收而無需特定的載體。預期可通過綴合至本發明的 CPP來進一步增加功效和細胞質遞送。在特定的實施方案中，貨物分子是抗體。抗體的生產對於本領域技術人員來說是熟知的，且例如，描述於 Harlow, E.，和Lane， D. ， "Antibodies: A Laboratory Manual, " Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY，(1988)中。 優選，可將可按照K6hler和Milstein的方案和基於其的進一步的發 展生產的單克隆抗體與本發明結合使用。此處使用的抗體包括，但不 限於，完整抗體、抗體片段或衍生物例如Fab片段、Fc片段和單鏈抗 體，只要它們適合和能夠結合蛋白激酶N P。除了單克隆抗體以外，
還可使用和/或產生多克隆抗體。多克隆抗體的產生對於本領域技術人
員來說也是已知的，且例如描述於Harlow， E.， 和Lane, D.， "Antibodies: A Laboratory Manual,'1 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY， (1988)。優選，用於治療目 的的抗體是上面定義的人源化抗體或人抗體。
可根據本發明使用的抗體可具有一個或幾個標誌或標記。此類標 志或標記可用於在其診斷應用或其治療應用中檢測抗體。優選標誌或 標記選自抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、生物素、金和螢光素和 用於例如ELISA法中。例如在E.，和Lane, D. ， "Antibodies: A Laboratory Manual, " Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)中描述了此類和其他標記以及方法。
也在本發明的範圍內的是，標記或標誌展示除了檢測以外的另外 的功能，例如與其他分子的相互作用。此類相互作用可以是例如與其 他化合物的特異性相互作用。此類其他化合物可以是其中使用抗體的 系統(例如人或動物身體)固有的化合物或通過使用各抗體進行分析 的樣品。合適的標記可以例如是具有其特異性相互作用伴侶例如抗生 物素蛋白和鏈黴抗生物素等(存在於與所標誌的或標記的抗體相互作 用的各化合物或結構上)的生物素或焚光素。
在特定的實施方案中，貨物分子是靶特異性結合肽。
可通過使用現有技術方法例如噬菌體展示法產生此類肽。基本 上，以例如噬菌體的形式產生肽文庫，然後將該類型的文庫與各自的 靶分子接觸。隨後從各反應取出優選以與靶分子的複合物的形式存在 的與靶分子結合的肽。本領域技術人員已知結合特徵至少一定程度上 取決於特定地實現的實驗設定例如鹽濃度等。在將以更高親和力或更 大的力結合靶分子的肽與文庫的非結合成員分離之後，和任選地也在 從耙分子和肽的複合物除去耙分子後，可隨後表徵各肽。在表徵前， 任選地，例如通過繁殖編碼肽的噬菌體來進行擴增步驟。表徵優選包 括靶結合肽的測序。基本上，肽在其長度上不受限定，然而，優選在 各方法中優選獲得具有大約8至20個胺基酸的長度的肽。文庫的大小可以是大約102至1018，優選108至1015個不同的肽，然而，不限定於此。
靶結合的肽的特定形式是所謂的"anticaline",除其他以外， 在德國專利申請DE 197 42 706中描述了該"anticaline"形式。
在其他方面，本發明涉及編碼本發明的肽的核酸。此類核酸可容 易地由本領域技術人員基於肽的胺基酸序列和遺傳密碼獲得。要認識 到，依賴於宿主生物，可改變特定的序列使之適合各宿主的密碼子選 擇(codon usage)。可從SEQ ID No. 26和SEQ ID No. 27獲得大 多數優選的本發明的肽的核酸序列。
在其他方面，本發明涉及編碼肽的核酸，其中所述肽由本發明的 肽和其他肽或蛋白質組成，其中所述蛋白通常稱為融合肽/蛋白。根據 本領域技術人員已知的方案，該核酸可用於重組蛋白的表達和純化， 或可與合適的載體一起用於通常稱為基因療法的治療策略，其中本發 明的肽構成所述重組蛋白的一部分。在優選實施方案中，整合至編碼
在另一個優選實施方案中，核酸編碼肽，其中肽優選用作細胞內分子 相互作用的竟爭抑制劑。在另一個優選實施方案中，核酸編碼肽，其 中肽優選用作細胞內酶反應的底物。在另一個優選實施方案中，核酸 編碼蛋白質的結構域，其中結構域優選用作細胞內分子相互作用的竟 爭抑制劑。在另一個優選實施方案中，核酸編碼酶，其中所述酶優選 自水解酶類。
在其他方面，本發明涉及此處定義的融合蛋白，更特別地涉及由 編碼本發明的融合蛋白的核酸編碼的融合蛋白。
在其他方面，本發明涉及包含本發明的任一複合物的組合物、包 含本發明的肽的組合物、包含編碼本發明的肽的核酸的組合物、包含 本發明的肽和貨物分子的組合物、包含本發明的融合蛋白的組合物、 包含人乳鐵蛋白和貨物分子的組合物。在本發明的範圍內的是，此類 本發明的組合物可包含一個或幾個本發明的肽、 一個或幾個本發明的 核酸和/或一個或幾個貨物分子。與之相應的是，優選術語"幾個"意
指幾個不同種類的各化合物或分子。本領域技術人員公認，組合物通 常包含許多本發明的肽的個體種類、許多編碼此類肽的核酸的種類和/ 或許多貨物分子的種類。與之相關的是，要理解可使用此處描述的任 何貨物分子。
在其他方面，本發明的涉及此處描述的任何組合物或其組分用作 轉染劑、用作藥物、用作診斷劑的用途。如果組合物用作藥物或用作 藥物組合物，優選貨物分子是藥物活性劑。此類藥物活性劑可以是化 學治療劑例如柔紅黴素或幹擾細胞內分子相互作用的肽，或此處描述 的作為貨物分子的任何分子，其中優選所述貨物分子具有藥物活性或
為此類藥物活性分子的前體形式(preform)。如果組合物用作診斷劑， 優選貨物分子是診斷標記。此類診斷標記可以是檢測細胞中病理相關 蛋白酶(例如參與細胞凋亡的起始和執行的caspase)的活性的螢光 底物。
在本發明的範圍內的是，優選將本發明的肽遞送至特定類型的細 胞或包含該特定類型的細胞的組織或器官。在優選實施方案中，通過 耙向部分或乾向分子(所述靶向部分或靶向分子以其整體在此處也稱 為靶向實體)介導此類特異性遞送。
在更優選實施方案中，此類靶向部分是本發明的肽的部分或貨物 分子的部分。可選擇地或此外，此類靶向部分是本發明的複合物或組 合物的部分。
靶向實體優選選自肽、蛋白質，包括抗體、抗體片段、單鏈抗體、 適體、spiegelmer和結合細胞表面受體的配體。本領域技術人員將承 認，原則上可使用提供乾的伴倡部分或相互作用伴侶的任何組合的分 子，如靶向實體。這包括針對在不同類型細胞上表達和更特別地過度 表達的受體的配體或在不同細胞類型上表達和更特別地過表達的配體 或分子的用途。在後一種情況下，其用作靶向實體的特別明顯的相互 作用伴侶選自抗體、適體、spiegelmer、高度特異性的結合肽和 anticaline。該類型的相互作用伴侶和其對於特定細胞類型的特異性 對於本領域技術人員來說是已知的。除其他以外，ErbB2蛋白對於乳
腺癌細胞是特異性的。因此，針對thereagainst的抗體是合適的草巴向 實體。
在優選實施方案中，可在此處描述的可用作貨物分子的顆粒內或 上包含靶向部分。由於此類顆粒的大小的原因，更大的靶向實體例如 抗體的使用優選與該實施方案相關。
在另一個優選實施方案中，將CPP即本發明的肽偶聯至分子內遮 蔽CPP從而阻止CPP充當CPP的部分。在CPP和遮蔽部分之間整合可 酶促切割的鍵。已針對綴合至CCPnonaarginine的螢光基團的靶向描 述了這樣的分子內遮蔽方法。通過相應於基質金屬蛋白酶2和9的切 割位點的肽連接體將nonaarginine CPP與六穀氨酸連接。此類蛋白酶 由腫瘤細胞以高濃度分泌。蛋白酶的分泌選擇性切割腫瘤細胞附近的 CPP-遮蔽物結構，從而使得CPP-貨物結構能夠被有效吸收入腫瘤細 胞。(T. Jiang等人，Proc. Natl. Acad. Sci， USA, 101， 17867-17872， 2004)。就此而言，本實施方案代表了用於腫瘤特異性靶向和/或遞送 的有效革G向或遞送方法。
可使用本領域內熟和的方法例如通過常規的混合、溶解、造粒、 錠劑製備(dragee-making)、研磨、乳化、包入膠嚢、封裝或冷凍幹 燥方法生產本發明的藥物組合物。
因此可以以常規的方式使用一種或更多種生理上可接受的載體 (包括賦形劑和輔助物)配製用於本發明的藥物組合物，所述載體有 助於將活性化合物加工入可作為藥物使用的製劑。適當的製劑取決於 選擇的給藥途徑。
對於注射，可將本發明的化合物配製在水溶液中，優選生理相容 性緩衝液例如Hanks' s溶液、林格液或生理鹽水緩衝液中。對於經粘 膜給藥，在製劑中使用適合於待穿透的屏障的穿透劑。此類穿透劑通 常在本領域內是已知的。
促進表皮的滲透的製劑在藥物學中是已知的，其可用於治療許多 皮膚病症，例如但不限於牛皮瓣和真菌感染。促進表皮和皮膚的下層 的滲透的製劑也是已知的，其可用於將本發明的組合物用於例如肌肉
或關節的下面。在一些優選治療實施方案中，可通過對覆蓋在受影響 的關節上的皮膚施用乳骨、軟骨或凝膠來施用包含本發明的組合物、 遞送用於減輕類風溼性關節炎或骨關節炎的化合物的製劑。
可使用口服和胃腸外給藥，其中使肽和/或複合物穩定至足以經 受消化道內的嚴厲的蛋白水解環境。如果是這樣的話，可通過將活性 化合物與本領域內熟知的藥學上可接受的栽體混合來容易地配製本發 明的組合物。此類載體使本發明的化合物能夠配製為由待治療的患者
口服吸收的片劑、丸劑、錠劑(dragee)、膠嚢劑、脂質、凝膠劑、 糖漿劑、懸浮液、混懸劑等。可使用固體賦形劑製備用於口服給藥的 藥物製劑，在加入合適的輔助物(如果想要的話)之後，任選地研磨 所得的混合物，然後加工顆粒的混合物，從而獲得錠劑核心。合適的 賦形劑特別地是充填劑例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖 維素製劑例如，玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、 西黃蓍膠(gum tragacanth)、曱基纖維素、羥丙基曱基纖維素、羧 甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果想要，可加入崩解劑， 例如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻酸鈉。
給錠劑核心提供合適的包衣。為了該目的，可使用可任選地包含 阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝膠、聚乙二醇和/ 或二氧化鈥、塗劑溶液(lacquer solution)和合適的有機溶劑或溶 劑混合物的濃糖溶液。可向片劑或錠劑包衣中加入染料或色素以鑑別 或表徵活性物質劑量的不同組合。
可口服使用的藥物組合物包括由明膠形成的推入配合 (push-fit )膠嚢以及由明膠和增塑劑例如甘油或山梨醇形成的軟的、 密閉的膠嚢。推入配合膠嚢可包含與充填劑例如乳糖、粘合劑例如澱 粉和/或潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂以及任選地穩定劑混合的活性 成份。在軟膠嚢中，可將活性化合物溶解或懸浮在合適的液體例如脂 肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可加入穩定劑。用於口服 給藥的所有製劑應當以適合該施用的劑量存在。
對於口腔含化給藥法，組合物可採取以常規方式配製的片劑或錠
劑形式。對於本發明的小肽和複合物，這可以證明是有用的。
對於通過吸入給藥，在使用合適的噴射劑例如二氯二氟甲烷、三 氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體的情況下，以
從壓力包裝(pressurized pack)或噴霧器提供的噴霧劑的形式常規 地遞送本發明的組合物。在加壓的氣溶劑的情況下，可通過提供閥門 以遞送已測量的量來確定劑量單位。可配製例如用於吸入器或吹入器 的明膠膠嚢或藥筒，使之包含化合物與合適的粉劑基質例如乳糖或澱 粉的粉劑混合物。
可配製用於通過注射例如通過單次快速靜脈注射或連續輸注進 行胃腸外給藥的本發明的組合物。以這種方式也可能靶向特定的器官、 組織、腫瘤位置、炎症位置等。可以以單位劑型例如以安瓿形式或以 多份劑量容器形式提供用於感染的、加入了防腐劑的製劑。組合物可 採取這樣的形式如油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳劑形式， 和可包含酉己方齊寸(formulatory agent),例:i口混懸劑、穩、定齊'J和/或 分散劑。
用於胃腸外給藥的藥物組合物包括以水溶性形式存在的組合物 的水溶液。此外，可將組合物的懸浮液配製為合適的油性注射懸浮液。 合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油例如芝麻油或人造脂肪酸酯例 如油酸乙酯或甘油三酯或脂質體。水性注射懸浮液可包含增加懸浮液 的粘性的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任意地，懸 浮液還可包含合適的穩定劑或增加組合物的穩定性的試劑，從而允許 製備高濃度溶液。
可選擇地，組合物的一種或更多種組分可以以粉劑形式存在，所 述粉劑可在使用前用合適的媒介物例如無菌無熱原水重構。
還可以以直腸組合物例如栓劑或保留灌腸劑例如包含常規的栓 劑基質(例如可可脂或其他甘油酯)的栓劑或灌腸劑的形式配製組合 物。
除了之前描述的製劑外，本發明的組合物還可配製為長效製劑。 可通過植入(例如皮下或肌內)或通過肌內注射施用此類長效製劑。
因此，例如，可用合適的聚合物或疏水材料(例如作為可接受的油中 的乳劑)配製組合物，將組合物配製為固體或半固體植入物(所述植 入物可以在體內自動降解)的部分或離子交換樹脂，或組合物的一種 或更多種組分可配製為略溶的衍生物，例如配製為略溶的鹽。
藥物組合物還可包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。此類載 體或賦形劑的實例包括但不限地碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、澱粉、纖 維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二醇。
適合用於本發明的藥物組合物包括其中以有效地荻得其想要的 目的的量包含活性組分的組合物。更特別地，治療有效量是指有效地 預防、減輕或改善病症的症狀或延長正被治療的受試者的存活時間的 化合物的量。
特別地在此處提供的詳細公開內容指導之下，治療有效量的確定 在本領域技術人員的能力之內。
對於用於本發明的方法的任何化合物，可從細胞培養測定初步估 計治療有效量或劑量。例如，可在動物模型中配製劑量以獲得循環濃 度範圍，所述範圍包括在細胞培養(在所述細胞培養中考慮了抑制劑
分子)中確定的ic5。。可將該信息用於更精確地確定人中的有用劑量。
可用標準的製藥方法在細胞培養物或實驗動物中確定本發明的
組合物的毒性和治療功效，例如，以用於確定LDs。(使50%的群體致死 的劑量)和EDs。(在50%的群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果的 劑量比是治療指數，其可表示為LDs。和EDs。之間的比率。展示高治療 指數的化合物是優選的。從這些細胞培養測定和動物研究中獲得的數 據可用於配製用於人中的劑量範圍。取決於使用的劑型和使用的給藥 途徑，劑量可在該範圍內變化。可由個別醫生通過考慮患者的狀況來 選擇確切的製劑、給藥途徑和劑量。(參見例如，Fingl，等人，1975， in
"The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1)。 施用的組合物的量當然取決於正被治療的受試者、受試者的體
重、痛苦的嚴重度、給藥方式和處方醫生的判斷。
可這樣提供包含本發明的組合物的肽的藥物組合物，以使肽和一
種或更多種貨物分子存在於相同的容器、溶液、懸浮液或粉劑形式中。 還可與一種或更多種貨物分子分開地提供本發明的肽，和可將所述肽
在施用之前與一種或更多種貨物分子混合。不同的包裝選擇是可能的 且對於本領域技術人員來說是已知的，除其他以外，取決於給藥途徑
和機制。例如，當與一種或更多種貨物分子分開地提供本發明的肽時， 如果想要，可在具有多個小室的包裝中提供組合物，其中可破裂、撕 裂或熔化屏障以使本發明的肽與貨物分子混合。可選擇地，可在單獨 的容器中混合兩個分開提供的組分，任選地加入一種或更多種其他載 體、溶液等。可在包裝中提供包含貨物分子的一種或更多種單位劑型。 包裝或分配裝置可附有施用說明書。還可製備在相容性藥物載體中配 制的包含本發明的化合物的組合物，將所述組合物置於合適的容器中， 加上標籤以用於治療指定的病症。標籤上指定的合適的病症包括可使 用本發明的組合物治療或預防或診斷的任何疾病。特別地，本發明理 想地適合於基因療法。
在其他方面，本發明涉及用於治療或預防患者的方法，其包括施 用本發明的組合物。
在其他方面，本發明涉及用於診斷患者的方法，其包括施用或使 用本發明的組合物。
在本發明的範圍內的是編碼本發明的肽的此類核酸可用作疫苗 或疫苗的部分。優選地，疫苗包含編碼適合在宿主生物中引起免疫反 應的抗原的核酸，更優選RNA，其中對所述宿主生物施用編碼本發明 的肽的核酸和編碼此類抗原的核酸。可分開地或以混合的方式進行該 施用。在其他實施方案中，可在栽體，更優選使核酸能夠在所述宿主 生物中表達的表達載體中包含或含有各核酸。此類載體，特別是此類 表達載體的其他元件對於本領域技術人員來說是已知的，除其他以外， 其包含一個或幾個下列元件啟動子、增強子和終止子。抗原優選是
與用本發明的疫苗治療或預防的疾病有關的抗原。此外，疫苗還可包 含產生所謂的佐劑效應的組分和用作T輔助細胞反應的抑制劑的組
在其他實施方案中，本發明涉及用於轉染、用於治療和/或預防 疾病的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的組合物，和任選地一種或幾 種的元件。
現在參考下列附圖和實施例來進一 步舉例說明本發明，根據所述 附圖和實施例可獲得其他特徵、實施方案和有利方面。特別地，


圖1顯示用羧基螢光素在其N末端標記的不同CPP的濃度依賴性 吸收的圖表，所述濃度依賴性吸收表示為細胞相關螢光 (cell-associated fluorescence )的程度；hLF肽是指由SEQ. ID. No. 1所示的胺基酸38至59組成的肽，bLF肽是指由SEQ. ID. No. 2的氨 基酸33至50組成的肽；通過流式細胞術確定細胞相關螢光；
圖2顯示使用共聚焦雷射掃描顯微鏡獲得的系列顯微照片，其顯 示在不同濃度上人乳鐵蛋白來源的肽和牛乳鐵蛋白來源的肽(參見圖 1)的細胞內分布的濃度依賴性；
圖3 A是顯示不同內吞作用抑制劑對螢光素標記的hLF肽(圖1 的肽序列)的吸收的影響的圖表，螢光素-hLF的濃度為5 jiM (EIPA, 5-(N-乙基-N-異丙基)阿米洛利；MPCD，甲基-p-環糊精；CPZ,氯 丙溱)；使用流式細胞術確定吸收。誤差條塊(Error bar)代表一式 三份重複的平均偏差；
圖3B是顯示不同內吞作用抑制劑對螢光素標記的hLF-肽(圖1 的肽序列)的吸收的影響的圖表，hLF的濃度為20 pM;
圖4顯示通過共聚焦雷射掃描顯微鏡獲得的圖像，其顯示在2或 20/j M的肽濃度下，內吞作用抑制劑對螢光素標記的hLF-肽吸收入 HeLa細力包的影響；
圖5是顯示相應於SEQ. ID. No. 1的胺基酸38至59的螢光素標 記的hLF肽與其截斷形式相比被吸收的程度的圖表，該圖表顯示相應 於SEQ. ID. No. l的胺基酸40至55 (LFl-肽)與相應於SEQ. ID. No. 1 的胺基酸40至50 (LF2-肽)的結構-活性關係；和
圖6描述了對於溫育不同溫育時間的HeLa細胞，在不同的螢光 素標記的hLF肽的濃度下，表示為以百分數表示的細胞成活力的hLF
肽的細胞毒性；對於每一對柱子，第一柱子是指與肽一起溫育6小時 的細胞，第二柱子是指與肽一起溫育0.5小時的細胞。
實施例1:實驗方法
細胞和試劑。從美國典型培養物保藏中心(Manassas, VA)獲得人 宮頸癌細胞系HeLa。將HeLa細胞保持在具有穩定的穀氨醯胺和2.0 g/L NaHC03 (PAN Biotech, Aidenbach， Germany)、補充以10%胎牛 血清(PAN Biotech)的RPMI 1640培養基中。氯丙溱購自Calbiochem (Bad Soden， Germany), 5-(N-乙基-N-異丙基)阿米洛利(EIPA)、甲 基-P -環糊精(M P CD)和MTT [3- (4， 5-二甲基噻唑-2-基)-2， 5-溴化二 苯基四哇 (diphenyl tetrazol ium bromide )〗 獲自 Sigma (Deisenhofen， Germany)。
肽的合成。肽購自EMC microcol lect ions (Tiibingen， Germany)。 通過分析HPLC確定所有肽的純度。通過MALDI-TOF質鐠測定法確認肽 的本體。通過製備型HPLC純化純度低於85%的肽。所有使用的肽的純 度高於(214 nm HPLC)。用所述的羧基螢光素(Fischer等人， Bioconjugate Chem. 14, 653-660， 2003)在N末端標記肽。
肽貯存液。將肽溶解在DMS0中至10 mM的濃度。在PBS或培養 基中進一步稀釋這些貯存液。基於在0. 1 M Tris/HCl緩沖液(pH 8. 8) 中以1 : 100稀釋的羧基螢光素通過UV/VIS-光語法產生的吸收(在 492 nm測量的吸收和假定摩爾消光係數為75, 000 L/(mol . cm))確定 DMSO貯存液的肽濃度。
流式細胞術。為確定肽裝載的功效，在24孔板(Sarstedt， N ii mbrecht， Germany)中以每孔50， 000個細胞的密度將HeLa細胞接種 在包含血清的RPMI lMO中。 一天後，用培養基洗滌細胞，然後在300 jliL以適當的濃度包含肽的RPMI 1640中溫育，進行30分鐘。以一式 三份重複檢測各條件。在溫育後，用培養基洗滌細胞，通過胰蛋白酶 消化進行分離，進行5分鐘，然後懸浮於包含0. 1% (w/v) BSA的冰冷 PBS中，然後立即通過流式細胞術(BD FACS Calibur System, Becton
Dickinson, Heidelberg, Germany)進行測量。在各情況下，獲得7, 000 個活細胞的螢光。基於邊向散射(sideward scatter)和前向散射門 控活細胞。
實施例2:來源於人和牛乳鐵蛋白的肽的吸收功效
通過固相肽合成法來合成人和牛乳鐵蛋白來源的肽。為檢測活細 胞中的吸收和亞細胞分布，用羧基螢光素在N末端上標記兩種肽。為 確定乳鐵蛋白來源的肽是否具有作為細胞穿膜肽的活性，通過流式細 胞術確定與bLF肽或hLF肽一起溫育的HeLa細胞中的細胞相關焚光。 選擇Antp和Tat肽作為已為大家所接受的CPP以進行比較。
對於所有4種肽，如圖1中所描述的，通過流式細胞術測量的細 胞螢光隨肽濃度的增加而增加。
實施例3:結構-活性關係
至於22個胺基酸，hLF肽是中等長度的CPP。九精氨酸 (No廳rginine )只具有9個胺基酸的，廣泛使用的CPP transportan 27。 7個陽離子胺基酸中的4個和芳香族胺基酸位於嵌套在半胱氨酸 殘基內的序列中。在全長蛋白質中，這些半胱氨酸殘基形成了使結構 域限制在環形構象內的二疏橋。此外，檢測缺少末端半胱氨酸殘基的 截斷的肽(LF1和LF2，表l)的細胞吸收，然後將其與包含半胱氨酸殘 基的肽進行比較。
表1.用於本研究的肽的一級結構。將所有肽合成為肽醯胺。Fluo 代表5(6)-羧基螢光素，C0冊2代表肽的醯胺化C末端。
條目(Entry) 肽 序列
1 Tat肽 Fluo-YGRKKRR,R-C0NH2
2 Antp肽 Fluo-即KIWFQNR薩WKl-C0NH2
formula see original document page 33hLF肽 bLF肽 LF1肽 LF2肽
Fluo-KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR-C0NH2 Fluo-PEWFKCRRWQWRMKKLGA-CONH2 Fluo-FQWQRNMRKVRGPPVS-CONH2 Fluo-FQWQRNMRKVR-CONH2
結果示於圖5。
兩種缺乏半胱氨酸的肽的吸收只有包含2個半胱氨酸殘基的hLF 肽的吸收的大約十分之一。
實施例4: hLF肽的細胞毒性
在上述實驗中，使用達到40 juM的hLF肽的濃度範圍，未能觀 察到細胞毒性效應。然而，對於肽吸收的活細胞顯微鏡檢查法，大多 使用少於1個小時的相當短的溫育時間。因此也檢測對於更長的溫育 時間和更高的濃度，肽是否影響細胞的成活力。以1.25 jiM至高至 160 uM的範圍內的濃度將HeLa細胞與hLF肽一起溫育，進行6或0. 5 小時。然後，使用MTT試驗確定細胞成活力。其結果描述於圖6中。
當將細胞與肽一起溫育只進行30分鐘時，對於達到40 yM的濃 度沒有觀察到細胞毒性。在6小時後，對於高於5 uM的肽濃度，細 胞的成活力稍微減少。在高於40 yM的濃度上，所有細胞被殺死。
本說明書中公開的本發明的特徵、所列序列、權利要求和/或附圖 可以，分開地或以其任何組合，是用於以其各種形式實現本發明的材 料。
權利要求
1. 具有包含人乳鐵蛋白或牛乳鐵蛋白的至少8個連續胺基酸的胺基酸序列的肽，其中肽適合用作細胞穿膜肽。
2. 權利要求l的肽，其中肽包含至少4個陽離子胺基酸。
3. 權利要求1或2的肽，其中人乳鐵蛋白具有SEQ. ID. No. 1所 示的胺基酸序列，牛乳鐵蛋白具有SEQ. ID. No. 2所示的胺基酸序列。
4. 權利要求1至3任一項的肽，其中肽包含至少2個Cys殘基或 其類似物。
5. 權利要求4的肽，其中肽包含由2個Cys殘基產生的二硫鍵或 由半胱氨酸類似物形成的類似的鍵。
6. 權利要求1至5任一項的肽，其中肽包含具有長度為大約12 至20個胺基酸的oc螺旋構象的部分和具有長度為大約8至12個胺基酸 的P摺疊構象的部分。
7. 權利要求1至6任一項的肽，其中肽包含大約8至大約60個 胺基酸殘基。
8. 權利要求7的肽，其中肽包含大約20至大約45個胺基酸殘基。
9. 權利要求1至8任一項的肽，其中肽具有相應於SEQ. ID. No. 1 所示的胺基酸序列的胺基酸位置20至64的胺基酸序列。
10. 權利要求1至9任一項的肽，其中肽具有胺基酸序列，其中肽 的N末端是相應於SEQ. ID. No. 1或SEQ. ID. No. 2所示的胺基酸序列的氨 基酸位置20至64的胺基酸。
11. 權利要求1至IO任一項的肽，其中肽選自 具有胺基酸序列KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (SEQ. ID. No. 3)的肽， 具有胺基酸序列CFQWQRNMRKVRGPPVSC (SEQ. ID. No. 4)的肽， 具有胺基酸序列FQWQR麗RKVRGPPVS (SEQ, ID. No. 5)的肽， 具有胺基酸序列FQWQRNMRKVR (SEQ. ID. No. 6)的肽， 具有胺基酸序列KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR(SEQ ID No. 29),和 具有胺基酸序列CRRWQWRMKKLGAPSITC(SEQ ID No. 30)的肽， 和其衍生物。
12. 權利要求ll的肽，其中肽包含SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 29、 SEQ ID No. 30所示的序列或具有至少40°/。的序列同 一性的所述序列的衍生物。
13. 權利要求11或12的肽，其中肽是SEQ. ID. No. 2至5中的 任一序列的肽的衍生物，其中甲硫氨酸殘基由選自纈氨酸、異亮氨酸、 正纈氨酸、亮氨酸和正亮氨酸的胺基酸置換。
14. 權利要求13的肽，其中肽是具有選自下列序列的胺基酸序列的肽KCFQWQRNVRKVRGPPVSCIKR (SEQ. ID. No. 7) KCFQWQRNIRKVRGPPVSCIKR (SEQ. ID. No. 8) KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR(SEQ. ID.NO. 9)，其中X是正纈氨酸， KCFQWQRNLRKVRGPPVSCnIKR (SEQ. ID. No. 10)， KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR(SEQ. ID. No. 28),其中X是正亮氨酸 CFQWQRNVRKVRGPPVSC (SEQ.ID.NO. 11)， CFQWQRNIRKVRGPPVSC (SEQ.ID.NO. 12)， CFQWQRNXRKVRGPPVSC(SEQ. ID. NO. 13)，其中X是正纈氨酸， CFQWQNVRRKVRGPPVSC (SEQ. ID. NO. 14)， CFQWQR證KVRGPPVSC(SEQ. ID.No. 15)，其中X是正亮氨酸， FQWQRNVRKVRGPPVS (SEQ. ID. NO. 16)， FQWQRNIRKVRGPPVS (SEQ.ID.No.17)，FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ. ID. No. 18)，其中X是正纈氨酸，FQWQRNLRKVRGPPVS (SEQ. ID. No. 19)，FQWQRNVRKVRGPPVS (SEQ. ID. No. 20)，其中X是正亮氨酸，FQWQRNVRKVR (SEQ. ID. NO. 21)，FQWQRKVR (SEQ. ID. NO. 22),FQWQRNIRXRKVR(SEQ. ID. NO. 23)，其中X是正纈氨酸，FQWQRNLRKVR (SEQ.ID.NO.24)，和FQWQRNXRKVR (SEQ. ID. No. 25)，其中X是正亮氨酸。
15. 權利要求11至14任一項的肽，其中衍生物具有優選選自硫 醚的連接基團，其中連接基團取代由這些Cys殘基形成的二硫鍵。
16. 權利要求1至15任一項的肽，其中優選通過整合放射性標記 的胺基酸來對肽進行放射性標記，其中更優選放射性標記的胺基酸是氚 標記的胺基酸。
17. 權利要求1至16任一項的肽，其中肽還包含適合使用用於檢 測的方法進行檢測的部分，其中該部分優選選自螢光基團、放射性示蹤 劑和半抗原，其中優選半抗原是生物素。
18. —種複合物，所述複合物包含選自權利要求1至17任一項的 肽的肽、人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白以及貨物分子。
19. 權利要求18的複合物，其中貨物分子與肽共價或非共價結合。
20. 權利要求18或19的複合物，其中貨物分子選自核酸、氨基 酸、肽、蛋白質、糖類、脂質和小分子以及其任意的混合物。
21. 權利要求18至20任一項的複合物，其中貨物分子以結構或 結構的部分的形式存在，其中結構選自納米顆粒、微粒、脂質體和微團。
22. 權利要求20的複合物，其中核酸是選自DM分子、RNA分子、 PM分子、siRNA分子、反義分子、核酶、適體、spiegelmer和資斜 分子的核酸。
23. 權利要求20的複合物，其中肽選自用於接種的肽。
24. 權利要求20的複合物，其中核酸是基於核酸的疫苗。
25. 權利要求20的複合物，其中納米顆粒和/或微粒包含具有藥物 活性的化合物或由具有藥物活性的化合物組成。
26. —種組合物，所述組合物包含至少一個選自權利要求1至17 任一項的肽的肽、人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白以及貨物分子。
27. 包含權利要求18至25任一項的複合物的組合物。
28. 編碼權利要求1至17任一項的肽的核酸，其優選具有 SEQ. ID. No. 26或SEQ. ID, No. 27所示的核酸序列。
29. 包含權利要求28的核酸和貨物分子的組合物。
30. 權利要求29的組合物，其中貨物分子是核酸和更特別地是適合用於接種的RNA。
31. 權利要求29的組合物，其中貨物分子是編碼肽的核酸。
32. 權利要求31的組合物，其中權利要求28的核酸可操作地連 接至編碼肽的核酸。
33. 權利要求31的組合物，其中權利要求28的核酸與編碼肽的 核酸符合讀框化連接。
34. 編碼權利要求31至33任一項的組合物，其中肽是藥物活性劑。
35. 權利要求1至17任一項的肽用作細胞穿膜肽的用途。
36. 人乳鐵蛋白或其功能性衍生物或牛乳鐵蛋白或其功能性衍生 物用作細胞穿膜肽的用途。
37. 權利要求36的用途，其中人乳鐵蛋白具有包含SEQ. ID. No. 1所示的胺基酸序列的胺基酸位置2 0至711的胺基酸序列或其功能衍生 物和/或牛乳鐵蛋白具有包含SEQ. ID.No. 2所示的胺基酸序列的氨基 酸位置20至708的胺基酸序列或其功能性衍生物。
38. 權利要求1至17任一項的肽作為轉染劑的用途。
39. 人乳鐵蛋白或其功能性衍生物或牛乳鐵蛋白或其功能性衍生 物用作轉染劑的用途。
40. 權利要求39的用途，其中人乳鐵蛋白具有包含SEQ. ID. No. 1所示的胺基酸序列的胺基酸位置20至711的胺基酸序列和/或牛乳鐵 蛋白具有包含SEQ. ID. No. 2所示的胺基酸序列的胺基酸位置20至708的胺基酸序列或其功能性衍生物。
41. 權利要求26至34任一項的組合物用於生產藥物的用途。
42. 權利要求41的用途，其中貨物分子是藥物活性劑。
43. 權利要求26至34任一項的組合物用於生產診斷劑的用途。
44. 權利要求43的用途，其中貨物分子是診斷標記。
全文摘要
本發明涉及具有包含人乳鐵蛋白或牛乳鐵蛋白的至少8個連續胺基酸的胺基酸序列的肽，其中所述肽適合用作細胞穿膜肽。
文檔編號C07K14/47GK101395180SQ200680049953
公開日2009年3月25日 申請日期2006年10月25日 優先權日2005年12月30日
發明者H·胡夫納格爾, M·富廷-米萊切克, N·溫德哈伯, R·布羅克, R·菲舍爾 申請人:贏創羅姆有限責任公司