使用icos基cars增強抗腫瘤活性和car持久性的製作方法
2023-12-09 04:49:21
使用icos基cars增強抗腫瘤活性和car持久性的製作方法
【專利摘要】本發明提供用於治療人中癌症的組合物和方法。本發明包括施用基因修飾的Th17細胞以表達CAR，其具有抗原結合結構域、跨膜結構域和ICOS細胞內信號傳導結構域。
【專利說明】使用I COS基CARS增強抗腫瘤活性和CAR持久性
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年2月22日提交的美國臨時申請系列號61/601，910的優先權， 其內容通過引用以它們的整體併入本文。
[0003] 發明背景
[0004] 基因修飾的表達嵌合抗原受體（CAR)的T細胞的開發已經為許多新的用於癌症和 其他病症的潛在的療法找到了出路。一般而言，CARs包括細胞外抗原識別結構域和細胞內 結構域。細胞內結構域精確的組成可為CAR和表達CAR的細胞群體提供獨特的特徵。
[0005] ⑶278或可誘導的-T-細胞共刺激分子（IC0S)是一般在活化的T細胞上表達的共 刺激分子。已經顯示，除了⑶28,經可誘導的共刺激分子（IC0S，也稱為⑶278)的信號傳導 對於最佳的細胞因子分泌是必要的，因為兩種分子對於通過鼠 Thl7細胞的最佳的IL-17A 分泌是必須的（Park等，2005Nat. Immunol. 6:1133 - 1141)。最近鼠模型中的發現已經揭示 IC0S通過誘導轉錄因子c-MAF表達和所以反式激活IL-21產生而放大Thl7反應（Bauquet 等，2009Nat. Immunol. 10:167 - 175)。儘管已經產生了包括IC0S的嵌合受體（美國專利出 版US2006/0247191)，但是不知道IC0S結構域在影響CAR介導的抗腫瘤活性，CAR介導的 Treg增殖，或T細胞持久性中起什麼作用。
[0006] 取決於存在的微環境線索，天然CD4+T細胞可分化成數種T輔助（TH)細胞系，包括 THl、TH2、Thl7、TH22 之一和調節 T (Treg)細胞（O' Shea 等，2010Science327:1098 - 1102; Murphy等，2010Nat. Immunol. 11:674 - 680)。加強宿主防禦的Thl7細胞在黏膜免疫性中 起主要作用，增強許多自身免疫病，並且釋放細胞因子，包括IL-17A和IL-17F(Korn等， 2009Annu. Rev. Immunol. 27:485 - 517)。Thl7細胞對腫瘤免疫性的貢獻不同，顯示對抗腫 瘤發生和原致癌性活性二者的潛能（Zou等，2010Nat. Rev. Immunol. 10:248 - 256)。所以， 識別控制Thl7應答的機制對於理解腫瘤免疫性是至關重要的。儘管最近在用於治療癌症 的CAR基療法中取得了進展，但是現在已經有了任何已知的使用遺傳改變的Thl7細胞的療 法。
[0007] 因此，本領域非常需要使用增加遺傳改變的Thl7細胞抗腫瘤活性和持久性的CAR 治療癌症的組合物和方法。本發明解決了該需求。
【發明內容】
[0008] 本發明提供編碼嵌合抗原受體（CAR)的分離的核酸序列，其中CAR包括抗原結合 結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域。
[0009] 在一個實施方式中，CAR的核酸序列進一步包括⑶3 ζ信號傳導結構域。
[0010] 在一個實施方式中，分離的CAR的核酸序列包括SEQ ID Ν0:8的核酸序列。
[0011] 在一個實施方式中，抗原結合結構域是抗體或其抗原結合片段。
[0012] 在一個實施方式中，抗原結合片段是Fab或scFv。
[0013] 在一個實施方式中，抗原結合結構域結合腫瘤抗原。在一個實施方式中，腫瘤抗原 與血液惡性腫瘤相關。在一個實施方式中，腫瘤抗原與實體瘤相關。
[0014] 在一個實施方式中，腫瘤抗原選自⑶19、⑶20、⑶22、R0R1、間皮蛋白、⑶33/IL3Ra、 c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvIII、⑶-2、NY-ES0-1TCR、MAGE A3TCR，和其任意組合。
[0015] 在一個實施方式中，CAR的核酸序列進一步包括包含共刺激分子的細胞內結構域 的共刺激信號傳導區，所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、淋 巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合⑶83的配體， 和其任意組合。
[0016] 在一個實施方式中，IC0S細胞內信號傳導結構域由SEQ ID N0:6的核酸序列編碼。
[0017] 在一個實施方式中，⑶3 ζ信號傳導結構域由SEQ ID N0:7的核酸序列編碼。
[0018] 本發明也提供載體，其包括編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中CAR包括抗 原結合結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域。
[0019] 本發明也提供細胞，其包括編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中CAR包括抗 原結合結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域。
[0020] 本發明也提供用於哺乳動物中刺激T細胞介導的對靶細胞群體或組織的免疫應 答的方法，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中CAR包 括抗原結合結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域。
[0021] 本發明也提供哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性的方法，所述方法包括向哺乳動物施 用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域和IC0S 細胞內信號傳導結構域，從而在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性。
[0022] 本發明也提供治療具有與升高的腫瘤抗原表達相關的疾病、病症或狀況的哺乳動 物的方法，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中CAR包 括抗原結合結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域，從而治療哺乳動物。
[0023] 在一個實施方式中，細胞選自自體Thl7細胞和自體Tcl7細胞。
[0024] 本發明也提供治療具有癌症的人的方法，所述方法包括向人施用基因改造的表達 CAR的細胞，其中CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域，其 中細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
[0025] 在一個實施方式中，人抵抗至少一種化療劑。
[0026] 本發明也提供在診斷有癌症的人中產生基因改造的T細胞的持續性群體的方法， 所述方法包括向人施用基因改造的表達CAR的細胞，其中CAR包括抗原結合結構域、跨膜結 構域和IC0S細胞內信號傳導結構域，其中基因改造的細胞的持續性群體在施用之後在人 中持續至少一個月，和其中細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
[0027] 在一個實施方式中，基因改造的T細胞的持續性群體包括選自下述的至少一種細 胞：施用至人的細胞、施用至人的細胞的子代，和其組合。
[0028] 在一個實施方式中，基因改造的T細胞的持續性群體包括記憶T細胞。
[0029] 在一個實施方式中，基因改造的T細胞的持續性群體在施用之後在人中持續至少 三個月。
[0030] 在一個實施方式中，基因改造的T細胞的持續性群體在施用之後在人中持續至少 四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、i^一個月、十二個月、兩年或三 年。
[0031] 本發明也提供在診斷有癌症的人中擴張基因改造的T細胞群體的方法，所述方法 包括向人施用基因改造的表達CAR的細胞，其中CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域和 ICOS細胞內信號傳導結構域，其中施用的基因改造的細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞，進一 步其中施用的基因改造的細胞在人中產生子代T細胞的群體。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032] 當與附圖結合閱讀時，將更好地理解本發明的優選實施方式的以下詳細描述。為 了說明本發明的目的，在附圖中顯示了目前優選的實施方式。然而，應當理解本發明不限於 附圖顯示的實施方式的精確布置和手段。
[0033] 圖1描繪SSl-ICOS-z的核苷酸序列。含有SSl-ICOS-z CAR的cDNA序列克隆進 入第三代慢病毒載體並且在EF-1啟動子（SEQ ID N0:16)的控制下表達。SSl-ICOS-z含有 CD8前導序列、識別人間皮蛋白的SS1單鏈片段、CD8 α鏈的鉸鏈區、IC0S跨膜和細胞內結 構域和TCR-z信號轉導結構域。
[0034] 圖2,包括圖2Α和圖2Β，描繪改變的Thl7細胞的產生。圖2Α描繪含有SS1單鏈 片段和不同細胞內結構域的一組嵌合受體的示意性表示。新穎性IC0S基CAR含有與IC0S 細胞內結構域串聯的TCR-ζ信號轉導結構域。圖2B描繪評估SSlscFv融合蛋白在人初 級CD4+T細胞上表達的流式細胞術試驗的結果，歸一化為針對所有受體的60%嵌合受體表 達。
[0035] 圖3描繪實施例實驗的結果，表明IC0S基CAR改變的Thl7細胞釋放大量的 IL17-A、IL-17F和CCL20但是少量的IL-2。Thl7細胞（4X 105,60 %嵌合受體陽性）與 2 X 105K562meso細胞在沒有Thl7極化細胞因子或IL-2的培養基中共培養。共培養24h之 後獲得上清液，並且通過ELISA分析細胞因子產生。誤差棒指示三重樣品的標準偏差（SD)。 三個實驗的代表。
[0036] 圖4描繪實施例實驗的結果，表明IC0S通過人Thl7細胞加強IL-17A產生。來自 5個不同正常供體的T H17細胞（4X 105,60%嵌合受體陽性）與2X105K562meso細胞在沒 有Thl7極化細胞因子或IL-2的培養基上共培養。共培養24h之後獲得上清液，並且通過 ELISA分析IL-17A產生。
[0037] 圖5,包括圖5A至圖5C，描繪實施例實驗的結果，表明IC0S基CAR改變的Thl7細 胞在腫瘤細胞中抗原識別之後釋放大量的IL17-A和IFNY但是少量的IL-2。Thl7細胞 (4\ 105,60%嵌合受體陽性）與2父1051(562、1(56211168〇或指示的腫瘤細胞在沒有11117極 化細胞因子或IL-2的培養基中共培養。共培養24h之後獲得上清液，並且通過ELISA分析 (A) IL-17A、⑶IL-2和（C) IFN γ。誤差棒指示兩個樣品的標準偏差（SD)。
[0038] 圖6,包括圖6A和圖6B，描繪實施例實驗的結果，其評估嵌合受體改變的Thl7/ Tcl7細胞的溶細胞活性。Tcl7和Thl7細胞的混合物（以4:1的比）與用CFSE染色的L55 靶細胞以指示的效應子-靶（E:T)比例共培養4h。圖6A圖解特異性細胞溶解，如使用流式 細胞術基試驗確定。圖6B描繪ED50,如對於每個組使用四參數邏輯回歸模型確定。四個實 驗的代表。
[0039] 圖7,包括圖7A和圖7B，描繪實施例實驗的結果，表明用IC0S基CAR改變的Thl7/ Tcl7細胞根除大的預先建立的腫瘤並且顯示增強的體內持久性。在NSG小鼠的腰窩中建立 人初級M108腫瘤。8周之後，當腫瘤達到體積為500mm 3時，小鼠用在61和67天的2個瘤 內注射10X 106個Thl7/Tcl7細胞（80% /60%嵌合受體-陽性）或PBS治療。圖7A描繪 平均腫瘤體積（+/-SEM)，所有組n = 9。在通過心臟內穿刺T細胞注入之後51天獲得來自 用改變的Thl7/Tcl7細胞瘤內注射治療的負載M108的NSG小鼠的外周血。圖7B圖解通過 FACS Trucount試驗存在的人⑶4+和⑶8+T細胞的定量。結果表達為每μ L外周血的平均 絕對Τ-細胞計數+/-SD (所有組η = 9)。
[0040] 圖8,包括圖8Α至8D，表明用ICOSz改變的ΤΗ17細胞顯示增加 CD161的表達。改 變的ΤΗ17細胞與照射的表達間皮蛋白的APC共培養。圖8Α和8Β描繪通過流式細胞術在 指示的時間點分析通過CAR+CD4+T細胞應答間皮蛋白特異性刺激的CD161表達。圖8C描繪 在第8天在數個不同的正常供體（η = 9)中表達⑶161的CAR+⑶4+Τ細胞的百分數被繪製。 圖8D描繪在第8天CAR+和CAR-細胞中的⑶161表達。誤差棒表示SEM(5個不同的正常 供體）。
[0041] 圖9,包括圖9A和圖9B，描繪使用包括其他共刺激結構域組合的CAR的實施 例實驗的結果。圖9A描繪IC0S基CAR，其含有TCR-ζ信號轉導結構域，以及IC0S和 CD137(4-1BB)共刺激結構域三者。圖9B描繪下述圖，其圖解併入CD137信號傳導結構域 以及IC0S不改變用僅僅含有IC0S共刺激結構域的CAR改變的Thl7細胞的細胞因子曲 線。11117細胞（4\ 105,60%嵌合受體陽性）與2\ 1051(562、1(56211168〇或指示的腫瘤細胞在 沒有外源性細胞因子的情況下共培養。共培養24h之後獲得上清液，並且通過ELISA分析 IL-17A、IL-2和IFNY。誤差棒指示兩個樣品中的標準偏差（SD)。
[0042] 圖10,包括圖10A至10C，是一系列圖像，表明ICOSz改變的TH17細胞顯示增加的 TH17相關的基因表達。改變的TH17細胞用源自固定的酵母的重組體間皮蛋白刺激。基因 表達水平在刺激之前第0天並且抗原識別後4h、8h、24h和96h測定。圖10A描繪選擇的差 別表達的基因的歸一化的Log2表達（FC>2, FDR〈0. 05)。誤差棒表示SEM(3個不同的正常 供體）。圖10B描繪T輔助籤名基因在4h相對於Oh的表達的log2倍變化的熱圖。圖3C 描繪精巧通路富集的熱圖（IPA，p〈0.01)。
【具體實施方式】
[0043] 本發明涉及組合物和方法用於治療癌症，包括但不限於血液學惡性腫瘤和實體 瘤。本發明涉及轉導表達嵌合抗原受體（CAR)的Thl7細胞的過繼細胞轉移的策略。CAR是 結合基於抗體的針對期望的抗原（例如，腫瘤抗原）的特異性與T細胞受體-激活細胞內 結構域以產生展示特異性抗腫瘤細胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0044] 本發明一般涉及基因修飾以表達期望的CAR的T細胞的使用。表達CAR的T細胞 本文稱為CAR T細胞或CAR修飾的T細胞。優選地，細胞可被基因修飾以在其表面上表達 抗體結合結構域，賦予不依賴MHC的新型抗原特異性。在一些情況下，T細胞被基因修飾以 表達CAR，其將特異性抗體的抗原識別結構域與CD3- ζ鏈或Fc γ RI蛋白質的細胞內結構域 結合為單個嵌合蛋白。
[0045] 在一個實施方式中，本發明的CAR包括具有抗原識別結構域的細胞外結構域、跨 膜結構域和細胞質結構域。在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結構域之一相關聯的 跨膜結構域。在另一實施方式中，跨膜結構域可被選擇或通過胺基酸取代修飾，以避免此類 結構域與相同的或不同的表面膜蛋白質的跨膜結構域的結合以使得與受體複合物的其他 成員的相互作用最小化。在一些實施方式中，細胞外結構域也包括鉸鏈結構域。優選地，鉸 鏈結構域包括⑶8 α鉸鏈結構域。
[0046] 就細胞質結構域而言，本發明的CAR可設計為本身包括IC0S信號傳導結構域或與 用於本發明的CAR背景的任何其他期望的細胞質結構域（一個或多個）結合。在一個實施 方式中，CAR的細胞質結構域可設計為進一步包括⑶3- ζ、4-1ΒΒ和/或⑶28的信號傳導 結構域。例如，CAR的細胞質結構域可包括但不限於IC0S、⑶3- ζ、4-1ΒΒ和⑶28信號傳導 組件和其組合。因此，本發明提供CAR T細胞和它們用於過繼性療法的方法。
[0047] 在一個實施方式中，本發明的CAR T細胞可通過將包括期望的CAR的慢病毒載體 引入細胞產生，所述CAR是例如包括抗間皮蛋白、⑶8 α鉸鏈、IC0S跨膜結構域和人IC0S和 CD3(信號傳導結構域的CAR。在一個實施方式中，本發明的CAR Τ細胞能夠在體內複製產 生可導致持續的腫瘤控制的長期持久性。
[0048] 在另一實施方式中，本發明的CAR T細胞可通過將編碼期望的CAR的RNA轉染進 入細胞產生，所述CAR是例如包括抗間皮蛋白、⑶8 α鉸鏈、IC0S跨膜結構域和人IC0S和 CD3 4信號傳導結構域的CAR。在一個實施方式中，CAR在基因修飾的CAR Τ細胞中瞬時表 達。
[0049] 在一個實施方式中，本發明涉及施用基因修飾的表達CAR的T細胞用於使用淋巴 細胞注入治療具有癌症或處在具有癌症風險的患者。優選地，自體淋巴細胞注入用於治療。 自體PBMCs收集自需要治療的患者並且使用本文所述的和本領域已知的方法將T細胞活化 和擴張並且然後注入回到患者。
[0050] 在一個實施方式中，本發明涉及基因修飾的表達CAR的Thl7細胞用於治療具有癌 症的患者。本發明基於發現IC0S信號傳導結構域包括在CAR的細胞質結構域中增加 Thl7 持久性，增加 IL-17產生，增加 Thl7細胞的抗腫瘤活性，並且減少IL-2產生。在一個實施 方式中，減少表達含有CAR的IC0S的Thl7細胞產生的IL-2減少免疫抑制Treg細胞的增 殖。
[0051] 在仍另一實施方式中，本發明一般涉及治療處在發展癌症風險的患者。本發明也 包括治療惡性腫瘤或自身免疫病，其中化療和/或免疫療法在患者中導致顯著的患者的免 疫抑制，從而增加患者發展癌症的風險。
[0052] 本發明包括使用表達抗間皮蛋白CAR，包括⑶3- ζ和IC0S共刺激結構域的Thl7 細胞（也稱為表達CAR的Thl7細胞）。在一個實施方式中，本發明表達CAR的Thl7細胞可 經歷強勁的體內擴張並且可建立抗原特異性記憶細胞，其以高水平在血液和骨髓中持續延 長的時間量。在一些情況下，注入患者的本發明表達CAR的Thl7細胞可消除具有某種形式 癌症的患者體內的癌細胞。但是，本發明不限於表達CAR的Thl7細胞。而是，本發明包括 與一個或多個細胞內結構域融合的任何抗原結合結構域，所述細胞內結構域選自IC0S信 號傳導結構域、CD137(4-1BB)信號傳導結構域、CD28信號傳導結構域、CD3(信號結構域， 和其任意組合。
[0053] 定義
[0054] 除非另有定義，本文使用的所有的技術和科學術語具有與本發明涉及領域的技術 人員通常理解的相同的含義。儘管可在測試本發明的實踐中使用類似於或等於本文描述的 那些的任何方法和物質，但優選的材料和方法在本文中進行描述。在描述和要求保護本發 明中，將使用以下術語。
[0055] 也應理解本文使用的術語僅是為了描述【具體實施方式】的目的，並不意欲是限制性 的。
[0056] 本文使用冠詞"一個（a) "和"一個（an) "，指的是該冠詞語法對象的一個或多於一 個（即，指的是至少一個）。以例子說明，"一個元件"表示一個元件或多於一個的元件。
[0057] 如本文使用的"大約"，當指的是可測量的值諸如量、時間期間等時，表示包括從給 定值± 20 %或± 10 %的變化，更優選± 5 %，甚至更優選± 1 %，和還要更優選± 0. 1 %的變 化，只要這種變化適於實施公開的方法。
[0058] "活化"，如本文所用的，指的是已經被充分刺激以誘導可檢測的細胞增殖的T細胞 的狀態。活化也可與誘導的細胞因子產生和可檢測的效應子功能相關。術語"活化的T細 胞"等指的是經歷細胞分裂的T細胞。
[0059] 術語"抗體"，如本文所用的，指的是與抗原特異性結合的免疫球蛋白分子。抗 體可為源於自然源或源於重組源的完整的免疫球蛋白，並可為完整免疫球蛋白的免疫 反應部分。抗體通常為免疫球蛋白分子的四聚物。本發明中的抗體可以以多種形式存 在，包括例如，多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab) 2，以及單鏈抗體和人源化抗體 (Harlow 等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY ；Harlow 等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, New York ;Houston 等，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 ;Bird 等，1988, Science242:423-426)。
[0060] 術語"抗體片段"指的是完整抗體的一部分，並指的是完整抗體的抗原決定可變 區。抗體片段的例子包括但不限於Fab、Fab'、F(ab'） 2和Fv片段，由抗體片段形成的線性 抗體、scFv抗體和多特異性抗體。
[0061] "抗體重鏈"，如本文所用的，指的是以它們自然發生構象存在於所有抗體分子的 兩種類型的多肽鏈中較大的鏈。
[0062] "抗體輕鏈"，如本文所用的，指的是以它們自然發生構象存在於所有抗體分子的 兩種類型的多肽鏈中較小的鏈，κ和λ輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。
[0063] 如本文所用的，術語"合成抗體"，指利用重組DNA技術產生的抗體，諸如例如，由 如本文所述的噬菌體表達的抗體。該術語也應當被解釋為指已經由DNA分子的合成產生的 抗體，所述DNA分子編碼抗體並且該DNA分子表達抗體蛋白或規定抗體的胺基酸序列，其中 DNA或胺基酸序列已經利用本領域可用和公知的合成DNA或胺基酸序列技術獲得。
[0064] 如本文所用的，術語"抗原"或"Ag"被定義為激發免疫應答的分子。該免疫應答可 涉及抗體產生，或特異性免疫活性細胞的活化，或兩者。技術人員將理解任何大分子--實 際上包括所有的蛋白質或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重組或基因組DNA。技術人員 將理解任何DNA--其包括編碼引起免疫應答的蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列， 因此編碼如本文使用的術語"抗原"。此外，本領域技術人員將理解抗原不必單獨地由基因 的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本發明包括但不限於，多於一個的基因的部分 核苷酸序列的用途，並且這些核苷酸序列以不同的組合進行布置，以引起期望的免疫應答。 此外，技術人員將理解抗原根本不必由"基因"進行編碼。容易顯而易見的是抗原可被產生、 合成或可源自生物學樣本。這種生物學樣本可包括但不限於組織樣本、腫瘤樣本、細胞或生 物學流體。
[0065] 如本文所用的，術語"抗腫瘤效應"，指的是生物學效應，其可由腫瘤體積的減少、 腫瘤細胞數的減少、轉移數的減少、預期壽命的增加或與癌性狀況相關的各種生理症狀的 改善清楚表示。"抗腫瘤效應"也可由本發明的肽、多核苷酸、細胞和抗體在預防腫瘤在第一 位置發生的能力清楚表示。
[0066] 根據本發明，術語"自體抗原"指由免疫系統錯誤識別為外源（foreign)的任何自 身抗原。自體抗原包括但不限於細胞蛋白、磷蛋白、細胞表面蛋白、細胞脂質、核酸、糖蛋白， 包括細胞表面受體。
[0067] 如本文所用的，術語"自身免疫疾病"被定義為由自身免疫應答產生的病症。自體 免疫疾病是對自身抗原的不適當和過度應答的結果。自身免疫疾病的例子包括但不限於阿 狄森氏疾病、斑禿、強直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克羅恩氏疾病、糖尿病 (1型）、營養不良性大皰性表皮鬆解症、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯氏疾病、吉蘭-巴 雷症候群、橋本氏疾病、溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症、重症肌無力、尋常型 天皰瘡、牛皮癬、風溼熱、類風溼性關節炎、結節病、硬皮病、斯耶格倫氏症候群、脊椎關節病 變、甲狀腺炎、血管炎、白癜風、粘液性水腫、惡性貧血、潰瘍性結腸炎等等。
[0068] 如本文所用的，術語"自體"指關於源自相同個體的任何物質，它隨後被再次引入 該個體。
[0069] "同種異基因的（allogeneic) "指的是源自相同物種的不同動物的移植物。
[0070] "異種的（xenogeneic) "指的是源自不同物種的動物的移植物。
[0071] 如本文所用的，術語"癌症"被定義為以畸變細胞的快速和失控生長為特徵的疾 病。癌細胞可局部蔓延或通過血流和淋巴系統蔓延至身體的其他部分。各種癌症的例子包 括但不限於乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、 腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
[0072] 如本文使用的術語"共刺激配體"包括特異性結合T細胞上的關聯（cognate)共 刺激分子的抗原呈遞細胞（例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等等）上的分子，由此除了通過 例如將TCR/CD3複合物與用肽負載的MHC分子結合提供的初級信號之外，還提供介導T細 胞應答的信號，所述T細胞應答包括但不限於增殖、活化、分化等等。共刺激配體可包括但 不限於 CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、0X40L、可誘導的共刺激配體 (IC0S-L)、細胞間粘附分子（ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋 巴毒素 β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配體受體的激動劑或抗體和與B7-H3 特異性結合的配體。共刺激配體也包括，特別是與存在於T細胞上的共刺激分子特異性結 合的抗體，和與⑶83特異性結合的配體，所述共刺激分子諸如但不限於⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、 0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、 B7-H3。
[0073] "共刺激分子"指的是與共刺激配體特異性結合的T細胞上的關聯結合伴侶，由此 介導T細胞的共刺激應答，諸如但不限於增殖。共刺激分子包括但不限於MHCI類分子、BTLA 和Toll配體受體。
[0074] 如本文所用的，"共刺激信號"指的是與初級信號結合，諸如TCR/CD3連接作用，導 致T細胞增殖和/或關鍵分子的上調或下調的信號。
[0075] "疾病"是動物的一種健康狀態，其中動物不能保持穩態，和其中如果不改善該疾 病，則動物的健康繼續惡化。與之相比，動物中的"病症"是一種健康狀態，其中動物能夠保 持穩態，但其中動物的健康狀態與它沒有處於該病症相比不太有利。保持不治療，病症不必 定引起動物健康狀態的進一步降低。
[0076] 如本文所用的，"有效量"，指提供治療性或預防性益處的量。
[0077] "編碼"指的是多核苷酸諸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特異性序列用作模板 合成在生物學過程中的其他多聚體和大分子的固有性質，所述多聚體和大分子具有核苷酸 (即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或胺基酸的限定序列中的任一個和由其產生的生物學 性質。因此，如果相應於那個基因的mRNA的轉錄和翻譯在細胞或其他生物學系統中產生蛋 白質，則基因編碼蛋白質。核苷酸序列等同mRNA序列並通常提供在序列表中的編碼鏈，和 用作轉錄基因或cDNA的模板的非編碼鏈兩者，都可被稱為編碼那個基因或cDNA的蛋白質 或其他產物。
[0078] 如本文所用的，"內源的"指的是來自有機體、細胞、組織或系統的或在有機體、細 胞、組織或系統內產生的任何物質。
[0079] 如本文所用的，術語"外源的"指的是任何從有機體、細胞、組織或系統引入的或在 有機體、細胞、組織或系統外產生的物質。
[0080] 如本文所用的，術語"表達"被定義為由它的啟動子驅動的特定核苷酸序列的轉錄 和/或翻譯。
[0081] "表達載體"指的是包括重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連 接至待表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包括足夠的用於表達的順式作用元 件；用於表達的其他元件可由宿主細胞供應或在體外表達系統中供應。表達載體包括所有 本領域已知的那些，諸如併入重組多核苷酸的粘粒、質粒（例如，裸露或包含在脂質體中） 和病毒（例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒）。
[0082] "同源的"指的是兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。 當兩個比較序列中的位置被相同的鹼基或胺基酸單體亞單元佔據時，例如，如果兩個DNA 分子的每一個中的位置被腺嘌呤佔據，則所述分子在那個位置上是同源的。兩個序列之間 的同源性百分比為由兩個序列共有的匹配或同源的位置數除以比較的位置數X100的函 數。例如，如果兩個序列中10個位置中的6個是匹配或同源的，則兩個序列是60%同源的。 以例子說明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50 %的同源性。通常，當比對兩個序列以給出 最大同源性時，進行比較。
[0083] 如本文所用的，術語"免疫球蛋白"或"Ig"被定義為起到抗體作用的一類蛋白質。 由B細胞表達的抗體有時被稱為BCR(B細胞受體）或抗原受體。包括在該類蛋白質中的五 個成員為IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA為存在於身體分泌物諸如唾液、淚液、母乳、胃腸 分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初級抗體。IgG是最常見的循環抗體。IgM 是在多數對象的初級免疫應答中產生的主要免疫球蛋白。它在凝集反應、補體結合和其他 抗體應答中是最有效的免疫球蛋白，並且在抵禦細菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有 已知抗體功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受體。IgE是在暴露於過敏原後，通過引起從肥 大細胞和嗜鹼性粒細胞釋放介體，介導速發過敏性的免疫球蛋白。
[0084] 如本文所用的，"指導物質"包括出版物、記錄、圖表或任何其他可用於傳達本發明 組合物和方法的有用性的表達媒介。本發明的試劑盒的指導物質可例如被附加在包含本發 明的核酸、肽和/或組合物的容器上，或與包含核酸、肽和/或組合物的容器一起運送。可 選地，指導物質可與容器分開地運送，目的是指導物質和化合物由接受者配合使用。
[0085] "分離的"指從自然狀態改變或移出。例如，天然存在於活動物中的核酸或肽不是 "分離的"，但部分或完全與它的自然狀態的共存物質分離的同一核酸或肽是"分離的"。分 離的核酸或蛋白可以以基本上純化的形式存在，或例如，可存在於非自然環境，諸如宿主細 胞。
[0086] 在本發明的內容中，對於通常發生的核酸鹼基使用以下縮寫。"A"指的是腺苷，"C" 指的是胞嘧啶，"G"指的是鳥苷，"T"指的是胸苷，和"U"指的是尿苷。
[0087] 除非另有規定，"編碼胺基酸序列的核苷酸序列"包括為彼此簡併版本並編碼相同 的胺基酸序列的所有核苷酸序列。短語編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列也可包括內含子， 其程度為編碼該蛋白質的核苷酸序列可在某些版本中包含內含子（一個或多個）。
[0088] 如本文所用的，"慢病毒"指的是逆轉錄病毒科的屬。在逆轉錄病毒中慢病毒是唯 一能夠感染非分裂細胞的；它們可傳遞顯著量的遺傳信息進入宿主細胞的DNA，所以它們 是基因傳遞載體的最有效的方法之一。HIV、S1V和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的 載體提供了完成顯著水平基因體內轉移的工具。
[0089] 如本文所用的，術語"調節"指與缺少治療或化合物的對象中的應答水平相比，和/ 或與以其他方式相同但未治療的對象中的應答水平相比，介導對象中應答水平的可檢測的 增加或減少。該術語包括擾亂和/或影響天然信號或應答，由此介導對象優選人的有益的 治療性應答。
[0090] 除非另有規定，"編碼胺基酸序列的核苷酸序列"包括為彼此簡併版本並編碼相同 的胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質和RNA的核苷酸序列可包括內含子。
[0091] 術語"可操作地連接"指的是調節序列和異源核酸序列之間的功能連接，其產生後 者的表達。例如，當第一核酸序列位於與第二核酸序列的功能關係中時，第一核酸序列與第 二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則啟動子被可操 作地連接至編碼序列。通常地，可操作地連接的DNA序列是鄰近的，其中在相同的閱讀框中 必須連接兩個蛋白編碼區。
[0092] 術語"過表達的"腫瘤抗原或腫瘤抗原的"過表達"意欲指示相對於來自組織或器 官的正常細胞的表達水平，來自疾病區如患者的特定組織或器官內的實體瘤的細胞中腫瘤 抗原表達的異常水平。具有以腫瘤抗原過表達為特徵的實體瘤或血液學惡性腫瘤的患者可 由本領域已知的標準測定確定。
[0093] 免疫原性組合物的"腸胃外"施用包括例如皮下（s.c)、靜脈內（i.v.)、肌肉內 (i.m.)或胸骨內注射，或注入技術。
[0094] 術語"患者"、"對象"、"個體"等等在本文中可交換使用，並指的是服從本文描述方 法的任何動物或其細胞，不論是體外或原位。在一些非限制性實施方式中，患者、對象或個 體為人。
[0095] 如本文所用的，術語"多核苷酸"被定義為核苷酸鏈。此外，核酸為核苷酸的多聚 體。因此，如本文所用的，核酸和多核苷酸是可交換的。本領域技術人員具有核酸為可被水 解成單體"核苷酸"的多核苷酸的一般常識。單體核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的， 多核苷酸包括但不限於通過本領域可用的任何手段獲得的所有的核酸序列，所述手段包括 但不限於重組手段，即，從重組文庫或細胞基因組，利用普通克隆技術和PCR?等等克隆核 酸序列，和合成手段。
[0096] 如本文所用的，術語"肽"、"多肽"和"蛋白質"可交換使用，並指的是由肽鍵共價 連接的胺基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個胺基酸，和對可構成蛋白質 或肽的序列的胺基酸的最大數目沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質，所述肽或蛋白質包 括通過肽鍵相互連接的兩個或多個胺基酸。如本文所用的，該術語指的是短鏈，其在本領域 中也例如通常被稱為肽、寡肽和寡聚體；和較長鏈，其在本領域中通常被稱為蛋白質，其具 有很多類型。"多肽"包括例如生物學活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚 體、多肽的變體、修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成 肽或其組合。
[0097] 如本文所用的，術語"啟動子"被定義為開始多核苷酸序列的特異性轉錄需要的， 由細胞的合成機器或引入的合成機器識別的DNA序列。
[0098] 如本文所用的，術語"啟動子/調節序列"指可操作地連接至啟動子/調節序列的 基因產物表達所需的核酸序列。在一些例子中，該序列可為核心啟動子序列，並且在其他例 子中，該序列也可包括基因產物表達所需的增強子序列和其他調節元件。啟動子/調節序 列可例如為以組織特異方式表達基因產物的序列。
[0099] "組成型"啟動子為核苷酸序列，其當與編碼或規定基因產物的多核苷酸可操作地 連接時，使得在細胞的多數或所有生理學條件下在細胞中產生基因產物。
[0100] "誘導型"啟動子為核苷酸序列，其當與編碼或規定基因產物的多核苷酸可操作地 連接時，使得在基本上僅當相應於啟動子的誘導物存在於細胞中時，在細胞中產生基因產 物。
[0101] "組織-特異性"啟動子為核苷酸序列，其當與編碼基因或由基因規定的多核苷酸 可操作地連接時，使得基本上只要細胞為相應於啟動子的組織類型的細胞，則在細胞中產 生基因產物。
[0102] 如本文所用的，關於抗體的術語"特異性結合"指識別特異性抗原但基本上不識別 或結合樣本中的其他分子的抗體。例如，特異性結合來自一個物種的抗原的抗體也可結合 來自一個或多個物種的抗原。但是，這種跨種反應性本身不改變抗體的特異性類別。在另 一個實例中，特異性結合抗原的抗體也可結合抗原的不同等位基因形式。然而，這種交叉反 應性本身不改變抗體的類別成為特異性的。在一些例子中，術語"特異性的結合"或"特異 性地結合"可參考抗體、蛋白質或肽與第二化學種類的相互作用使用，用於指該相互作用依 賴化學種類上特定結構（例如，抗原決定簇或表位）的存在；例如，抗體通常識別和結合特 異性蛋白結構而不是一般地識別和結合蛋白質。如果抗體對表位"A"是特異性的，則在包 含標記的"A"和抗體的反應中存在包含表位A (或游離的、未標記的A)的分子，將降低結合 至抗體的標記的A的量。
[0103] 通過術語"刺激"指通過結合刺激分子（例如，TCR/⑶3複合物）與它的關聯配體， 由此介導信號轉導事件--諸如但不限於經TCR/CD3複合物的信號轉導--誘導的初級應 答。刺激可介導某些分子的改變的表達，諸如TGF-β的下調和/或細胞骨架結構的再組織 等等。
[0104] "刺激分子"，作為本文使用的術語，指與存在於抗原呈遞細胞上的關聯刺激配體 特異性結合的T細胞上的分子。
[0105] 如本文所用的，"刺激配體"指如此配體，其當存在於抗原呈遞細胞（例如，aAPC、樹 突細胞、B-細胞等等）上時，可與T細胞上的關聯結合伴侶（在本文中被稱為"刺激分子"） 特異性結合，由此介導T細胞的初級應答，其包括但不限於，活化、免疫應答的開始、增殖等 等。刺激配體在本領域中是公知的，並包括，特別是利用肽、抗CD3抗體、超激動劑抗CD28 抗體和超激動劑抗CD2抗體負載的MHC I類分子。
[0106] 術語"對象"、"患者"和"個體"在本文互換使用，並且意欲包括在其內可引起免疫 應答的活有機體（例如，哺乳動物）。對象的例子包括人、狗、貓、小鼠、大鼠和其轉基因物 種。
[0107] 如本文所用的，"基本上純化的"細胞為基本上不含其他細胞類型的細胞。基本上 純化的細胞也指的是已經與以其天然發生狀態與其正常相關聯的其他細胞類型分離的細 胞。在一些例子中，基本上純化的細胞群指的是均質細胞群。在其他例子中，該術語簡單地 指的是已經與以其天然狀態與其正常相關聯的細胞分離的細胞。在一些實施方式中，體外 培養細胞。在其他實施方式中，不在體外培養細胞細胞。
[0108] 如本文所用的，術語"治療性的"表示治療和/或預防。治療性效應通過疾病狀態 的抑制、緩和或根除獲得。
[0109] 術語"治療有效量"指的是將引起由研究者、獸醫、醫學醫生或其他臨床醫生正在 尋找的組織、系統或對象的生物學或醫學應答的對象化合物的量。術語"治療有效量"包括 以下的化合物的量：當被施用時，其足以防止治療的病症或疾病的跡象或症狀中的一個或 多個的發展，或以一定程度減輕治療的病症或疾病的跡象或症狀中的一個或多個。治療有 效量將根據化合物、疾病和其嚴重性、和待治療的對象的年齡、重量等而變化。
[0110] "治療"疾病，作為本文使用的術語，指降低對象經歷的疾病或病症的至少一種跡 象或症狀的頻率或嚴重性。
[0111] 如本文所用的，術語"轉染的"或"轉化的"或"轉導的"指的是如此過程，通過該過 程外源的核酸被轉移或引入宿主細胞。"轉染的"或"轉化的"或"轉導的"細胞是已經由外 源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。該細胞包括初級對象細胞和它的子代。
[0112] 如本文所用的，短語"轉錄控制下"或"可操作地連接"指啟動子處於與多核苷酸 有關的正確的位置和朝向，以控制通過RNA聚合酶進行的轉錄的開始和多核苷酸的表達。
[0113] "載體"為物質組合物，其包括分離的核酸，並且其可用於傳遞分離的核酸至細胞 內部。很多載體在本領域中是已知的，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩性分子化合 物相關的多核苷酸、質粒和病毒。因此，術語"載體"包括自主複製的質粒或病毒。該術語 也應被解釋為包括便於將核酸轉移入細胞的非質粒和非病毒化合物，諸如例如聚賴氨酸化 合物、脂質體等等。病毒載體的例子包括但不限於，腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病 毒載體等等。
[0114] 範圍：在該公開中，本發明的多個方面可以以範圍形式中示出。應當理解範圍形 式中的描述僅是為了方便和簡潔，並不應被解釋為對本發明範圍不可動搖的限制。因此，範 圍的描述應被考慮為已具體公開了所有可能的子範圍以及處於那個範圍內的單個數值。例 如，範圍諸如從1至6的描述應被考慮為已具體公開了子範圍諸如從1至3、從1至4、從1 至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及那個範圍內的單個數字，例如，1、2、2. 7、3、4、5、 5. 3和6。不管範圍的寬度如何，這一點是適用的。
[0115] 描述
[0116] 本發明提供組合物和方法用於治療癌症以及其他疾病。癌症可以是血液學惡性腫 瘤、實體瘤、原發或轉移性腫瘤。使用本發明的組合物和方法可治療的其他疾病包括病毒、 細菌和寄生蟲感染以及自身免疫病。
[0117] 在一個實施方式中，本發明提供工程化的表達CAR的細胞（例如，Thl7細胞），其 中CAR T細胞展示抗腫瘤性質。本發明的CAR可被工程化以包括細胞外結構域，所述細胞 外結構域具有融合至T細胞抗原受體複合物ζ鏈（例如，CD3的細胞內信號傳導結構 域的抗原結合結構域。本發明的CAR當在T細胞中表達時，能夠基於抗原結合特異性改變 (redirect)抗原識別。示例性抗原為間皮蛋白，因為該抗原在大部分癌上表達。然而，本 發明不限於靶向間皮蛋白。相反地，本發明包括任何抗原結合結構域，當其結合其關聯抗原 時，影響腫瘤細胞，以便腫瘤細胞不生長、被促使死亡或以其他方式被影響，以便患者的腫 瘤負荷（tumor burden)縮小或消除。抗原結合結構域優選與來自共刺激分子和ζ鏈中的 一個或多個的細胞內結構域融合。優選地，抗原結合結構域與選自IC0S信號傳導結構域、 CD137(4-1BB)信號傳導結構域、CD28信號傳導結構域、CD3(信號結構域和其任何組合的 一個或多個細胞內結構域融合。
[0118] 在一個實施方式中，本發明的CAR包括IC0S信號傳導結構域。這是因為本發明部 分基於CAR-介導的Thl7細胞的T-細胞應答可通過添加共刺激結構域進一步增強的發現。 例如，包括IC0S信號傳導結構域，與其他相同的沒有被工程化表達IC0S的CAR T細胞相比 顯著增加表達CAR的Thl7細胞的IL-17產生、抗腫瘤活性和體內持久性。重要地，CAR中包 括IC0S信號傳導結構域也顯著減少IL-2產生。在一個實施方式中，減少和/或消除IL-2 產生是有益的，因為CAR不觸發調節T細胞增殖。
[0119] 在一些實施方式中，本發明涉及編碼CAR的逆轉錄病毒或慢病毒載體，其穩定地 併入Thl7細胞並且穩定地在其中表達。在其他實施方式中，本發明涉及編碼CAR的RNA，其 轉染進入Thl7細胞並且在其中瞬時表達。細胞中CAR的瞬時非整合表達減輕了與CAR在 細胞中永久和整合表達的考慮。
[0120] 鉬合物
[0121] 本發明提供了包括細胞外結構域和細胞內結構域的嵌合抗原受體（CAR)。細胞外 結構域包括靶-特異性結合元件，其另外被稱為抗原結合結構域。在一些實施方式中，細胞 外結構域也包括鉸鏈結構域。細胞內結構域或另外的細胞質結構域包括共刺激信號傳導區 和ζ鏈部分。共刺激信號傳導區指的是包括共刺激分子的細胞內結構域的一部分CAR。共 刺激分子為除抗原受體或它們的配體外淋巴細胞對抗原的有效應答所需要的細胞表面分 子。
[0122] 在CAR的細胞外結構域和跨膜結構域之間，或在CAR的細胞質結構域和跨膜結構 域之間，可併入間隔結構域。如本文所用的，術語"間隔結構域"通常指起到將跨膜結構域 連接至多肽鏈的細胞外結構域或細胞質結構域作用的任何寡肽或多肽。間隔結構域可包括 上至300個胺基酸，優選地10至100個胺基酸和最優選地25至50個胺基酸。
[0123] 本發明包括表達CAR的逆轉錄病毒和慢病毒載體構建體，其可直接轉導進入細 胞。本發明也包括可直接轉染進入細胞的RNA構建體。用於產生用於轉染的mRNA的方法 包括用具有專用設計的引物模板的體外轉錄（IVT)，隨後多聚腺苷酸添加，以產生構建體， 其含有3'和5'非翻譯序列（"UTR")、5'帽和/或內部核糖體進入位點（IRES)、待表達的 基因和多聚腺苷酸尾，典型地長度為50-2000個鹼基。如此產生的RNA可有效地轉染不同 類型的細胞。在一個實施方式中，模板包括CAR的序列。
[0124] 優選地，CAR包括細胞外結構域、跨膜結構域和細胞質結構域。細胞外結構域和跨 膜結構域可源自此類結構域的任何期望來源。
[0125] 在一些情況下，本發明CAR的鉸鏈結構域包括⑶8 α鉸鏈結構域。在一個實施方 式中，CD8鉸鏈結構域包括SEQ ID Ν0:4的核酸序列。在另一實施方式中，CD8鉸鏈結構域 包括由SEQ ID Ν0:4的核酸序列編碼的胺基酸序列。
[0126] 抗原結合結構域
[0127] 在一個實施方式中，本發明的CAR包括另外被稱為抗原結合結構域的靶-特異性 結合元件。部分的選擇取決於限定靶細胞表面的配體的類型和數目。例如，可選擇抗原結 合結構域，以識別用作與具體疾病狀態相關的靶細胞上的細胞表面標記的配體。因此，可用 作本發明的CAR的抗原部分結構域的配體的細胞表面標記的例子包括與病毒、細菌和寄生 蟲感染，自身免疫疾病和癌細胞相關的那些標記。
[0128] 在一個實施方式中，本發明的CAR可經由工程化特異性結合至腫瘤細胞上抗原的 期望抗原結合結構域而被工程化，以便靶向興趣腫瘤抗原。在本發明的內容中，"腫瘤抗原" 或"過度增生性病症（hyperproliferative disorder)抗原"或"與過度增生性病症相關的 抗原"指的是對於特定過度增生性病症諸如癌症共同的抗原。本文討論的抗原僅以實例的 方式被包括。該列舉不意欲是窮盡的，並且更多的實例對於本領域技術人員將是容易顯而 易見的。
[0129] 腫瘤抗原是由引起免疫應答特別是T-細胞介導的免疫應答的腫瘤細胞產生的蛋 白質。本發明的抗原結合結構域的選擇將取決於待治療癌症的具體類型。腫瘤抗原在本 領域中是公知的，並包括例如神經膠質瘤相關的抗原、癌胚抗原（CEA)、β-人絨毛膜促性 腺素 、α -胎蛋白（AFP)、凝集素-反應的AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶 反轉錄酶、RU1、RU2 (AS)、腸羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特異性抗 原（PSA)、PAP、NY-ES0-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列 腺-癌腫瘤抗原-l(PCTA-l)、MGE、ELF2M、中性白細胞彈性蛋白酶、印hrinB2、CD22、胰島素 生長因子（IGF)-I、IGF-II、IGF-I受體和間皮素。
[0130] 在一個實施方式中，腫瘤抗原包括與惡性腫瘤相關的一個或多個抗原癌症表位。 惡性腫瘤表達可用作免疫攻擊的靶抗原的許多蛋白。這些分子包括但不限於組織-特異性 抗原諸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶（PAP) 和前列腺-特異性抗原（PSA)。其他靶分子屬於轉化相關分子諸如致癌基因 HER-2/Neu/ ErbB-2的組。而另一組的靶抗原為胎性癌抗原諸如癌胚抗原（CEA)。在B-細胞淋巴瘤中， 腫瘤-特異性個體基因型免疫球蛋白構成對個體腫瘤唯一的真正的腫瘤-特異性免疫球蛋 白抗原。B-細胞分化抗原諸如CD19、CD20和CD37是B-細胞淋巴瘤中靶抗原的其他候選 物。這些抗原中的一些（CEA、HER-2、⑶19、⑶20、個體基因型）已經有限成功地用作利用單 克隆抗體的被動免疫療法的標靶。
[0131] 本發明中提及的該類型腫瘤抗原也可為腫瘤-特異性抗原（TSA)或腫瘤相關抗原 (TAA)。TSA為對腫瘤細胞唯一的，並不發生在身體的其他細胞上。TAA相關的抗原不是對腫 瘤細胞唯一的，並且相反，其在不能誘導對抗原的免疫耐受狀態的狀況下，也在正常細胞上 進行表達。腫瘤上的抗原表達可在使免疫系統能夠反應抗原的狀況下發生。TAA可為在胚 胎發育期間，當免疫系統不成熟並且不能反應時，在正常細胞上表達的抗原，或它們可為在 正常細胞上以極低的水平正常存在的抗原，但其在腫瘤細胞上以高得多的水平進行表達。
[0132] TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原諸如MART-1/ MelanA(MART-l)、gpl00(Pmell7)、酪氨酸酶、TRP-UTRP-2和腫瘤-特異性多譜系抗原諸如 MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5 ;過表達的胚胎抗原諸如CEA ;過表達的致癌基 因和突變的腫瘤-抑制基因諸如p53、Ras、HER-2/neu ;由染色體易位產生的獨特的腫瘤抗 原諸如 BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR ;和病毒抗原，諸如 Epstein Barr 病毒 抗原EBVA和人乳頭瘤病毒（HPV)抗原E6和E7。其他大的、基於蛋白的抗原包括TSP-180、 MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23Hl、PSA、 TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17. 1、NuMa、K-ras、β -聯蛋白、CDK4、Mum-l、pl5、pl6、43-9F、 5T4、791Tgp72、a -胎蛋白、β -HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27. 29\BCAA、CA195、 CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、 MG7-Ag、M0V18、NB/70K、NY-C0-l、RCASl、SDCCAG16、TA-90\Mac-2 結合蛋白 \ 親環蛋白 C 相 關蛋白、TAAL6、TAG72、TLP 和 TPS。
[0133] 在優選的實施方式中，CAR的抗原結合結構域部分靶向下述抗原，其包括但不限 於 CD19、CD20、CD22、R0R1、間皮蛋白、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvIII、⑶-2、 MY-ES0-1TCR、MAGE A3TCR 等等。
[0134] 取決於期望的待靶向的抗原，本發明的CAR可被工程化以包括適當的對期望的抗 原靶特異的抗原結合部分。例如，如果間皮蛋白是期望的待靶向的抗原，那麼間皮蛋白的抗 體可用作用於併入本發明的CAR的抗原結合部分。
[0135] 在一個實施方式中，本發明CAR的抗原結合結構域部分靶向間皮蛋白。優選地，本 發明CAR的抗原結合結構域部分是SSlscFv，其識別人間皮蛋白，其中SSlscFv的核酸序列 包括SEQ ID N0:3中闡釋的序列。在另一實施方式中，本發明的CAR的SSlscFv部分包括 由序列SEQ ID N0:3中闡釋的核酸序列編碼的胺基酸序列。
[0136] 跨臘結構域
[0137] 對於跨膜結構域，CAR可被設計以包括融合至CAR的細胞外結構域的跨膜結構域。 在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結構域之一相關聯的跨膜結構域。在一些例子中， 可選擇跨膜結構域，或通過胺基酸取代進行修飾，以避免將這樣的結構域結合至相同或不 同的表面膜蛋白的跨膜結構域，從而最小化與受體複合物的其他成員的相互作用。
[0138] 跨膜結構域可源於天然來源或合成來源。在天然來源中，該結構域可源於任何膜 結合蛋白或跨膜蛋白。具體用於本發明的跨膜區可源於T-細胞受體的α、β或ζ鏈、 CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、 ⑶137、⑶154、IC0S(即至少包括上述中的跨膜區（一個或多個））。可選地，跨膜結構域可 為合成的，在該情況下，它將包括佔主導的疏水殘基諸如亮氨酸和纈氨酸。優選地，將在合 成跨膜結構域的每一端上發現苯基丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的三聯體。任選地，短的寡肽或 多肽連接體，優選長度在2和10個胺基酸之間，可在CAR的跨膜結構域和細胞質信號傳導 結構域之間形成連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯體提供了特別合適的連接體。
[0139] 優選地，本發明CAR的跨膜結構域包括IC0S跨膜結構域。在一個實施方式中，IC0S 跨膜結構域包括SEQ ID N0:5的核酸序列。在另一實施方式中，IC0S跨膜結構域包括由SEQ ID N0:5的核酸序列編碼的胺基酸序列。
[0140] 細朐質結構域
[0141] 本發明的CAR的細胞質結構域或另外的細胞內信號傳導結構域是造成其中已放 置CAR的免疫細胞的至少一種正常效應子功能的活化的原因。術語"效應子功能"指的是 細胞的專有功能。例如，T細胞的效應子功能可為包括細胞因子分泌的細胞溶解活性或輔 助活性。因此術語"細胞內信號傳導結構域"指的是轉導效應子功能信號並指導細胞實施 專有功能的蛋白部分。儘管通常可使用整個細胞內信號傳導結構域，但在很多例子中，不必 使用整個鏈。就使用細胞內信號傳導結構域的截短部分而言，這種截短部分可用於代替完 整的鏈，只要它轉導效應子功能信號。術語細胞內信號傳導結構域因此指包括足以轉導效 應子功能信號的細胞內信號傳導結構域的任何截短部分。
[0142] 用於本發明的CAR的細胞內信號傳導結構域的優選例子包括T細胞受體（TCR)的 細胞質序列和協同行動以在抗原受體結合後開始信號轉導的共受體，以及這些序列的任何 衍生物或變體和具有相同的功能能力的任何合成序列。
[0143] 已知通過TCR單獨產生的信號不足以完全活化T細胞，並且也需要次級或共刺激 信號。因此，T細胞活化可認為由兩個不同類的細胞質信號傳導序列介導：通過TCR開始抗 原-依賴性初級活化的那些（初級細胞質信號傳導序列）和以抗原-非依賴性方式起作用 以提供次級或共刺激信號的那些（次級細胞質信號傳導序列）。
[0144] 初級細胞質信號傳導序列以刺激方式或以抑制方式調節TCR複合物的初級活化。 以刺激方式起作用的初級細胞質信號傳導序列可包含信號傳導基序，其已知為基於免疫受 體酪氨酸的活化基序或ITAM。
[0145] 包含在本發明中具有具體用途的初級細胞質信號傳導序列的ITAM的例子包括源 於 TCR ζ、FcR γ、FcRP、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的那些。 特別優選地，本發明的CAR中的細胞質信號傳導分子包括源於CD3 ζ的細胞質信號傳導序 列。
[0146] 在優選的實施方式中，CAR的細胞質結構域可被設計以本身包括CD3_(信號傳 導結構域，或可與在本發明的CAR的內容中有用的任何其他期望的細胞質結構域（一個或 多個）聯合。例如，CAR的細胞質結構域可包括CD3(鏈部分和共刺激信號傳導區。共刺 激信號傳導區指的是包括共刺激分子的細胞內結構域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴 細胞對抗原的有效應答所需的除抗原受體或它們的配體外的細胞表面分子。這種分子的 例子包括 CD27、CD28、4-1BB(CD137)、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴細胞功能相關抗 原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和與⑶83特異性結合的配體等等。因此，盡 管本發明主要以IC0S作為共刺激信號傳導元件的例子，但其他共刺激元件也位於本發明 的範圍內。
[0147] 本發明的CAR的細胞質信號傳導部分內的細胞質信號傳導序列可以隨機或以規 定的順序相互連接。任選地，短的寡肽或多肽連接體，優選長度在2和10個胺基酸，可形成 該連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯體提供了特別合適的連接體。
[0148] 在一個實施方式中，細胞質結構域被設計以包括CD3_(的信號傳導結構域和 IC0S的信號傳導結構域。在另一個實施方式中，細胞質結構域被設計以包括CD3-(的信號 傳導結構域和4-1BB的信號傳導結構域。還在另一個實施方式中，細胞質結構域被設計以 包括⑶3- ζ的信號傳導結構域和IC0S和4-1BB的信號傳導結構域。
[0149] 在一個實施方式中，本發明的CAR中的細胞質結構域被設計以包括IC0S的信號傳 導結構域和⑶3-ζ的信號傳導結構域，其中IC0S的信號傳導結構域包括SEQ ID N0:6中 提出的核酸序列和⑶3-ζ的信號傳導結構域包括SEQ ID NO: 7中提出的核酸序列。
[0150] 在一個實施方式中，本發明CAR的細胞質結構域被設計為包括IC0S的信號傳導結 構域和⑶3-ζ的信號傳導結構域，其中IC0S的信號傳導結構域包括由SEQ ID N0:6闡釋 的核酸序列編碼的胺基酸序列和⑶3-ζ的信號傳導結構域包括由SEQ ID NO: 7闡釋的核 酸序列編碼的胺基酸序列。
[0151]
[0152] 本發明包括DNA構建體，其包括CAR的序列，其中該序列包括抗原結合結構域的核 酸序列，其可操作地連接至細胞內結構域的核酸序列。可用於本發明的CAR的示例性細胞 內結構域包括但不限於⑶3-ζ、IC0S、⑶28、4-1ΒΒ等等的細胞內結構域。在一些情況下， CAR可包括CD3- ζ、ICOS、CD28、4-1BB等等的任何組合。
[0153] 在一個實施方式中，本發明的CAR包括抗間皮蛋白scFv(例如SSlscFv)、人⑶8 鉸鏈、IC0S跨膜結構域和人IC0S和CD3 ζ信號傳導結構域。在一個實施方式中，本發明的 CAR包括SEQ ID Ν0:8闡釋的核酸序列。在另一實施方式中，本發明的CAR包括由SEQ ID NO:8闡釋的核酸序列編碼的胺基酸序列。
[0154] 編碼期望分子的核酸序列可利用在本領域中已知的重組方法獲得，諸如例如利用 標準的技術，通過從表達基因的細胞中篩選文庫，通過從已知包括該基因的載體中得到該 基因，或從包含該基因的細胞和組織中直接分離。可選地，感興趣的基因可被合成生產，而 不被克隆。
[0155] 本發明也提供了其中插入本發明的DNA的載體。源於逆轉錄病毒諸如慢病毒的載 體是實現長期基因轉移的合適工具，因為它們允許轉基因長期、穩定的整合併且其在子細 胞中增殖（propagation)。慢病毒載體具有超過源自致癌逆轉錄病毒諸如鼠科白血病病毒 的載體的額外優點，因為它們可轉導非增殖的細胞，諸如肝細胞。它們也具有低免疫原性的 額外優點。
[0156] 簡單概括，通常通過可操作地連接編碼CAR多肽或其部分的核酸至啟動子，並將 構建體併入表達載體，實現編碼CAR的天然或合成核酸的表達。該載體對於複製和整合真 核細胞可為合適的。典型的克隆載體包含可用於調節期望核酸序列表達的轉錄和翻譯終止 子、初始序列和啟動子。
[0157] 本發明的表達構建體也可利用標準的基因傳遞方案，用於核酸免疫和基因療 法。基因傳遞的方法在本領域中是已知的。見例如美國專利號5, 399, 346、5, 580, 859、 5, 589, 466,在此通過引用全文併入。在另一個實施方式中，本發明提供了基因療法載體。
[0158] 該核酸可被克隆入許多類型的載體。例如，該核酸可被克隆入如此載體，其包括但 不限於質粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達載體、復 制載體、探針產生載體和測序載體。
[0159] 進一步地，表達載體可以以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術在本領域 中是公知的並在例如 Sambrook 等（2001，Molecular Cloing:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和其他病毒學和分子生物學手冊中進行了描 述。可用作載體的病毒包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病 毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機體中起作用的複製起點、啟動子序列、方便的限 制酶位點和一個或多個可選擇的標記（例如，W0 01/96584 ;W0 01/29058;和美國專利號 6, 326, 193)。
[0160] 已經開發許多基於病毒的系統，用於將基因轉移入哺乳動物細胞。例如，逆轉錄病 毒提供了用於基因傳遞系統的方便的平臺。可利用在本領域中已知的技術將選擇的基因插 入載體並包裝入逆轉錄病毒顆粒。該重組病毒可隨後被分離和傳遞至體內或離體的對象細 胞。許多逆轉錄病毒系統在本領域中是已知的。在一些實施方式中，使用腺病毒載體。許 多腺病毒載體在本領域中是已知的。在一個實施方式中，使用慢病毒載體。
[0161] 額外的啟動子元件，例如增強子，調節轉錄開始的頻率。通常地，這些位於起始位 點上遊的30-110bp區域中，儘管近來已經顯示許多啟動子也包含起始位點下遊的功能元 件。啟動子元件之間的間隔經常是柔性的，以便當元件相對於另一個被倒置或移動時，保持 啟動子功能。在胸苷激酶（tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可被增加隔開50bp，活性 才開始下降。取決於啟動子，表現出單個元件可合作或獨立地起作用，以起動轉錄。
[0162] 合適的啟動子的一個例子為即時早期巨細胞病毒（CMV)啟動子序列。該啟動子 序列為能夠驅動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水平表達的強組成型啟動子 序列。合適的啟動子的另一個例子為延伸生長因子-la (EF-la)。然而，也可使用其他組 成型啟動子序列，包括但不限於類人猿病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒（MMTV)、 人免疫缺陷病毒（HIV)長末端重複（LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、鳥類白血病病毒啟動子、 艾伯斯坦-巴爾（Epstein-Barr)病毒即時早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、以及人基 因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅素啟動子和肌酸激酶啟動 子。進一步地，本發明不應被限於組成型啟動子的應用。誘導型啟動子也被考慮為本發明 的一部分。誘導型啟動子的使用提供了分子開關，其能夠當這樣的表達是期望的時，打開可 操作地連接誘導型啟動子的多核苷酸序列的表達，或當表達是不期望的時關閉表達。誘導 型啟動子的例子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子和四環 素啟動子。
[0163] 為了評估CAR多肽或其部分的表達，被引入細胞的表達載體也可包含可選擇的標 記基因或報導基因中的任一個或兩者，以便於從尋求通過病毒載體轉染或感染的細胞群中 鑑定和選擇表達細胞。在其他方面，可選擇的標記可被攜帶在單獨一段DNA上並用於共轉 染程序。可選擇的標記和報導基因兩者的側翼都可具有適當的調節序列，以便能夠在宿主 細胞中表達。有用的可選擇標記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。
[0164] 報導基因用於鑑定潛在轉染的細胞並用於評價調節序列的功能性。通常地，報導 基因為以下基因：其不存在於受體有機體或組織或由受體有機體或組織進行表達，並且其 編碼多肽，該多肽的表達由一些可容易檢測的性質例如酶活性清楚表示。在DNA已經被引 入受體細胞後，報導基因的表達在合適的時間下進行測定。合適的報導基因可包括編碼熒 光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶的基因或綠色螢光蛋白基 因（例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合適的表達系統是公知的並可利用 已知技術製備或從商業上獲得。通常，顯示最高水平的報導基因表達的具有最少5個側翼 區的構建體被鑑定為啟動子。這樣的啟動子區可被連接至報導基因並用於評價試劑調節啟 動子-驅動轉錄的能力。
[0165] 將基因引入細胞和將基因表達入細胞的方法在本領域中是已知的。在表達載體的 內容中，載體可通過在本領域中的任何方法容易地引入宿主細胞，例如，哺乳動物、細菌、酵 母或昆蟲細胞。例如，表達載體可通過物理、化學或生物學手段轉移入宿主細胞。
[0166] 將多核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染法、粒子轟擊、顯 微注射、電穿孔等等。生產包括載體和/或外源核酸的細胞的方法在本領域中是公知的。見 例如 Sambrook 等（2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。將多核苷酸引入宿主細胞的優選方法為磷酸I丐轉染。
[0167] 將感興趣的多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒 載體，特別是逆轉錄病毒載體，已經成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細胞的 方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺伴隨病毒等等。見 例如美國專利號5, 350, 674和5, 585, 362。
[0168] 將多核苷酸引入宿主細胞的化學手段包括膠體分散系統，諸如大分子複合物、納 米膠囊、微球、珠；和基於脂質的系統，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質體。用作體外 和體內遞送工具（delivery vehicle)的示例性膠體系統為脂質體（例如，人造膜囊）。
[0169] 在使用非病毒傳遞系統的情況下，示例性傳遞工具為脂質體。考慮使用脂質製劑， 以將核酸引入宿主細胞（體外、離體（ex vivo)或體內）。在另一方面，該核酸可與脂質相 關聯。與脂質相關聯的核酸可被封裝入脂質體的水性內部中，散布在脂質體的脂雙層內，經 與脂質體和寡核苷酸兩者都相關聯的連接分子附接至脂質體，陷入脂質體，與脂質體複合， 分散在包含脂質的溶液中，與脂質混合，與脂質聯合，作為懸浮液包含在脂質中，包含在膠 束中或與膠束複合，或以其他方式與脂質相關聯。與組成相關聯的脂質、脂質/DNA或脂質 /表達載體不限於溶液中的任何具體結構。例如，它們可存在於雙分子層結構中，作為膠束 或具有"坍縮的（collapsed)"結構。它們也可簡單地被散布在溶液中，可能形成大小或形 狀不均一的聚集體。脂質為脂肪物質，其可為天然發生或合成的脂質。例如，脂質包括脂 肪小滴，其天然發生在細胞質以及包含長鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺 類、氨基醇類和醛類的該類化合物中。
[0170] 適於使用的脂質可從商業來源中獲得。例如，二肉豆蘧醯磷脂醯膽鹼（"DMPC"）可 從Sigma, St. Louis, M0 中獲得；憐酸二嫁錯酯（"DCP"）可從K&K Laboratories (Plainview， NY)中獲得；膽固醇（"Choi"）可從Calbiochem-Beh環中獲得；二肉豆蘧醯磷脂醯甘油 ("DMPG"）和其他脂質可從 Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)中獲得。氯仿或 氯仿/甲醇中的脂質原液可被保存在大約_20°C下。氯仿用作唯一的溶劑，因為它比甲醇 更容易蒸發。"脂質體"為通用術語，其包括通過產生封閉的脂雙層或聚集體而形成的多種 單一和多層脂質工具。脂質體可以以具有含有磷脂雙層膜和內部水性介質的囊泡結構為特 徵。多層脂質體具有由水性介質分開的多個脂質層。當磷脂懸浮在過量的水性溶液中時， 它們自發形成。在形成封閉的結構和使水和溶解的溶質陷入脂雙層之間前，該脂質成分經 歷自身重排（Ghosh等，191Glycobiology5 :505-10)。然而，也包括與正常的囊泡結構相比 具有溶液中的不同結構的組合物。例如，脂質可呈現膠束結構或僅作為脂質分子的非均一 聚集體而存在。同樣考慮的是脂質轉染胺-核酸複合物。
[0171] 不管用於將外源核酸引入宿主細胞，或以其他方式將細胞暴露於本發明的抑制劑 的方法，為了證實在宿主細胞中存在重組DNA序列，可實施多種測定。這樣的測定包括例如 本領域技術人員公知的"分子生物學"測定，諸如DNA印跡法和RNA印跡法、RT-PCR和PCR ; "生物化學"測定，諸如例如通過免疫學手段（EL1SA和蛋白質印跡）或通過本文描述的鑑定 落入本發明範圍內的試劑的測定，檢測特定肽的存在或不存在。
[0172] RNA 轉染
[0173] 在一個實施方式中，本發明基因修飾的T細胞通過引入RNA被修飾。在一個實施 方式中，體外轉錄的RNA CAR可以瞬時轉染的形式被引入細胞。通過使用聚合酶鏈式反應 (PCR)-產生的模板的體外轉錄產生RNA。來自任何來源感興趣的DNA可直接通過使用適當 的引物和RNA聚合酶的PCR轉化成用於體外mRNA合成的模板。DNA的來源可以，例如，基因 組DNA、質粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他適當的DNA來源。用於體 外轉錄的期望的模板是本發明的CAR。例如，用於RNA CAR的模板包括細胞外結構域，其包 括抗腫瘤抗體的單鏈可變區；包括CD8a的鉸鏈和跨膜結構域的跨膜結構域；和包括CD3-4 的信號傳導結構域和IC0S的信號傳導結構域的細胞質結構域。
[0174] 在一個實施方式中，用於PCR的DNA包括可讀框。DNA可來自天然產生的DNA序 列，所述序列來自有機體基因組。在一個實施方式中，DNA為基因的一部分的全長感興趣基 因。基因可包括一些或全部的5'和/或3'非翻譯區（UTR)。基因可包括外顯子和內含子。 在一個實施方式中，用於PCR的DNA為人基因。在另一個實施方式中，用於PCR的DNA為包 括5'和3'UTR的人基因。DNA可可選地為通常不在天然產生的有機體中表達的人工DNA序 列。示例性人工DNA序列為包括連接（ligate)在一起以形成編碼融合蛋白的可讀框的基 因部分的序列。連接在一起的DNA的部分可來自單一有機體或來自多於一個有機體。
[0175] 可用作用於PCR的DNA的來源的基因包括編碼多肽的基因，其對有機體提供治療 性或預防效果或可用於診斷有機體的疾病或狀況。優選的基因為以下基因：其有助於短期 治療，或其中有關於劑量或所表達基因的安全性的關注。例如，對於治療癌症、自體免疫狀 況、寄生蟲的、病毒的、細菌的、真菌的或其他的感染，所表達的轉基因（一個或多個）可編 碼擔當用於免疫系統的細胞的配體或受體的多肽，或可起到刺激或抑制有機體免疫系統的 作用。在一些實施方式中，不期望具有持久持續的免疫系統的刺激，也不必產生在成功治療 後延續的變化，因為這可隨後引出新的問題。對於自體免疫狀況的治療，可期望驟然抑制或 壓制免疫系統，但不是長期的，其可導致患者變得對感染過度敏感。
[0176] PCR用於產生用於mRNA體外轉錄的模板，其用於轉染。用於進行PCR的方法是本 領域廣泛已知的。設計用於PCR的引物，以具有與用作用於PCR的模板的DNA的區基本上 互補的區。"基本上互補的"，如本文所用，指的是在核苷酸的序列中大多數或所有的引物序 列中的鹼基是互補的，或一個或多個鹼基是非互補的，或錯配的。基本上互補的序列能夠在 用於PCR的退火條件下，用預期的DNA靶標退火或雜交。引物可被設計以與DNA模板的任 何部分基本上互補。例如，可設計引物以擴增通常在細胞中轉錄的基因的部分（可讀框）， 包括5'和3'UTR。也可設計引物以擴增編碼特定感興趣結構域的基因的部分。在一個實施 方式中，設計引物以擴增包括全部或部分的5'和3'UTR的人cDNA的編碼區。可用於PCR 的引物通過本領域廣泛已知的合成方法產生。"正向引物"為包括與在位於要擴增的DNA序 列上遊的DNA模板上的核苷酸基本上互補的核苷酸的區域的引物。本文使用的"上遊"指 的是對於相對於編碼鏈擴增的DNA序列的位置5'。"反向引物"是包括與位於要擴增的DNA 序列下遊的雙鏈DNA模板基本上互補的核苷酸區域的引物。本文使用的"下遊"指的是對 於相對於編碼鏈擴增的DNA序列的位置3'。
[0177] 任何可用於PCR的DNA聚合酶可用於本文公開的方法。試劑和聚合酶從很多來源 商業可得。
[0178] 也可使用具有促進穩定性和/或翻譯效率的能力的化學結構。RNA優選具有5'和 3'UTR。在一個實施方式中，5'UTR的長度在0和3000個核苷酸之間。添加至編碼區的5' 和3'UTR序列的長度可通過不同的方法改變，包括但不限於，設計對UTR的不同區域退火的 PCR的引物。利用該方法，本領域技術人員可在轉錄RNA的轉染後修改實現最優翻譯效率所 需要的5'和3'UTR長度。
[0179] 5'和3'UTR可為針對感興趣基因的天然產生的、內源性5'和3'UTR。可選地，對 感興趣基因不是內源性的UTR序列可通過將UTR序列併入正向和反向引物或通過模板的任 何其他修飾添加。對感興趣基因不是內源性的UTR序列的使用可有助於修改RNA的穩定性 和/或翻譯效率。例如，已知3' UTR序列中AU-富集的元件可降低mRNA的穩定性。因此， 基於本領域廣泛已知的UTR性質，可選擇或設計3' UTR，以增加轉錄RNA的穩定性。
[0180] 在一個實施方式中，5'UTR可包括內源性基因的Kozak序列。可選地，當對感興趣 基因不是內源性的5'UTR如上述通過PCR添加時，共有Kozak序列可通過添加5'UTR序列 重新設計。Kozak序列可增加一些RNA轉錄物的翻譯效率，但似乎不是所有的RNA都需要以 實現有效的翻譯。對於很多mRNA的Kozak序列的要求是本領域已知的。在其他實施方式 中，5' UTR可源於RNA病毒，其RNA基因組在細胞中是穩定的。在其他實施方式中，不同的核 苷酸類似物可用於3'或5' UTR，以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
[0181] 為了能夠實現從DNA模板合成RNA，而不需要基因克隆，轉錄的啟動子應被附接至 轉錄的序列的DNA模板上遊。當擔當RNA聚合酶的啟動子的序列被添加至正向引物的5'末 端時，RNA聚合酶啟動子變為併入轉錄的可讀框的PCR產物上遊。在一個優選實施方式中， 啟動子為T7聚合酶啟動子，如本文其他地方描述的。其他有用的啟動子包括但不限於T3 和SP6RNA聚合酶啟動子。對於T7、T3和SP6啟動子的共有核苷酸序列是本領域已知的。
[0182] 在優選的實施方式中，mRNA具有5'末端上的帽和3'poly (A)尾兩者，其確定細胞 中的核糖體結合、翻譯開始和mRNA的穩定性。在環形DNA模板上，例如質粒DNA，RNA聚合 酶產生長的多聯產物，其不適於真核細胞中的表達。在3'UTR末端上線性化的質粒DNA的 轉錄產生正常尺寸的mRNA，其在真核轉染中不是有效的，即使它在轉錄後多聚腺苷酸化。
[0183] 在線性DNA模板上，噬菌體T7RNA聚合酶可延長轉錄物的3'末端超過模板的 最後喊基（Schenborn 和 Mierendorf，Nuc Acids Res.，13:6223-36(1985) ;Nacheva 和 Berzal-Herranz, Eur.J. Biochem. , 270:1485-65(2003))〇
[0184] polyA/T延伸進入DNA模板的整合的常規方法為分子克隆。然而整合入質粒DNA 的polyA/T序列可引起質粒不穩定性，這是為何從細菌細胞獲得的質粒DNA模板通常以缺 失和其他差錯被高度汙染。這使克隆程序不僅是費力和耗時的，而且經常是不可靠的。這 是為何允許用P〇lyA/T3' 一段序列而不是克隆的DNA模板的構建方法是高度期望的。
[0185] 轉錄的DNA模板的polyA/T片段可在PCR期間通過使用包括polyT尾諸如100T 尾（尺寸可為50-5000T)的反向引物，或在PCR後通過任何其他方法，包括但不限於DNA連 接或體外重組而產生。P 〇ly(A)尾也提供了對RNA的穩定性並減少了它們的降解。通常， poly (A)尾的長度與轉錄的RNA穩定性正相關。在一個實施方式中，poly (A)尾在100和 5000個腺苷之間。
[0186] RNA的Poly⑷尾可在通過使用poly⑷聚合酶諸如大腸桿菌polyA聚合酶 (E-PAP)的體外轉錄後進一步延長。在一個實施方式中，增加 poly (A)尾長度從100個核苷 酸至300和400個之間的核苷酸導致RNA的翻譯效率增加大約兩倍。另外，不同的化學基 團附接至3'末端可增加 mRNA穩定性。這樣的附接可包括修飾的/人工的核苷酸、適配體 和其他化合物。例如，ATP類似物可利用poly (A)聚合酶併入poly (A)尾。ATP類似物可進 一步增加 RNA的穩定性。
[0187] 5'帽也為RNA分子提供了穩定性。在優選的實施方式中，通過本文公開的方 法生產的RNA包括5'帽。5'帽利用本領域已知的並在本文中描述的技術提供（Cougot 等，Trends in Biochem.Sci·，29:436-444 (2001) ;St印inski 等，RNA, 7:1468-95 (2001); Elango 等，Biochim. Biophys. Res. Commun.，330:958-966 (2005))。
[0188] 通過本文公開的方法生產的RNA也可包括內部核糖體進入位點（IRES)序列。IRES 序列可為任何病毒的、染色體的或人工設計的序列，其起動結合至mRNA的不依賴帽的核糖 體，並便於翻譯的開始。可包括任何適於細胞電穿孔的溶質，所述溶質可包括促進細胞滲透 性和生存力的因素，諸如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑和表面活性劑。
[0189] RNA可利用很多不同方法中的任一種引入靶細胞，所述方法例如商業可得的方法， 其包括但不限於電穿孔（Amaxa Nucleofector_II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)) ，（ECM830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)或 Gene Pulser II (BioRad，Denve r, Colo.)，Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)，利用脂質轉染法的陽離子脂質體 介導的轉染、聚合物包封、肽介導的轉染或生物射彈粒子遞送系統諸如"基因槍"（見例如， Nishikawa 等，Hum Gene Ther·，12 (8) :861-70 (2001))。
[0190] 某閔修飾的T細朐
[0191] 在一些實施方式中，CAR序列利用反轉錄病毒或慢病毒載體傳遞入細胞。表達CAR 的反轉錄病毒和慢病毒載體可利用作為運載體的轉導的細胞或包封的、結合的或裸載體的 無細胞局部或全身傳遞，傳遞入不同類型的真核細胞以及傳遞入組織和整個有機體。所用 方法可用於其中穩定表達是需要的或充足的任何目的。
[0192] 在其他實施方式中，CAR序列利用體外轉錄的mRNA傳遞入細胞。體外轉錄的mRNA CAR可利用作為運載體的轉染的細胞或包封的、結合的或裸mRNA的無細胞局部或全身傳 遞，傳遞入不同類型的真核細胞以及傳遞入組織和整個有機體。所用方法可用於其中瞬時 表達是需要的或充足的任何目的。
[0193] 所公開的方法可在基礎研究和療法中，在癌症、幹細胞、急性和慢性感染以及自體 免疫疾病的領域中，調整T細胞活性，包括評估基因修飾的T細胞殺死靶癌症細胞的能力。
[0194] 該方法也提供了通過改變例如啟動子或輸入RNA的量，在寬範圍中控制表達水平 的能力，使其可能單獨調節表達水平。此外，基於PCR的mRNA產生的技術大大促進具有不 同結構和它們結構域的組合的嵌合受體mRNA的設計。例如，改變在相同細胞中的多嵌合受 體上的不同細胞內效應器/共刺激因子（costimulator)結構域允許確定受體組合的結構， 所述受體組合評估對抗多抗原靶標的最高水平的細胞毒性，同時對於正常細胞的最低細胞 毒性。
[0195] 本發明RNA轉染方法的一個優點是RNA轉染是基本上瞬時的和無載體的：RNA轉 基因可被傳遞至淋巴細胞並在簡短的體外細胞活化之後在其中表達，作為最小表達盒，而 不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉基因整合入宿主細胞基因組是不可能的。細 胞的克隆是不必要的，因為RNA的轉染效率和它均勻修飾整個淋巴細胞群的能力。
[0196] T細胞通過體外轉錄的RNA(IVT-RNA)的基因修飾利用兩種不同的策略，其兩者已 經在不同的動物模型中成功測試。細胞通過脂質轉染法或電穿孔，利用體外轉錄的RNA進 行轉染。優選地，期望利用不同的修飾使IVT-RNA穩定，以便實現轉移的IVT-RNA的持久表 達。
[0197] 一些IVT載體在文獻中已知，其以標準化的方式用作體外轉錄的模板，並且其已 經以產生穩定化的RNA轉錄物的方式進行基因修飾。目前用於本領域的方案基於具有以下 結構的質粒載體：能夠實現RNA轉錄的5'RNA聚合酶啟動子，隨後是通過未翻譯區（UTR)位 於3'和/或5'的側翼的感興趣基因，和包括50-70A核苷酸的3'多聚腺苷酸盒。在體外轉 錄前，環形質粒通過II型限制酶在多聚腺苷酸盒下遊線性化（識別序列對應於切割位點）。 多腺苷酸盒因此對應於轉錄物中後面的P〇ly(A)序列。作為該程序的結果，一些核苷酸作 為酶切割位點的部分在線性化後保持，並延長或掩蓋3'末端上的poly(A)序列。不清楚該 非生理學懸突（overhang)是否影響從這樣的構建體細胞內產生的蛋白質的量。
[0198] RNA具有超過更多傳統質粒或病毒方法的數個優點。來自RNA來源的基因表達不 需要轉錄，並且蛋白質產物在轉染後快速產生。進一步地，因為RNA不得不僅獲得接近細胞 質而不是細胞核的機會，並且因此通常的轉染方法導致極高的轉染率。另外，基於質粒的方 法要求驅動感興趣基因表達的啟動子在研究的細胞中是活性的。
[0199] 在另一方面，RNA構建體可通過電穿孔傳遞入細胞。見例如，核酸構建體進入 哺乳動物細胞的電穿孔的製劑和方法，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1 中教導的。包括任何已知 細胞類型的電穿孔需要的電場強度的各種參數通常在有關研究文獻以及本領域很多專 利和申請中已知。見例如美國專利號6, 678, 556、美國專利號7, 171，264和美國專利號 7, 173, 116。用於電穿孔的治療性應用的裝置是商業可得的，例如，MedPulser?DNA電穿孔 療法系統（Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.)，並且在諸如美國專利號 6, 567, 694 ; 美國專利號6, 516, 223、美國專利號5, 993, 434、美國專利號6, 181，964、美國專利號 6, 241，701和美國專利號6, 233, 482的專利中描述；電穿孔也可用於體外轉染細胞，如例如 US20070128708A1中描述的。電穿孔也可用於體外傳遞核酸進入細胞。因此，利用本領域技 術人員已知的很多可用的設備和電穿孔系統中的任一個進入包括表達構建體的核酸的細 胞的電穿孔介導的給藥呈現了令人興奮的傳遞感興趣RNA至靶細胞的新方法。
[0200] T細朐的來源
[0201] 擴張之前，從受試者獲得T細胞的來源。對象的例子包括人、狗、貓、小鼠、大鼠和 其轉基因物種。優選地，對象是人。T細胞可獲得自許多來源，包括外周血單核細胞、骨髓、 淋巴結組織、脾組織和腫瘤。在本發明的某些實施方式中，可使用本領域可用的任何數量的 T細胞系。在本發明的某些實施方式中，T細胞可獲得自使用技術人員已知的任何數量的 技術，比如ficoll分離從受試者收集的單位血液。在一種優選的實施方式中，通過單採血液 成分術或白細胞採集獲得來自個體的循環血液的細胞。單採血液成分術產物典型地含有淋 巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞，其他成核白細胞、紅細胞和血小板。在一個 實施方式中，可清洗通過單採血液成分術收集的細胞，以移除血漿部分並將細胞放置在適 當的緩衝液或培養基中，用於隨後的處理步驟。在本發明的一個實施方式中，細胞用磷酸鹽 緩衝鹽水（PBS)清洗。在可選實施方式中，清洗溶液缺少鈣並可缺少鎂或可缺少很多-- 如果不是全部--二價陽離子。衝洗之後，細胞可重新懸浮在各種生物相容性緩衝液中，t匕 如，例如，無 Ca、無 Mg PBS。可選地，可移除單採血液成分術樣本的不期望成分和細胞直接 重新懸浮在培養基中。
[0202] 在另一實施方式中，通過溶解紅細胞和耗減單核細胞從外周血分離T細胞，例如， 通過利用PERC0LL?梯度的離心。可選地，T細胞可分離自臍帶。在任何情況下，特定的T 細胞亞群可通過陽性或陰性選擇技術被進一步分離。
[0203] 通過陰性選擇的T細胞群的富集可利用涉及對陰性選擇的細胞獨特的表面標記 的抗體的組合完成。優選的方法為細胞分選和/或選擇，其經陰性磁性免疫粘附或使用針 對存在於陰性選擇的細胞上的細胞表面標記的單克隆抗體的混合物的流式細胞術進行。例 如，為了通過陰性選擇富集⑶4+細胞，單克隆抗體混合物通常包括對⑶14、⑶20、⑶lib、 CD16、HLA-DR 和 CD8 的抗體。
[0204] 對於通過陽性或陰性選擇分離期望的細胞群，可改變細胞和表面（例如，顆粒諸 如珠）的濃度。在某些實施方式中，可期望顯著減少其中珠和細胞被混合在一起的體積 (即，增加細胞濃度），以確保細胞和珠的最大接觸。例如，在一個實施方式中，使用20億細 胞/ml的濃度。在一個實施方式中，使用10億細胞/ml的濃度。在進一步的實施方式中，使 用多於1億細胞/ml。在進一步的實施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50X10 6 細胞/ml的細胞濃度。還在另一個實施方式中，使用75、80、85、90、95或100父106細胞>1 的細胞濃度。在進一步的實施方式中，可使用125或150X 106細胞/ml的濃度。使用高濃 度可產生增加的細胞產量、細胞活化和細胞擴張。
[0205] 在相關的實施方式中，可期望使用更低濃度的細胞。通過顯著稀釋T細胞和表面 (例如，顆粒諸如珠）的混合物，顆粒和細胞之間的相互作用被最小化。這選擇表達高數量 的結合至顆粒的期望抗原的細胞。例如，在稀濃度，CD4+T細胞比CD8+T細胞表達更高水平 的⑶28並更有效地被捕獲。
[0206] 用於刺激的T細胞可也在衝洗步驟之後冷凍，其不需要單核細胞移除步驟。儘管 不希望被理論限制，通過去除細胞群體中的粒細胞和以一些程度去除單核細胞，冷凍和隨 後的解凍步驟提供了更均一的產物。在移除血漿和血小板的衝洗步驟之後，細胞可懸浮在 冷凍液中。儘管許多冷凍液和參數是本領域已知的並且將用於該背景下，但是在非限制性 例子中，一種方法包括使用含有20 % DMS0和8 %人血清白蛋白的PBS，或其他適當的細胞 冷凍媒介。然後細胞以每分鐘Γ的速度被冷凍至_80°C並且存儲在液氮儲罐的蒸汽相中。 可使用受控冷凍的其他方法以及在_20°C下或液氮中不受控的即刻冷凍。
[0207] Thl7/Tcl7 細朐
[0208] 在一個實施方式中，本發明涉及基因修飾的Thl7細胞。已經被修飾以表達本發明 的CAR的Thl7細胞被朝著特異性抗原（例如間皮蛋白）改變，並且因此可用於治療與特異 性抗原相關的癌症。本發明是基於令人吃驚的發現，CAR的細胞質結構域中併入IC0S信號 傳導結構域增加 Thl7持久性、增加 IL-17產生、增加抗腫瘤活性和減少IL-2產生。
[0209] T輔助細胞（也稱為效應子T細胞或Th細胞）是淋巴細胞的亞組（一類白血細胞 或白細胞），其在建立和最大化免疫系統的能力和尤其激活和引導其他免疫細胞方面具有 重要的作用。不同的類型的Th細胞已經認識為啟動分化過程結果並且與特定表型相關。T 細胞發育之後，成熟的、幼稚（意思是它們從未暴露於它們可應答的抗原）的T細胞離開胸 腺並且開始遍布身體分布。幼稚T細胞已知分化成T-輔助1 (Thl)、T-輔助2 (Th2)、T-輔 助17(Thl7)或調節T細胞（Treg)表型。
[0210] 這些Th細胞類型的每個分泌細胞因子、蛋白質或肽，其刺激或與其他白細胞，包 括Th細胞相互作用。但是，每個細胞類型具有特殊的表型和活性幹擾並且通常與其他的衝 關。
[0211] Thl、Th2和Thl7(炎症T-輔助或炎症Th)，通過分泌促炎症細胞因子，比如IL-1、 IL-6、TNF-a、IL-17、IL21、IL23,和/或通過活化和/或抑制其他T細胞包括其他Th細胞 (例如Thl細胞抑制Th2和Thl7, Th2抑制Thl和Thl7)促進炎症應答。相反，Tregs是免 疫系統的組分，其抑制與免疫應答相關的其他細胞的生物活性。尤其，Tregs可分泌免疫抑 制細胞因子TGF-β和白細胞介素10,並且已知能夠限制或抑制炎症。
[0212] Thl7細胞或展示Thl7細胞表型的其他細胞可具有各種特異的表型性質，這取決 於使用的條件。此類表型性質包括產生IL-17A和IFNY。而且，在它們初級擴張之後，擴張 的Thl7細胞繼續產生IL-17A和IFN γ事件。在一些情況下，Thl7細胞共表達R0R γ t和 T-bet，轉錄因子，其分別調節Thl7和Thl細胞發育。在一些情況下，擴張的T細胞在它們 的細胞表面上共表達IL-23R和⑶161，與臍帶Thl7細胞相關的表型標記。在一些情況下， Thl7細胞表達RORyt。
[0213] 在一個實施方式中，本發明提供純化的IC0S+⑶28+臍帶血液Thl7前體細胞群體， 其當被刺激時分泌升高水平的CCL20、IL-17F和IFN γ。本發明的細胞可用於臨床應用，用 於設計用於具有癌症、傳染病和自身免疫性的患者的免疫療法。
[0214] Thl7細朐的活化和擴張
[0215] 不論在T細胞基因修飾以表達期望的CAR之前或之後，T細胞都可通常使用以 下所述的方法活化和擴張：例如美國專利6, 352, 694 ;6, 534, 055 ;6, 905, 680 ;6, 692, 964 ; 5, 858, 358 ；6, 887, 466 ；6, 905, 681 ；7, 144, 575 ；7, 067, 318 ；7, 172, 869 ；7, 232, 566 ； 7, 175, 843 ;5, 883, 223 ;6, 905, 874 ;6, 797, 514 ;6, 867, 041 ;和美國專利申請公布號 20060121005。
[0216] 通常地，本發明的T細胞通過與表面的接觸進行擴張，所述表面具有附著於其的 刺激CD3/TCR複合物相關信號的試劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配體。特別地， T細胞群可如本文所述的諸如通過與固定在表面上的抗CD3抗體或其抗原-結合片段或抗 ⑶2抗體接觸，或通過和與鈣離子載體組合的蛋白激酶C激活劑（例如，苔蘚抑制素）接 觸進行刺激。對於T細胞表面上的輔助分子的共刺激，使用結合輔助分子的配體。例如， T細胞群可在適於刺激T細胞增殖的條件下與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。為了刺激 Thl7細胞的增殖，細胞可接觸抗⑶3抗體和抗ICOS抗體。Thl7細胞可也被表達ICOS配 體（IC0SL)的人工抗原呈遞細胞（aAPC)刺激。刺激可在存在Thl7-極化細胞因子的情況 下進行。Thl7-極化細胞因子的例子包括但不限於IL-6、IL-1 β和IL-23細胞因子和中和 IFNy和IL-4抗體。
[0217] Τ細胞可通過使試劑與Τ細胞上的細胞表面部分接觸刺激。在本發明的一個方面 中，針對⑶3和IC0S的抗體被負載至aAPC。此外，刺激可包括結合TCR/⑶3複合物和啟動 初級刺激信號的任何配體。該配體可用作負載到aAPC上或由aAPC表達的初級活化試劑。 結合IC0S和啟動IC0S信號轉導通路，因此造成細胞與CD3配體的共刺激和增強T細胞的 群體活化的任何配體是IC0S配體和因此是共刺激試劑。
[0218] T細胞可暴露於下述珠，其包括結合TCR/CD3複合物和啟動初級刺激信號的第一 試劑和結合IC0S和啟動IC0S信號轉導通路的第二試劑，因此造成細胞與⑶3配體的共刺 激和增強T細胞群體的活化。
[0219] 刺激的細胞被活化，如由信號轉導的引導、細胞表面標記的表達和/或增殖所顯 示。適於Thl7細胞的標記包括但不限於它們分泌升高水平的IL-17A、IL-17F和CCL20的 能力。而且，與CD28共刺激的細胞相比，按照IC0S共刺激方法產生和擴張的細胞擴張不僅 僅展示提高的Thl7相關細胞因子的產生，而且也展示升高的IFN γ、TNF α和IL-21分泌。
[0220] 在通過刺激Τ細胞上的IC0S產生Thl7細胞的背景下，aAPC可被工程化以包括結 合T細胞的TCR/⑶3複合物的第一試劑和結合IC0S的第二試劑，aAPC可進一步被工程化， 以包括促進Thl7分化的細胞因子。示例性Thl7分化細胞因子包括但不限於IL-2、IL-6、 IL-23 和 IL-1。
[0221] 因此，T細胞刺激可包括aAPC，其已經被基因修飾以表達刺激試劑、共刺激試劑 和/或細胞因子以及其他多肽。aAPC可使用本文公開的方法或本領域用於基因修飾細胞 的已知的方法被工程化，以表達和分泌任何期望的細胞因子，促進Thl7分化。細胞因子可 以是細胞因子的全長、片段、同源物、變體或突變體。細胞因子包括能夠影響另一細胞的生 物學功能的蛋白質。受細胞因子影響的生物學功能可包括但不限於細胞生長，細胞分化 或細胞死亡。在刺激Thl7細胞的刺激時，細胞因子可結合細胞表面上的特異性受體，從 而促進Thl7分化。優選的細胞因子包括造血生長因子、白細胞介素、幹擾素、免疫球蛋白 超家族分子、腫瘤壞死因子家族分子和/或趨化因子等等。細胞因子包括但不限於粒細 胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、腫瘤壞死因子a (TNFa)、腫瘤壞死因子β (TNFi3)、 巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)、白細胞介素-1 (IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞 介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-IO(IL-IO)、 白細胞介素-12(IL-12)、白細胞介素-15(IL-15)、白細胞介素-21(IL-21)、白細胞介 素-23(IL_23)、幹擾素 a (IFNa)、幹擾素 β (IFNi3)、幹擾素 γ (IFNY)和IGIF等等。更 優選的細胞因子包括促進Thl7分化的細胞因子，其包括但不限於IL-2、IL-6、IL-1 (例如， IL-1 β )。一旦具備本文提供的教導，本領域技術人員將認識到，本發明包括任何Thl7分化 促進細胞因子，比如本領域已知的那些，以及將來任何公開的那些。
[0222] 除了工程化aAPC以包括Thl7分化促進細胞因子，aAPC可被工程化以包括可阻礙 幹擾Thl7分化過程的細胞因子的抑制分子。例如，aAPC可被工程化，以分泌中和抗體，其 可抑制幹擾Thl7分化的細胞因子。幹擾Thl7分化過程的細胞因子包括但不限於IFNY和 IL-4〇
[0223] 當aAPC已經被工程化以表達促進Thl7分化的期望的細胞因子和/或幹擾Thl7 分化的細胞因子的抑制劑時，提供了激活和/或刺激T細胞的群體，以促進Thl7在沒有外 源性添加的細胞因子的情況下分化的方法。此外，這種Thl7分化可發生在體內。
[0224] 在某些實施方式中，T細胞的初級刺激信號和共刺激信號可通過不同的方案提供。 例如，提供每個信號的試劑可在溶液中或連接至表面。當連接至表面時，試劑可被連接至同 一表面（即，以"cis"形式）或分開的表面（S卩，以"trans"形式）。可選地，一種試劑可被 連接至表面和另一種試劑處於溶液中。在一個實施方式中，提供共刺激信號的試劑被結合 至細胞表面，並且提供初級活化信號的試劑在溶液中或被連接至表面。在一些實施方式中， 兩種試劑可都在溶液中。在另一個實施方式中，試劑可處於可溶形式，隨後被交聯至表面， 諸如表達Fc受體或抗體的細胞或將結合該試劑的其他結合劑。在這點上，見例如用於人造 抗原呈遞細胞（aAPC)的美國專利申請公布號20040101519和20060034810,其被考慮用於 活化和擴張本發明的T細胞。
[0225] 在一個實施方式中，兩種試劑被固定在珠上，在同一珠即"cis"上或分開的珠即 "trans"上。作為例子，提供初級活化信號的試劑為抗CD3抗體或其抗原-結合片段，和提 供共刺激信號的試劑為抗IC0S抗體或其抗原-結合片段；並且兩種試劑都以相等的分子 數量被共固定至同一珠。在一個實施方式中，使用結合至用於Thl7細胞生長的珠的每種抗 體的1:1比率。在本發明的某些方面中，使用結合至珠的抗⑶3:IC0S抗體的比率，以便與 利用1:1比率觀察到的擴張相比，觀察到Thl7細胞擴張的增加。在一個實施方式中，結合 至珠的⑶3: IC0S抗體的比率處於100:1至1:100的範圍中和其間的所有整數值。在本發 明的一個方面中，比抗⑶3抗體更多的抗IC0S抗體被結合至顆粒，即⑶3: IC0S的比率小於 1。在本發明的某些實施方式中，結合至珠的抗IC0S抗體與抗⑶3抗體的比率大於2:1。在 一個具體的實施方式中，使用結合至珠的抗體的1:100的⑶3: IC0S比率。在另一個實施方 式中，使用結合至珠的抗體的1:75的⑶3: IC0S比率。在進一步的實施方式中，使用結合至 珠的抗體的1:50的⑶3: IC0S比率。在另一個實施方式中，使用結合至珠的抗體的1:30的 ⑶3: IC0S比率。在一個優選實施方式中，使用結合至珠的抗體的1:10的⑶3: IC0S比率。 在另一個實施方式中，使用結合至珠的抗體的1:3的CD3:IC0S比率。還在另一個實施方式 中，使用結合至珠的抗體的3:1的⑶3: IC0S比率。
[0226] 從1:500至500:1和其間任何整數值的顆粒與細胞的比率可用於刺激T細胞或其 他靶細胞。因為在本領域技術人員可容易地領會到，顆粒與細胞的比率可取決於相對於靶 細胞的顆粒大小。例如，小尺寸的珠僅可結合一些細胞，而較大的珠能結合很多。在某些實 施方式中，細胞與顆粒的比率在從1:100至100:1的範圍內和其間任何整數值，和在進一步 的實施方式中，該比率包括1:9至9:1和其間任何整數值，也可用於刺激T細胞。抗⑶3-和 抗IC0S-結合的顆粒與產生T細胞刺激的T細胞的比率可如以上記錄的變化，然而某些優 選的值包括 1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、 2 :1、3:1、4:1、5:1、6:1、7 :1、8:1、9:1、10:1 和 15:1，一個優選的比率為至少 1:1 顆粒每個 T 細胞。在一個實施方式中，使用1:1或更小的顆粒與細胞的比率。在一個具體的實施方式 中，優選的顆粒：細胞比率為1:5。在進一步的實施方式中，顆粒與細胞的比率可根據刺激 天數而改變。例如，在一個實施方式中，顆粒與細胞的比率在第一天為從1:1至10:1，和額 外的顆粒此後每天或每隔一天直至10天，以從1:1至1:10的最終比率（基於添加日的細 胞計數）被添加至細胞。在一個具體的實施方式中，顆粒與細胞的比率在刺激的第一天為 1:1並在刺激的第三和第五天被調節至1:5。在另一個實施方式中，顆粒在每天或每隔一天 的基礎上添加，以在第一天最終比率為1:1，並在刺激的第三和第五天最終比率為1:5。在 另一個實施方式中，顆粒與細胞的比率在刺激的第一天為2:1並在刺激的第三和第五天被 調節至1:10。在另一個實施方式中，顆粒在每天或每隔一天的基礎上添加，以在第一天最終 比率為1:1，和在刺激的第三和第五天最終比率為1:10。本領域技術人員將理解多種其他 比率可適於用於本發明。特別地，比率將根據顆粒大小和細胞大小和類型而變化。
[0227] 在本發明的進一步的實施方式中，細胞諸如T細胞，與包被試劑的珠組合，隨後分 離該珠和細胞，並且隨後培養該細胞。在一個可選實施方式中，在培養前，不分離包被試劑 的珠和細胞，而是在一起進行培養。在進一步的實施方式中，珠和細胞首先通過施加力諸如 磁力被聚集，產生增加的細胞表面標記的連接作用，由此誘導細胞刺激。
[0228] 作為例子，可通過允許附接抗⑶3和抗ISC0的順磁珠接觸T細胞，來連接細胞表 面蛋白。在一個實施方式中，細胞（例如，1〇 4至1〇9個T細胞）和珠（例如，以1:1比率的 順磁珠）在緩衝液優選PBS (沒有二價陽離子諸如，鈣和鎂）中進行聯合。此外，本領域技術 人員可容易理解可使用任何細胞濃度。例如，靶細胞可在樣本中非常稀少並僅佔〇. 01%的 樣本，或整個樣本（即，100% )可包括感興趣的靶細胞。因此，任何細胞數量都在本發明的 內容內。在某些實施方式中，可期望顯著降低其中顆粒和細胞混合在一起的體積（即，增加 細胞濃度），以確保細胞和顆粒的最大接觸。例如，在一個實施方式中，使用大約20億細胞 /ml的濃度，在另一個實施方式中，使用多於1億細胞/ml。在進一步的實施方式中，使用細 胞濃度10、15、20、25、30、35、40、45或50X 106細胞/ml。還在另一個實施方式中，使用細胞 濃度75、80、85、90、95或100\10 6細胞/1111，在進一步的實施方式中，可使用125或150\106 細胞/ml的濃度。利用高濃度可產生增加的細胞產量、細胞活化和細胞擴張。進一步地，使 用高細胞濃度允許更有效地捕獲可微弱表達感興趣的靶抗原的細胞，諸如CD28-陰性T細 胞。這樣的細胞群可具有治療價值並將在某些實施方式中期望獲得。例如，利用高濃度的 細胞允許更有效選擇正常具有更弱CD28表達的CD8+T細胞。
[0229] 在本發明的一個實施方式中，混合物可被培養數個小時（大約3個小時）至大約 14天或其間任何個小時的整數值。在另一個實施方式中，混合物可被培養21天。在本發明 的一個實施方式中，珠和T細胞在一起培養大約八天。在另一個實施方式中，珠和T細胞在 一起培養2-3天。也可期望數個周期的刺激，以便T細胞的培養時間可為60天或更多天。 適於T細胞培養的條件包括適當的培養基（例如，最小必需培養基或RPM1培養基1640或 X-viv〇15,（Lonza))，其可包含增殖和存活必需的因子，包括血清（例如，胎牛或人血清）、 白細胞介素-2 (IL-2)、胰島素、IFN- γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp 和 TNF-α或技術人員已知的用於細胞生長的任何其他添加劑。用於細胞生長的其他添加劑 包括但不限於表面活性劑、人血漿蛋白粉（plasmanate)和還原劑諸如N-乙醯基-半胱氨 酸和 2-巰基乙醇。培養基可包括 RPMI1640、AM-V、DMEM、MEM、a -MEM、F-12、X-Vivol5 和 X-Vivo20、優選的（Optimizer)，具有添加的胺基酸、丙酮酸鈉和維生素、無血清或補充適當 量的血清（或血漿）或限定的激素組，和/或足夠T細胞的生長和擴張量的細胞因子（一 個或多個）。抗生素，例如青黴素和鏈黴素，僅被包括在實驗培養物中，而不包括在注入對象 的細胞培養物中。靶細胞被保持在支持生長必需的條件下，例如，適當的溫度（例如，37°C ) 和氣氛（例如，空氣加5% C02)。
[0230] 已經暴露於變化刺激時間的T細胞可顯示不同的特性。例如，典型的血液或單採 的（apheresed)外周血單核細胞產物具有比細胞毒性或抑制T細胞群（Tc，CD8+)更多的輔 助T細胞群（Th，⑶4+)。因此，取決於治療目的，用主要包括Th細胞的T細胞群注入對象可 為有利的。類似地，如果已經分離了 Tc細胞的抗原-特異性亞型，則它可有益於以更大的 程度擴張該亞型。
[0231] 進一步地，除了⑶4和⑶8標記，其他表型標記在細胞擴張過程的進程期間，也顯 著地但以大部分可重複地變化。因此，這種重複性使針對具體目的調節活化的T細胞產物 的能力能夠實現。
[0232] 本領域技術人員容易認識到本文所述的細胞刺激方法可在各種環境（即，容器） 中進行。例如，此類容器可以是培養瓶、培養袋，或能夠容納細胞的任何容器，優選地在無菌 環境中。在本發明的一個實施方式中，生物反應器也是可用的。例如，當前數個製造商製造 了可用於生長細胞的設備並且用於與本發明的方法一起使用。見例如，覆蓋生物反應器的 專利比如美國專利號6, 096, 532 ;5, 985, 653 ;5, 888, 807 ;5, 190, 878,其每一篇通過引用以 其整體併入本文。
[0233] 治療件應用
[0234] 本發明包括被修飾以表達CAR的細胞（例如，Thl7細胞），該CAR將特異性抗體的 抗原識別結構域與⑶3-ζ、⑶28、4_1BB、IC0S或任何其組合的細胞內結構域聯合。因此，在 一些例子中，轉導的Thl7細胞可引起CAR-介導的T-細胞應答。
[0235] 本發明提供了 CAR改變初級T細胞對腫瘤抗原的特異性的用途。因此，本發明也 提供了刺激對哺乳動物的靶細胞群或組織的T細胞-介導的免疫應答的方法，其包括以下 步驟：施用給哺乳動物表達CAR的T細胞，其中CAR包括特異性地與預定標靶相互作用的結 合部分，包括例如人CD3(的細胞內結構域的ζ鏈部分，和共刺激信號傳導區。
[0236] 在一個實施方式中，本發明包括一類細胞療法，其中Τ細胞被基因修飾以表達CAR 並且CAR T細胞被注入至需要其的受試者中。注入的細胞能夠殺死受試者中的腫瘤細胞。 不像抗體療法，CAR T細胞能夠在體內複製，產生可導致持續的腫瘤控制的長期持久性。
[0237] 在一個實施方式中，本發明的CAR T細胞可經歷穩固的體內T細胞擴張並可持續 延長的時間量。在另一個實施方式中，本發明的CAR T細胞發展成可被重新活化以抑制任 何額外腫瘤形式或生長的特異性記憶T細胞。例如，料想不到的是在由基因修飾的Thl7細 胞中表達的CAR中包括IC0S信號傳導結構域導致增加 Thl7持久性和增加抗腫瘤活性。不 希望被任何具體理論限制，在遇到並隨後消除表達替代抗原的靶細胞後，CAR T細胞可體內 分化成中心記憶樣狀態。
[0238] 不希望被任何具體理論限制，由CAR-修飾T細胞引起的抗腫瘤免疫性應答可以 是主動或被動免疫應答。另外，CAR介導的免疫應答可以是過繼免疫療法的一部分，其中 CAR-修飾T細胞誘導特異性針對CAR中抗原結合結構域的免疫應答。例如，表達抗間皮蛋 白CAR的基因修飾的Thl7細胞引起特異性針對表達間皮蛋白的細胞的免疫應答。
[0239] 儘管本文公開的數據具體公開了慢病毒載體包括SSlscFv、人⑶8 α鉸鏈、IC0S跨 膜結構域、和IC0S和CD3 ζ信號傳導結構域，本發明應解釋為包括對構建體組成部分中的 每一個的任何數量的變化，如本文其他地方所述的。即，本發明包括CAR中任何抗原結合結 構域產生特異性針對抗原結合結構域的CAR-介導的T-細胞應答的用途。例如，本發明CAR 的抗原結合結構域可靶向腫瘤抗原，用於治療癌症的目的。
[0240] 可治療的癌症包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤，以及血管化的 腫瘤。癌症可包括非實體瘤（諸如血液學腫瘤，例如白血病和淋巴瘤）或可包括實體瘤。用 本發明的CAR治療的癌症類型包括但不限於癌、胚細胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴惡 性腫瘤、良性和惡性腫瘤、和惡性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人腫瘤/癌症和兒童 腫瘤/癌症。
[0241] 血液學癌症為血液或骨髓的癌症。血液學（或血原性）癌症的例子包括白血病， 包括急性白血病（諸如急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性骨髓性白血病和成 髓細胞性、早幼粒細胞性、粒-單核細胞性、單核細胞性和紅白血病）、慢性白血病（諸如慢 性髓細胞（粒細胞性）白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細胞白血病）、真性紅細胞增 多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤（無痛和高等級形式）、多發性骨髓瘤、瓦 爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、重鏈疾病、骨髓增生異常症候群、多毛細胞白血病和脊髓發育 不良。
[0242] 實體瘤為通常不包含囊腫或液體區的組織的異常腫塊。實體瘤可為良性或惡性 的。不同類型的實體瘤以形成它們的細胞類型命名（諸如肉瘤、癌和淋巴瘤）。實體瘤諸 如肉瘤和癌的例子包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜 瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、 肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、 乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞 癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、 黑素瘤和CNS腫瘤（諸如神經膠質瘤（諸如腦幹神經膠質瘤和混合神經膠質瘤）、成膠質 細胞瘤（也已知為多形性成膠質細胞瘤）星形細胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖細胞瘤、成神經管 細胞瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質 瘤、腦膜瘤、神經細胞瘤、視網膜母細胞瘤和腦轉移）。
[0243] 在一個實施方式中，本發明CAR的抗原結合部分部分被設計為治療具體的癌症。 例如，設計為靶向CD19的CAR可用於治療癌症和病症，包括但不限於前-BALL (兒童指徵）、 成人ALL、套細胞淋巴瘤、擴散大B-細胞淋巴瘤，同種骨髓移植後的補救等等。
[0244] 在另一實施方式中，CAR可設計為靶向⑶22,以治療擴散大B-細胞淋巴瘤。
[0245] 在一個實施方式中，癌症和病症包括但不限於前-B ALL(兒童指徵）、成人ALL、 套細胞淋巴瘤、擴散大B-細胞淋巴瘤，同種骨髓移植後的補救等等可使用靶向CD19、CD20、 ⑶22和R0R1的CAR的組合治療。
[0246] 在一個實施方式中，CAR可設計為靶向間皮蛋白，以治療間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等 等。在另一實施方式中，CAR可設計為靶向CD33/IL3Ra，以治療急性骨髓性白血病等等。在 進一步的實施方式中，CAR可設計為靶向c-Met，以治療三陰性乳腺癌、非小細胞肺癌等等。
[0247] 在一個實施方式中，CAR可設計為靶向PSMA，以治療前列腺癌等等。在另一實施方 式中，CAR可設計為靶向糖脂F77,以治療前列腺癌等等。在進一步的實施方式中，CAR可設 計為靶向EGFRvIII，以治療膠質母細胞瘤等等。
[0248] 在一個實施方式中，CAR可設計為靶向⑶-2,以治療成神經細胞瘤，黑素瘤等等。 在另一實施方式中，CAR可設計為靶向NY-ES0-1TCR，以治療骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。在 進一步的實施方式中，CAR可設計為靶向MAGE A3TCR，以治療骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。
[0249] 然而，本發明不應被解釋為僅限於本文公開的抗原標靶和疾病。相反地，本發明應 被解釋為包括任何與可使用CAR治療的疾病相關的抗原標靶。
[0250] 本發明的CAR-修飾T細胞也可用作對哺乳動物離體免疫和/或體內療法的疫苗 類型。優選地，哺乳動物為人。
[0251] 對於離體免疫，以下中的至少一項在將細胞施用進入哺乳動物前在體外發生：i) 擴張細胞，ii)將編碼CAR的核酸引入細胞，和/或iii)冷凍保存細胞。
[0252] 離體程序在本領域中是公知的，並在以下更完全地進行討論。簡單地說，細胞從哺 乳動物（優選人）中分離並用表達本文公開的CAR的載體進行基因修飾（即，體外轉導或 轉染）。CAR-修飾的細胞可被施用給哺乳動物接受者，以提供治療益處。哺乳動物接受者 可為人，和CAR-修飾的細胞可相對於接受者為自體的。可選地，細胞可相對於接受者為同 種異基因的、同基因的（syngeneic)或異種的。
[0253] 在此通過引用併入的在美國專利號5, 199, 942中描述的造血幹細胞和祖細胞的 離體擴張程序，可被應用至本發明的細胞。其他合適的方法在本領域中是已知的，因此本 發明不限於細胞離體擴張的任何具體方法。簡單地說，T細胞的離體培養和擴張包括：（1) 從外周血收穫物或骨髓外植體收集來自哺乳動物的CD34+造血幹細胞和祖細胞；和（2)離 體擴張這樣的細胞。除了美國專利號5, 199, 942中描述的細胞生長因子，其他因子諸如 flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配體，也可用於培養和擴張細胞。
[0254] 除了就離體免疫而言使用基於細胞的疫苗之外，本發明也提供了體內免疫以引起 針對患者中抗原的免疫應答的組合物和方法。
[0255] 通常地，如本文所述活化和擴張的細胞可用於治療和預防無免疫應答的個體中產 生的疾病。特別地，本發明的CAR-修飾的T細胞用於治療癌症。在某些實施方式中，本發 明的細胞用於治療處於形成癌症風險中的患者。因此，本發明提供了治療或預防癌症的方 法，其包括施用給需要其的對象治療有效量的本發明的CAR-修飾的T細胞。
[0256] 本發明的CAR-修飾的T細胞可被單獨施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與 其他組分諸如IL-2或其他細胞因子或細胞群結合施用。簡單地說，本發明的藥物組合物可 包括如本文所述的靶細胞群，與一種或多種藥學或生理學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑 結合。這樣的組合物可包括緩衝液諸如中性緩衝鹽水、硫酸鹽緩衝鹽水等等；碳水化合物諸 如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸諸如甘氨酸；抗氧化劑； 螯合劑諸如EDTA或穀胱甘肽；佐劑（例如，氫氧化鋁）；和防腐劑。本發明的組合物優選配 制用於靜脈內施用。
[0257] 本發明的藥物組合物可以以適於待治療（或預防）的疾病的方式施用。施用的數 量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的狀況、和患者疾病的類型和嚴重度--儘管適當 的劑量可由臨床試驗確定。
[0258] 當指出"免疫學上有效量"、"抗腫瘤有效量"、"腫瘤-抑制有效量"或"治療量"時， 待施用的本發明組合物的精確量可由醫師確定，其考慮患者（對象）的年齡、重量、腫瘤大 小、感染或轉移程度和狀況的個體差異。可通常指出：包括本文描述的T細胞的藥物組合物 可以以104至109個細胞/kg體重的劑量，優選105至10 6個細胞/kg體重的劑量--包括 那些範圍內的所有整數值--施用。T細胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細胞可通 過使用免疫療法中公知的注入技術（見例如Rosenberg等，New Eng. J. of Med. 319:1676， 1988)施用。對於具體患者的最佳劑量和治療方案可通過監測患者的疾病跡象並因此調節 治療由醫學領域技術人員容易地確定。
[0259] 在某些實施方式中，可期望向對象施用活化的T細胞，並隨後重新抽取（redraw) 血液（或實施單採血液成分術），根據本發明活化來自其中的T細胞，和用這些活化和擴張 的T細胞再注入該患者。該過程可每幾個周進行多次。在某些實施方式中，T細胞可從10cc 至400cc的血液抽取中進行活化。在一些實施方式中，T細胞從20cc、30cc、40cc、50cc、 60cc、70cc、80cc、90cc或lOOcc的血液抽取中進行活化。不被理論所束縛，利用多份血液抽 取/多個再輸注方案可用於選出某些T細胞群。
[0260] 對象組合物的施用可以以任何方便的方式進行，包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸 液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內、瘤內、結內、脊髓內、肌肉內、通過靜脈 內（i.v.)注射或腹膜內施用給患者。在一個實施方式中，本發明的T細胞組合物通過皮內 或皮下注射被施用給患者。在另一個實施方式中，本發明的T細胞組合物優選通過i.v.注 射施用。T細胞的組合物可被直接注入腫瘤、淋巴結或感染位置。
[0261] 在本發明的某些實施方式中，利用本文描述的方法或本領域已知的其他將T細胞 擴張至治療性水平的方法活化和擴張的細胞，與任何數量的有關治療形式結合（例如，之 前、同時或之後）施用給患者，所述治療形式包括但不限於用試劑進行治療，諸如抗病毒療 法、西多福韋和白細胞介素-2、阿糖胞苷（也已知為ARA-C)或對MS患者的那他珠單抗治療 或對牛皮癬患者的厄法珠單抗治療或對PML患者的其他治療。在進一步的實施方式中，本 發明的T細胞可與以下結合使用：化療、輻射、免疫抑制劑，諸如，環孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨 喋呤、麥考酚酯和FK506,抗體或其他免疫燒蝕劑諸如CAM PATH、抗-CD3抗體或其他抗體療 法、細胞毒素、氟達拉濱、環孢菌素、FK506、雷帕黴素、麥考酚酸、類固醇類、FR901228、細胞 因子和照射。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶--I丐調磷酸酶（環孢菌素和FK506)或抑制對 生長因子誘導的信號傳導重要的P70S6激酶（雷帕黴素）（Liu等，Cell66:807-815, 1991 ; Henderson 等，Tmmun. 73:316-321, 1991 ;Bierer 等，Curr. Opin, Tmmun. 5:763-773, 1993) 〇 在進一步的實施方式中，本發明的細胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達拉濱、外部 光束放射療法（XRT)、環磷醯胺或抗體諸如0KT3或CAMPATH的T細胞燒蝕療法結合（例如， 之前、同時或之後）而施用給患者。在另一個實施方式中，本發明的細胞組合物在B-細胞 燒蝕療法諸如與CD20反應的試劑例如Rituxan後進行施用。例如，在一個實施方式中，對 象可經歷高劑量化療，之後進行外周血幹細胞移植的標準治療。在一些實施方式中，在移植 後，對象接受本發明的擴張的免疫細胞的注入。在一個額外的實施方式中，擴張的細胞在外 科手術前或外科手術後施用。
[0262] 施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療狀況的精確屬性和治療的接受者而變 化。人施用的劑量比例可根據本領域接受的實踐實施。例如，CAMPATH的劑量對於成人患 者將通常在1至大約l〇〇mg的範圍中，通常每天施用，持續1和30天之間的時期。儘管在 一些例子中可使用上至40mg每天的較大劑量（美國專利號6, 120, 766中描述），但優選的 日劑量為1至l〇mg每天。
[0263] 實驗實施例
[0264] 本發明通過參考以下實驗實施例進一步詳細地進行描述。這些實施例僅出於說明 性的目的提供，並不意欲為限制性的，除非另有規定。因此，本發明決不應被解釋為限於以 下實施例，而是應被解釋為包括由於本文提供的教導變得顯而易見的任何和全部的變化。
[0265] 沒有進一步的描述，相信利用先前的描述和以下的說明性實施例，本領域技術人 員可製造和利用本發明的化合物，並實踐請求保護的方法。以下工作實施例因此具體指出 本發明的優選實施方式，並不解釋為以任何方式限制本公開背景的剩餘部分。
[0266] 實施例1 :用含有IC0S共刺激結構域的CAR的Thl7細朐的改奪增強Thl7細朐的 功能、抗腫瘤活件和持久件。
[0267] 體外極化和擴張的大量Thl7細胞的過繼轉移是有吸引力的用於治療癌症的療 法。⑶278,可誘導的共刺激分子（IC0S)已經顯示為對於人Thl7細胞在它們初級活化之後 的持續的擴張是關鍵的。分析無論在嵌合抗原受體中是否併入IC0S細胞內結構域都可促 進抗原觸發之後的Thl7表型並且增強抗工程化的T細胞療法的抗腫瘤活性。
[0268] 現在描述在這些實驗中採用的物質和方法。
[0269] Thl7和Tcl7細朐的分離、極化、轉導和擴張
[0270] 從賓夕法尼亞大學的人免疫學中心獲得血液樣品。使用RosetteSep Kits (幹細 胞技術）陰性分離外周血⑶4+和⑶8+T細胞。在37°C和5% C02的培養箱中，在補充10% FCS、100-U/ml青黴素、100μ g/ml硫酸鏈黴素、10mM ifepes的RPMI1640培養基中培養細 胞。為了刺激，用以1:3的細胞與珠的比例包被針對⑶3和IC0S抗體的激活珠，培養⑶4+ 和 CD8+T 細胞。為了 Thl7 和 Tcl7 極化，在第 0 天添加 IL-lb(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、 IL-23(20ng/ml)，和針對 IL-4 和 IFN-γ 的中和抗體（10mg/ml) (eBioscience)並且在整 個實驗中保持。所有實驗用含有內源TGF-b來源的胎牛血清進行。在活化後第3天添加人 IL-2 (Chiron)至50IU/ml的終濃度。在活化之後約24h，以5的Μ0Ι用慢病毒載體轉導T 細胞。細胞計數和每2天進料並且一旦T細胞好像靜止，如通過減少的生長動力學和細胞 尺寸二者確定，它們用於功能試驗或冷凍保存。
[0271] T細朐增葙試駘
[0272] 用SS1融合蛋白轉導的冷凍保存的T細胞被解凍，衝洗，並且放置培養12h。T細 胞（4X10 5)與2X105K562.meso共培養。在指示的時間點，通過苔酚藍排斥對有活力的細 胞計數。細胞每2天用具有外源性細胞因子的新鮮培養基進料。
[0273] 再刺激的T細朐的細朐閔子產牛和細朐內染色
[0274] 用SS1融合蛋白轉導的冷凍保存的T細胞被解凍，衝洗，並且放置培養16h。然後， 在T細胞中檢查SSlscFv融合蛋白的表達並且歸一化為對於所有的受體的60 %嵌合受體表 達。T細胞（4X105)然後與2父1051(562、1(562.11168〇、或腫瘤細胞共培養並且2411後收穫上 清液。使用 DuoSel? ELISA 開發系統測定 IL-17A、IL17-F、IL-2、IFN- γ、TNF- α 和 CCL20 的濃度。使用人IL-21ELISA Ready-SET-Go ! Set測定IL-21的濃度。
[0275] 抗體
[0276] 下列綴合的抗體購買自 BD Biosciences :抗 CD8 (FICT)、抗 CD4 (PerCp_Cy5. 5)、抗 CCR7(PE)。抗CD45R0(Alexa Fluor647)購買自 Biolegend。抗CD27(V450)和抗CD4(APC-H7) 購買自BD Bioscience。抗⑶161PE購買自R&D。山羊抗小鼠 IgG血清的生物素化的 F(ab'）2片段（特異性針對鼠源的scFv)購買自Jackson ImmunoResearch。鏈黴抗生物素 (eFluor710)購買自 eBioscience，和鏈黴抗生物素（V450)購買自 BD Biosciences。
[0277] 流式細朐術某試駘以量化細朐-介導的細朐溶解
[0278] 靶細胞（L55)用CFSE染色並且以50, 000個細胞/孔種在96孔平板中。冷凍保存 的用SS1融合蛋白轉導的T細胞被解凍，衝洗，並且放置培養16h。然後，效應子和CFSE-標 記的靶細胞以一定的E:T範圍雙份共培養。培養物在37°C在5% C02下溫育4h。然後通過 胰酶消化和衝洗收集總的細胞。然後用抗CD45抗體染色T細胞30分鐘。衝洗之後，DNA嵌 入染料7AAD被添加至樣品，以區分死的和活的細胞事件。最後，衝洗細胞並且重新懸浮在 0. 4ml的1% HuSA PBS中和對珠計數。染色之後，樣品放置在冰上並且立即在LSRII Flow 細胞計數器上收集數據。每個樣品收集4000個珠子。
[0279] 流式細朐術分析
[0280] 為了評估表面表達，細胞在指示的時間點染色。各種SSlscFv融合蛋白在T細胞 上的表達使用生物素化的山羊抗小鼠 IgG檢測隨後用鏈黴抗生物素（V450)或鏈黴抗生物 素（eFluor710)染色。在LSRII流式細胞計數器使用DiVa軟體（BD Biosciences)分析樣 品，並且使用Flowjo軟體（TreeStar)評估結果。
[0281]
[0282] 賓夕法尼亞大學協會動物護理和使用委員會批准了所有動物實驗。NSG小鼠購買 自Jackson實驗室並且在賓夕法尼亞大學的飼養室飼養。小鼠圈養在微型隔離籠中的無病 原體條件下並且給予自由採食高壓滅菌的食物和酸化的水的自由。
[0283] 抗間皮蛋白CAR T細朐的體內評估
[0284] 在存在PBS中50 % Matrigel溶液（BD Biosciences)的情況下皮下注射 5X 106M108細胞建立異種移植腫瘤。允許M108腫瘤在NSG小鼠中生長8周。
[0285] 為了評估改變的Thl7_Tcl7的瘤內效果，用在61和67天2個瘤內注射10X106T 細胞（Thl7:Tcl7以1:1比例）或PBS治療小鼠。
[0286] 用測徑器測量腫瘤維度，和使用公式V = 1/2XLXWXW計算腫瘤體積，其中L是 長度（最長維度）和W是寬度（最短維度）。在治療之後的第21和51天分別從眼球後出 血或心臟內穿刺獲得外周血，和染色用於人⑶45、⑶4和⑶8T細胞的存在。在對人⑶45+群 體設門之後，使用 TruCount tubes (BD Biosciences)量化 CD4+和 CD8+子集。
[0287] 樣品收集
[0288] 來自三個不同的正常供體和用SSl-28z、SSl-BBz和SSl-ICOSz改變的Thl7細胞 被解凍和在補充10% FCS的RMPI1640培養基中培養過夜。然後，改變的Thl7細胞用源自 固定的酵母的重組體間皮蛋白刺激。在刺激之前的第〇天，和抗原識別後的4h、8h、24h和 4天收集細胞小球並且冷凍。
[0289] 微陣列靶制各和雜奪
[0290] 通過UPenn微陣列設施提供微陣列服務，包括通過Agilent Bioanalyzer和 Nanodrop分光光度法的總RNA樣品的質量對照測試。如在AfTymetrix GeneChip表達分 析技術手冊中描述進行所有的方案。簡單地說，l〇〇ng的總RNA使用併入T7啟動子序列的 poly(T)和隨機低聚物啟動的逆轉錄酶轉化成第一鏈cDNA。使用用於每個轉錄體的線性擴 增的T7RNA聚合酶體外轉錄之後是第二鏈cDNA合成，並且所得cRNA轉化成cDNA，片段化， 由Bioanalyzer評估，並且通過末端轉移酶末端標記生物素化。cRNA產量範圍從36-89ug， 並且cDNA添加至Affymetrix雜交混合物，在99°C下加熱5min並且在45°C下與人基因 LOST GeneChips(Affymetrix Inc. , Santa Clara CA)雜交 16h。然後在低（6X SSPE)和 高（100mM MES，0. 1M NaCl)嚴格性下衝洗微陣列並且用鏈黴抗生物素-藻紅蛋白染色。通 過添加生物素化的抗鏈黴抗生物素和另外的等分試樣的鏈黴抗生物素藻紅蛋白染色擴增 螢光。在570nm激發之後共焦掃描儀用於收集螢光信號。
[0291] 數據分析
[0292] Affymetrix命令控制臺和表達控制臺用於量化祀向基因的表達水平； Affymetrix提供的默認值用於所有分析參數。移除邊界像素，並且對每個探針計算75%內 的平均強度像素。將出現在每個16微陣列區域的平均最低2%的探針強度設置為背景並 且減去該區域的所有特徵。在表達控制臺中檢測陽性和陰性對照的探針組，並且設施質量 控制參數被確認落入正常範圍。平均每個靶向基因的探針並且使用RMA算法進行陣間歸一 化。
[0293] 現在描述實驗的結果。
[0294] 結果
[0295] Thl7極化的細胞被工程化以表達單鏈可變片段，其結合與⑶28、⑶137 (41BB) 或CD278(IC0S)細胞內結構域串聯的融合至T細胞受體-ζ信號轉導結構域的間皮蛋白 (SS1)。含有SSl-ICOS-z CAR的cDNA序列被克隆進入第三代慢病毒載體並且在EF-1啟動 子的控制下表達。SSl-ICOS-z含有⑶8前導序列、識別人間皮蛋白的SS1單鏈片段、⑶8 α 鏈的鉸鏈區、IC0S跨膜和細胞內結構域、和TCR-z信號轉導結構域。（圖1)。
[0296] 序列標示符
[0297]
【權利要求】
1. 編碼嵌合抗原受體（CAR)的分離的核酸序列，其中所述CAR包括抗原結合結構域、跨 膜結構域和ICOS細胞內信號傳導結構域。
2. 權利要求1所述的分離的核酸序列，進一步包括CD3(信號傳導結構域。
3. 權利要求1所述的分離的核酸序列，包括SEQ ID N0:8的核酸序列。
4. 權利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述抗原結合結構域是抗體或其抗原結合 片段。
5. 權利要求4所述的分離的核酸序列，其中所述抗原結合片段是Fab或scFv。
6. 權利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述抗原結合結構域結合腫瘤抗原。
7. 權利要求1所述的分離的核酸序列，進一步包括包含共刺激分子的細胞內結構域的 共刺激信號傳導區，所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、淋巴 細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合⑶83的配體，和 其任意組合。
8. 權利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述IC0S細胞內信號傳導結構域由SEQ ID NO:6的核酸序列編碼。
9. 權利要求2所述的分離的核酸序列，其中所述CD3 4信號傳導結構域由SEQ ID N0:7 的核酸序列編碼。
10. 細胞，其包括編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中所述CAR包括抗原結合結 構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域。
11. 權利要求10所述的細胞，其中所述CAR進一步包括⑶3ζ信號傳導結構域。
12. 權利要求10所述的細胞，其中所述核酸序列包括SEQ ID Ν0:8的核酸序列。
13. 權利要求10所述的細胞，其中所述抗原結合結構域是抗體或其抗原結合片段。
14. 權利要求13所述的細胞，其中所述抗原結合片段是Fab或scFv。
15. 權利要求10所述的細胞，其中所述抗原結合結構域結合腫瘤抗原。
16. 權利要求10所述的細胞，其中所述CAR進一步包括包含共刺激分子的細胞內結構 域的共刺激信號傳導區，所述共刺激分子選自⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、⑶30、⑶40、ro-1、 淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合⑶83的配 體，和其任意組合。
17. 權利要求10所述的細胞，其中所述IC0S細胞內信號傳導結構域由SEQ ID N0:6的 核酸序列編碼。
18. 權利要求11所述的細胞，其中所述⑶3 ζ信號傳導結構域由SEQ ID N0:7的核酸 序列編碼。
19. 權利要求10所述的細胞，其中所述細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
20. 權利要求10所述的細胞，其中當所述抗原結合結構域結合其相應的抗原時，所述 細胞展示抗腫瘤免疫性。
21. 用於哺乳動物中刺激T細胞介導的對靶細胞群體或組織的免疫應答的方法，所述 方法包括向哺乳動物施用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗原結 合結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域。
22. 權利要求21所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結構域。
23. 哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量 的基因修飾以表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域和ICOS細 胞內信號傳導結構域，從而在所述哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性。
24. 權利要求23所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結構域。
25. 治療具有與升高的腫瘤抗原表達相關的疾病、病症或狀況的哺乳動物的方法，所述 方法包括向所述哺乳動物施用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗 原結合結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域，從而治療所述哺乳動物。
26. 權利要求25所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結構域。
27. 權利要求25所述的方法，其中所述細胞選自自體Thl7細胞和自體Tcl7細胞。
28. 治療具有癌症的人的方法，所述方法包括向所述人施用基因改造的表達CAR的細 胞，其中所述CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域和IC0S細胞內信號傳導結構域，其中所 述細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
29. 權利要求28所述的方法，其中所述CAR進一步包括CD3 ζ信號傳導結構域。
30. 權利要求28所述的方法，其中所述人抵抗至少一種化療劑。
31. 在診斷有癌症的人中產生基因改造的Τ細胞的持續性群體的方法，所述方法包括 向所述人施用基因改造的表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域 和IC0S細胞內信號傳導結構域，其中所述基因改造的細胞的持續性群體在施用之後在所 述人中持續至少一個月，並且其中所述細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
32. 權利要求31所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結構域。
33. 權利要求31所述的方法，其中所述基因改造的Τ細胞的持續性群體包括選自下述 的至少一種細胞：施用至所述人的細胞、施用至所述人的細胞的子代，和其組合。
34. 權利要求31所述的方法，其中所述基因改造的Τ細胞的持續性群體包括記憶Τ細 胞。
35. 權利要求31所述的方法，其中所述基因改造的Τ細胞的持續性群體在施用之後在 所述人中持續至少三個月。
36. 權利要求31所述的方法，其中所述基因改造的Τ細胞的持續性群體在施用之後 在所述人中持續至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、 十二個月、兩年或三年。
37. 權利要求31所述的方法，其中所述癌症被治療。
38. 在診斷有癌症的人中擴張基因改造的Τ細胞群體的方法，所述方法包括向所述人 施用基因改造的表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域和IC0S 細胞內信號傳導結構域，其中所述施用的基因改造的細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞，進一 步其中所述施用的基因改造的細胞在所述人中產生子代T細胞的群體。
39. 權利要求38所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結構域。
40. 權利要求38所述的方法，其中所述人中的所述子代Τ細胞包括記憶Τ細胞。
41. 權利要求38所述的方法，其中所述細胞是自體細胞。
42. 權利要求38所述的方法，其中所述子代Τ細胞的所述群體在施用之後在所述人中 持續至少三個月。
43. 權利要求38所述的方法，其中所述子代Τ細胞的所述群體在施用之後在所述人中 持續至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、i^一個月、十二個月、兩 年或三年。
44.權利要求38所述的方法，其中所述癌症被治療。
【文檔編號】C07K14/705GK104159917SQ201380010754
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年2月22日 優先權日:2012年2月22日
【發明者】C·H·瓊, S·格丹卡裡奧, Y·趙, J·朔勒 申請人:賓夕法尼亞大學董事會