雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體及其應用的製作方法

2023-12-09 06:38:26 2

雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於分子生物學領域，本發明涉及一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，以及其在介導對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環斑病毒（ORSV）的抗性中的應用。本發明的雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，其序列如SeqIDNo：1所示。本發明應用於通過基因轉化技術選育雙抗兩種病毒的蝴蝶蘭新品種，可有效的防治蝴蝶蘭生產上的建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒，產生巨大的經濟效益。
【專利說明】雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學領域，本發明涉及一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，以及其在介導對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環斑病毒(ORSV)的抗性中的應用。
【背景技術】
[0002]蝴蝶蘭(Phalaenopsis ssp.)為蘭科蝴蝶蘭屬花丼，於1750年最早被發現,迄今已發現七十多個原生種，在中國臺灣和泰國、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞等地均有分布。蝴蝶蘭因其花形優美，顏色華麗，為熱帶蘭中的珍品，有「蘭中皇后」之美譽，再加上耐貯運、宜於室內擺放、經濟效益高等優點成為花卉業的新寵，蝴蝶蘭盆花已成為全球重要的農業產業。近幾年我國蝴蝶蘭生產發展迅速，1997年大陸蝴蝶蘭生產企業屈指可數，年上市量僅有20萬株左右，而到2003年蝴蝶蘭上市量超過1，000萬株，產值達5億元，2010年，我國蝴蝶蘭年宵花上市量已達到2，610萬株。
[0003]隨著我國蝴蝶蘭的大規模種植，病害也日趨嚴重。蝴蝶蘭病毒病是蝴蝶蘭上的一類重要病害，由於蝴蝶蘭大多在生產上依靠組織培養進行無性繁殖，病毒在營養器官中不斷積累，同時病毒還會通過組織培養和溫室內植株管理造成的傷口進行傳播，使蝴蝶蘭病毒防治困難，嚴重影響蝴蝶蘭的生長和觀賞品質，並且歐美等國家對蝴蝶蘭病毒檢疫非常嚴格，帶有病毒病的出口蝴蝶蘭種苗和成品給我國出口企業造成巨大損失。目前生產上還沒有有效的藥物進行防治蝴蝶蘭病毒病，只能通過淘汰病株和莖尖培養脫毒進行防治，但莖尖脫毒技術操作難度大，耗費大量的人力物力，脫毒效果有時並不理想，並且在擴繁和栽培過程中還會感染病毒，因此利用基因工程等技術選育蝴蝶蘭抗病品種成為生產上的迫切需要。
[0004]目前，世界上已報導的蘭花病毒有:建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒、建蘭輕性花葉病毒、建蘭環斑病毒、番茄環斑病毒、萬代蘭花葉病毒、石斛蘭花葉病毒、洋蘭斑點病毒和黃瓜花葉病毒等10來種病毒，其中以建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)和齒蘭環斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)發生最為普遍。建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒是侵染蝴蝶蘭的兩種主要病毒病原。
[0005]CymMV 隸屬線形病毒科、馬鈴薯X病毒屬，線狀粒子長475nm~490nm、直徑13nm。ORSV隸屬菸草花葉病毒屬，杆狀粒子長300nm、直徑18nm。兩種病毒可單獨侵染或複合侵染蘭科植物，引起花葉、壞死、葉脈褪綠、條斑等症狀，複合侵染時可導致植株矮化，葉片畸形等重症，造成蝴蝶蘭、石槲蘭、大花惠蘭、文心蘭等多種熱帶蘭及國蘭產生嚴重病害，大大降低蘭花的商品價值。我國報導蘭花病毒始於1983年朱本明等從上海的蘭花上分離到兩種病毒，鑑定為建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒。沈淑琳(1990)對這兩種病毒的生物、生化特性進一步系統研究，證實是我國蘭花上最主要的病毒。
[0006]蝴蝶蘭病毒主要通過介體或汁液傳播。介體是重要的傳播途徑，可通過蚜蟲、線蟲、蟎類等進行傳播。汁液傳播是通過葉片的相互摩擦，或人的組織培養和田間作業，使健康葉片造成微傷，導致病毒傳播。通過上述兩種途徑使蝴蝶蘭感染病毒，並通過組培擴繁傳至下一無性世代，從而在蝴蝶蘭營養體中長期積累，導致產量和品質下降。
[0007]RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是最近幾年發展起來的一門新興的在轉錄水平上的基因阻斷技術。是一種雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平上關閉相應序列基因的表達或使其沉默的過程，也就是序列特異性的轉錄後基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。不同的有機體,包括植物、果蜆、線蟲及一些哺乳動物大多能利用RNA幹擾機制來抵禦病毒及其他外來核酸的侵人。提示它可能是生物體的一種進化保守機制。同時也可能成為特異性沉默內源基因和基因功能分析的一個革命性工具。
[0008]根據一些實驗結果推測RNAi發生的主要過程大致分為三個階段:(I)起始階段，dsRNA在細胞內被Rnase III (如Dicer)均勻切割成21_25nt大小的siRNA。dsRNA可以是外源的(如病毒RNA複製中間體或是人工導入的dsRNA)，也可以是內源的(如細胞中單鏈RNA在RNA依賴RNA聚合酶(RdRP)的作用下形成的dsRNA)。siRNA的長短是種族特異的，5』端是磷酸化的，3』端往往突出2個nts。(2)擴增階段，siRNA與mRNA靶向性結合，並作為引物，在RdRP作用下再次形 成dsRNA，dsRNA又被切割成siRNA，新形成的siRNA又可以進入下一輪循環而達到擴增的目的。(3)效應階段，SiNRA和內切核酸以及其他蛋白一切形成RISC(RNA induced silencing complex)。RISC的核酸部分起到革巴向性的作用，蛋白部分則起到降解mRNA的作用。RNAi的生物學意義就在於它起到了監視和抑制異常的或外源的遺傳物質在細胞的存在，維持本身遺傳物質的穩定性。
[0009]將病毒的某一序列設計成雙鏈結構導進植物體使之表達，可誘發RNA沉默強化植物體內自然的RNA沉默抗病毒能力，這使得高抗病毒性的轉基因植物的獲得成為可能。Waterhouse等利用馬鈴薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片斷構建IRS載體進行菸草轉化，獲得抗性植株。Wang等利用含有大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)PAV株系的複製酶基因片斷構建成可產生髮夾式RNA結構的載體，並將該載體導進大麥得到強抗性植株並得到穩定遺傳。Kalantids等在轉黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic virus, CMV) cDNA反向重複序列的再生菸草植株中檢測到一個完全抗性的株系，並且證實菸草病毒抗性直接與siRNA的產生相關。同時接種病毒的轉化植物體表現出敏感型、恢復型(表現症狀但新長出的葉片無症狀)、完全抗性3種表型。其中的敏感型儘管對病毒敏感，但症狀要比對照輕得多。這三種表型除了說明RNA沉默信號在植物體內可以擴散產生系統性沉默外，還說明利用RNA沉默手段獲得的抗性植株的抗性強度大小並不完全一致。
[0010]在RNA沉默抗病毒的方法研究上，Tenllado等觀察了以直接注射和農桿菌介導轉化兩種方式將病毒dsRNA導進植物葉片細胞後的結果發現，兩種方式都成功阻止了菸草蝕刻病毒(Tobacco etch virus, TEV)、辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)和苜猜花葉病毒(Alfalfamosaic virus, AMV)的侵染過程。同時他們還將用於直接注射的dsRNA進行稀釋處理發現dsRNA誘導的植物病毒抗性是dsRNA劑量依靠的，這與在動物上得出的結論一致。而Pandolfini等的實驗結果表明，即使導進菸草的李痘病毒(Plumpoxvirus, PPV)基因組片斷含有可剪切的內含子序列，在轉化體中也可以檢測到轉化片斷siRNA的存在，並表現出對PPV侵染的系統抗性。
【發明內容】

[0011]本發明所要解決的技術問題是，提供一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，使該載體通過農桿菌侵染轉化蝴蝶蘭後，可同時幹擾建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒外殼蛋白基因表達，可同時產生對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環斑病毒(ORSV)的抗性。
[0012]本發明的雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，其序列如Seq IDNo:1所示。
[0013]所述RNAi載體的構建過程是:分別選取建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒外殼蛋白基因(CP)中的保守序列(Seq ID No:2、Seq ID No:3);將兩部分嵌合併構建反向重複序列(Seq ID No:4)，插入到內含子兩端，克隆到雙元植物表達載體pCAMBIA1301_220中，得到RNAi植物雙元表達載體pRNA1-CP。
[0014]本發明構建的利用雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，選取建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒外殼蛋白基因(CP)中的保守序列，利用hpRNA沉默策略不僅可以獲得較高抗性的轉基因植株，而且由於不表達病毒蛋白，能減少人們對攜帶病毒基因的轉基因作物安全性的顧慮，使種質創新目的性更強也更加安全有效；在高保守區段設計靶序列，並且只需20bp的同源序列就能引起病毒沉默，能避免病毒因非保守區的高突變率而產生的耐抗性突變株；同時還可以將建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒外殼蛋白基因序列串聯起來而獲得對建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒兩個病毒的廣譜抗性。本發明應用於通過基因轉化技術選育雙抗兩種病毒的蝴蝶蘭新品種，可有效的防治蝴蝶蘭生產上的建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒，產生巨大的經濟效益。
【具體實施方式】
[0015]本發明實施例如下:
[0016]1、構建建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒外殼蛋白基因融合片段
[0017]分別根據NCBI資料庫中建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒外殼蛋白基因設計引物(表 I),擴增長度為 238bp 和 380bp，分別利用引物 CyMVCP-SacIF/CyMVCP-R 和 0RSVCP-F/ORSVCP-KpnR,以含有建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的cDNA為模板，進行PCR擴增反應，擴增採用 50 μ L 體系:模板 2.5μ L,引物各 2.5μ L (10ymol/L), dNTP Mixture4.0 μ L (各
2.5mmol/L), 10 XPCR Buffer (Mg2+plus) 5.0 μ L, TaqE0.5 μ L, 33 μ L 滅菌超純水補齊。擴增程序為:94°C預變性5min ;(94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸lmin) 35個循環；72°C後延伸lOmin。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用回收純化試劑盒進行純化去除引物及引物二聚體，回收目標條帶。
[0018]利用融合PCR技術連接兩個病毒外殼蛋白基因序列，在引物CyMVCP-Sac IF和ORSVCP-KpnR作用下，以回收後的產物為模板，進行PCR融合。融合採用50 μ L體系:模板各 2.5 μ L，引物各 2.5 yL (10ymol/L), dNTP Mixture4.0 μ L (各 2.5mmol/L)，10XPCRBuffer (Mg2+plus) 5.0 μ L, TaqE0.5 μ L, 30.5 μ L滅菌超純水補齊。融合條件同以上PCR擴增程序。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用回收純化試劑盒進行純化去除引物及引物二聚體，回收618bp的目標條帶。[0019]表1PCR擴增所用弓丨物序列
[0020]
【權利要求】
1.一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，其序列如Seq ID No:1所示。
2.根據權利要求1所述的雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，其特徵是:所述RNAi載體的構建過程是，分別選取建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒外殼蛋白基因中的保守序列Seq ID No:2、Seq ID No:3 ;將兩部分嵌合併構建反向重複序列Seq ID No -A,插入到內含子兩端，克隆到雙元植物表達載體PCAMBIA1301-220中，得到RNAi植物雙元表達載體pRNA1-CP。
3.權利要求1所述雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體用於防治蝴蝶蘭生產上的建 蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒。
【文檔編號】A01H5/00GK103993033SQ201410049351
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年2月12日 優先權日:2014年2月12日
【發明者】言燕華, 王廣東, 張昌偉, 韋武青, 馬志虎 申請人:鎮江市蔬菜研究所