增強胰島素活性的組合物與方法
2023-12-10 03:48:01 3
專利名稱：增強胰島素活性的組合物與方法
技術領域：
本發明涉及一種增強胰島素活性的方法。本發明通過使用一種組合物來舉例說明，所述的組合物包括一種來源於何首烏、蘑菇科真菌和／或樟屬植物的水提取物的物質。
背景糖尿病是一個嚴重的公眾健康的問題。在美國，有大約800至1000萬人患有糖尿病。糖尿病是由於相對地或絕對地缺乏胰島素而引起的一個症候群。在臨床上，糖尿病的特徵是具有症狀的葡萄糖不耐受性和脂質及蛋白質代謝的改變。通過幾種激素，最突出的是胰島素的作用，還有胰高血糖素、腎上腺素、皮質類固醇以及生長激素的作用而使血糖得以保持正常的水平。低血糖症的特徵是，血液中葡萄糖的水平低於正常值。另一方面，高血糖的特徵則是血液中葡萄糖的濃度高於正常水平。胰腺產生胰島素，當血液中葡萄糖濃度增高時便釋放胰島素。胰島素的功能是通過剌激細胞對葡萄糖的攝取而使血液中葡萄糖的水平降低。葡萄糖被用於細胞的代謝以產生能量，或被轉變成糖原而儲存於肝臟和肌肉中，或者被用於產生甘油三酯及脂肪。
高血糖症會使糖尿病的所有普通的晚期併發症的危險性增大；而這些併發症則是導致糖尿病患者發病率和死亡率過高的主要原因。然而，迄今尚沒有使糖尿病患者的血糖濃度在一個正常範圍內波動的可以廣泛應用而且持續有效的手段，而為了達到這個目的所進行的嘗試卻有導致頻發性低血糖症或嚴重的低血糖症發作的重大危險。不過，普通的治療包括膳食控制、使用胰島素製劑和口服降血糖藥物。
對於糖尿病的常規治療包括口服降血糖藥物。歷史上所使用過的兩類口服降血糖藥是雙胍類藥和磺醯脲類藥。然而，雙胍類藥目前在美國已不再被批准用於治療糖尿病了。低血糖症是磺醯脲類治療時所引起的最重要的併發症，可以很嚴重並可於停止治療之後仍持續存在數日或者復發。據報導，磺醯脲所引起的低血糖症，在住院治療的患者中死亡率為43％。使用胰島素治療糖尿病的通常做法是每天注射1或2次中效(intermediate-acting)的胰島素，在所使用的同一注射器內加有或不加有較小劑量的速效(rapid-acting)胰島素。胰島素治療所引起的併發症發包括嚴重的低血糖症，局部過敏反應，全身性的胰島素過敏反應，免疫性的耐胰島素以及局部的脂肪細胞萎縮或肥大。
一個已公開的治療高血糖症的組合物(美國專利USPN5，331，991號)由葡萄糖凝膠(Ssphadex)G-25柱所分離到的經0．1N氫氧化銨(鹼)所提取的何首烏(Polyonummultiflorum)的提取物構成。何首烏也被稱作中國芥麥蔓(ChineseCornbind)。何首烏的天然分布地為中國西南部、日本和臺灣。據報導，它能有效地抗高血壓和動脈及靜脈的硬化(《中國草藥》Chinese Herbal Medicine，McClellan Maitland編輯，(1990)，第150頁)。使用鹼提取物的缺點包括，在製造過程裡處理用的鹼是危險的，應當儘可能地避免。此外，從原材料中同時也提取出了一些附加的酸性組分。這些酸性組分增加了提取物中的雜質含量，而且如不進一步使之改變則對人或動物都是毫無用途的。
考慮到使用胰島素製劑和磺醯脲類藥物來控制血液中葡萄糖濃度的複雜性，因而就需要有治療高血糖症的新方法和和新的組合物，來控制與不能耐受葡萄糖相關的高血糖水平。新組合物理想上應易於製備並相對便宜。
有關的文獻長期以來，中國草藥用於治療許多疾病。關於對中國草藥的當今描述及其傳統的用途，可在Lu，Henry C所編著的《傳奇式的有治癒作用的中國草藥(Legendary Chinese Healing Herbs)》(1991)和Reid，Daniel P，著《中國草藥(Chinese Herbal Medicine)》，(1990)中讀到。
USPN 5，531，991號揭示了一種組合物，它由Sephadex G-25柱、從何首烏經0．1N NH4OH而提取出來的一個成分構成，該專利也揭示了使用這一組合物治療高血糖症的方法。Cheng等報導(FASEB J，2A1103 1988)，經0．1N NH4OH(1∶20稀釋度)提取的何首烏在小鼠中既具有增強胰島素和降低血膽固醇的作用。這兩篇文獻都揭示了何首烏的鹼提取物，而不是水提取物。Kanh等(BiolTrace Element Res，24183，1990)報導，樟樹屬植物的香料用0．1N NH4OH(1∶20，W／V)提取的上清液中含有增強胰島素的物質。
美國專利5，607，679號揭示了治療與角質化細胞增生有關的皮膚病的方法，即給予患者一有效劑量的雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)的植物血凝素。
美國專利5，639，470號揭示了使動物除臭的方法，包括製備一種除臭劑組合物，即用一種親水溶劑通過提取雙孢蘑菇來獲得一種能除去動物臭味的提取物使這種提取物與一種適當的載體接觸；設法讓該動物食入所述的提取物和所述的適當載體。這兩篇參考文獻都沒有提到胰島素增強活性。
美國專利第5，175，156號揭示了利用主要由三吡啶甲酸鉻(chromiumtripicolinate)構成的組合物治療人體血清中令人不快的高脂質水平。
Striffer等(代謝(Metabolism)，44，13141320，1995)報導，補充鉻能預防用高蔗糖、低鉻食物飼養的大鼠發生胰島素分泌過度的反應，結論是，為了維持大鼠對於葡萄糖的正常耐受性，需要在飼料中添加鉻。Evans等(Int．J．Biosocial Med Res．等．11163-180，(1989))報導，單獨經口補充鉻就能使不患糖尿病的動物中胰島素的功能改善。據報導鉻能增強胰島素的作用、降低對葡萄糖的不耐受性、降低總膽固醇、LDL-膽固醇和甘油三酯的水平，並增高HDL-膽固醇的水平(Anderson，J．Adv．Medicine 134-47，(1995))。
發明綜述本發明涉及在需要增強胰島素活性的患者，如高糖血症的患者中增強胰島素活性方法和組合物。該方法包括對患者給予胰島素增強劑劑，所述的胰島素增強劑含有有效劑量的來源於何首烏、樟屬植物和／或蘑菇科真菌的水提取的天然物質。任選的是，三價鉻可與蓼科植物、樟屬植物和／或蘑菇科真菌的提取物聯合使用，以增強療效。本發明也提供了一種包含胰島素增強劑的組合物和該組合物的製備方法。該組合物能用於治療高血糖症以降低血液中的葡萄糖和糖基化血紅蛋白的水平。
優選實施方案的詳述本發明涉及通過降低血液葡萄糖水平和／或糖基化血紅蛋白水平來增強胰島素活性，以治療高血糖症的患者的方法和組合物。用於本發明的組合物都具有胰島素增強活性，即，如測得的細胞攝入的葡萄糖增加所示，它們增加了表觀的胰島素活性。改進的胰島素活性降低了循環的胰島素和患者的糖基化血紅蛋白的水平；這也可使葡萄糖水平的波動平緩。循環胰島素減少會進一步導致動脈硬化症減少。(Stout，(1985)Metab．347-12)。通過給予胰島素增強劑，降低了血液中總膽固醇、LDL-膽固醇和甘油三酯的水平；增高了HDL-膽固醇的水平。
胰島素增強劑是來源於植物或諸如蘑菇類真菌經水提取出來的天然物質，可被人體安全地攝取。因此，用這些天然來源的藥劑治療高血糖症患者有不會引起像磺醯脲類藥物所引起副作用的優點。將這些藥劑與諸如口服降血糖藥或胰島素的常規藥物治療聯合使用會降低藥物劑量和／或減少給藥頻率，從而減少了這些治療中最常見的副作用。
藉助於各種試驗，包括，如使用脂肪細胞測定法測定提取物的潛在來源裡的胰島素增強活性，。脂肪細胞是從大鼠副睪的脂肪墊製備出來的。將待測樣品或水對照都與14C-葡萄糖、白蛋白、右旋糖以及脂肪細胞共同培養。通過所產生的14CO2量測定出細胞的葡萄糖攝入。將樣品存在下釋放放射活性14CO2除以相應水對照所釋放的放射活性14CO2，計算出對胰島素的增強。例如，在脂肪細胞測定中，胰島素增強活性(IPA)為1時，就表明所測驗的樣品對胰島素功能沒有可測得的影響；而當IPA＞1時，則顯示有可測量到的胰島素功能增強活性。
製備含有IPA的提取物的優選來源是蘑菇類真菌；這些蘑菇為蘑菇科的真菌，在菌褶上有擔子，所述的蘑菇科真菌包括雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)、四孢蘑菇(Agaricus campestris)、野蘑菇(Agaricus arvensis)、黃斑蘑(Agaricusxanthodermus)、Agaricus nivesens、大肥蘑(Agaricus bitorquis)、白林地蘑(Agaricus silvicola)、小白蘑(Agaricus comtulus)、和Agaricuspraeclaresquamosus。優選的是雙孢蘑菇，包括該種屬的一些栽培變種例如Crimini和Portabella蘑菇。雙孢蘑菇是一種白色蘑菇，天然分布於歐洲、北美洲和中國。雙孢蘑菇是可以食用的，有商業公司用它製成食品出售。另一種優選的來源是蓼科的植物；優選的來源是中草藥何首烏。還有一個優選的來源是樟屬樹林桂樹的樹皮。優選的品種為銀葉桂(Cinnamonum mairei)、斯裡蘭卡肉桂(Cinnamomum zeylanicum)和肉桂(Cinnamomum cassia)。銀葉桂是一種樹皮上具有極為濃厚香味的樹木，樹皮可用來製備提取物。作為商品出售的桂樹樹皮是其樹枝的乾燥內皮，而食品雜貨店中所出售的研細了的桂樹皮粉末也可用來製備提取物。
被推測具有胰島素增強活性的組織來源於研磨而成的粉末或者是切成小塊的植物或真菌組織，將其粉碎、磨研成粉，或者借其他辦法使該塊組織的表面積增加，以便於提取。使用親水溶劑從潛在藥源中提取有胰島素增強活性的提取物。由於蒸餾水安全、易於使用，而且很經濟，故它是優選的提取溶劑。另外，水不會將只溶於酸或鹼的雜質提取出來。可以向蒸餾水中加入少量的緩衝液以維持PH值的穩定。也可向蒸餾水中加入少量的乙醇和甲醇，作為提取的溶劑。然而，濃度高達50％的乙醇能將一些不需要的有機雜質提取出來，例如從樟樹屬植物中提取出肉桂醛，人體大量攝入時是有毒性的。此外，在測定提取物的活性前，必須將提取物中的甲醇或乙醇稀釋到1％的濃度以下，否則乙醇／甲醇能夠在所用的活性測定系統中抑制胰島素增強活性。向原料中加入用於提取的溶劑量，以體積範圍表達，一般為2-200倍／原料的單位重量，優選的是20-100倍／原料的單位重量。
其他可以使用的溶劑包括稀的酸和鹼。諸如乙酸和鹽酸的稀酸也可以用於提取酸濃度應低於大約1N，最好是低於0．5N。例如，0．1N乙酸或0．1N鹽酸都可作為有效的溶劑。稀鹼，如氫氧化銨或氫氧化鈉可用作溶劑；鹼濃度應當低於1N，最好低於0．5N。例如，0．1N的NH4OH能用作提取胰島素增強活性提取物的有效溶劑。
胰島素增強活性對於溫度是穩定的，而且不受提取時溫度的影響。因此，提取工作可以在大範圍的溫度下進行，但優選的溫度範圍是室溫到約100℃；提取時間約由15分鐘到過夜。最恰當的提取方法是將待提取的材料煮沸10分鐘至1個小時，因為沸騰過程可試原料消毒。萃取也可在室溫下進行約20分鐘到5小時。可以在4℃下進行提取，但由於其提取效率很低，實際上不常用。
提取後，以最小速度1000xg離心20分鐘從固體殘渣裡分離得到含胰島素增強活性物質的液體。也可以將該溶液通過濾紙或微濾器過濾，以去除固體的殘渣。如使用酸或鹼作為提取的溶劑，在進行下一步使用前將其中和。酸性或鹼性的提取物在下一步使用前也可能需要進行純化的步驟，以便除去不需要溶於酸或鹼的雜質。
從植物或真菌組織源提取的液體不含固體碎渣，可以直接用作胰島素增強劑，或者凍幹或乾燥這種液體提取物以形成粉末。這種液體或粉末能摻入許多種基礎材料中以形成液體、粉末、片劑或膠囊，所得的胰島素增強活性能有效地降低血液葡萄糖水平或糖基化血紅蛋白的水平。這類化合物能有效地降低血液葡萄糖和糖基化血紅蛋白水平，並有效地治療高血糖症。
液體提取物可用本技術領域已知的方法進一步純化，所使用的純化方法包括離子交換層析、分子排阻層析、親和層析、高效液相層析、凝膠電泳等技術。從而獲得在脂肪細胞測定試驗中顯示出高的胰島素增強活性的化合物。這類化合物能用作結構模式，供設計出顯示胰島素增強活性的其它化合物。
雖然胰島素增強劑可單獨給藥，但優選的是將活性組分配製成藥物製劑。本發明的藥物製劑包括至少一種胰島素增強劑，和一種或多種可接受的載體，任選地還有其它治療劑。適合本發明使用的其它治療劑是能有效地達到發明目的的任何可配伍的藥物，或對本發明藥劑進行補充的藥物。用於聯合療法的製劑可同時給藥，或按序給藥，結果得到了合併給藥的效果。合適的藥學上可接受的載體是本技術領域公知的，可隨藥物製劑的劑型和給藥模式而定。例如，它們包括稀釋劑或賦形劑，如填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑之類。典型的是，載體是固體、液體或可揮發的載體，或它們的組合。典型的單位劑型包括片劑、丸劑、粉末劑、溶液、懸浮液、乳劑、顆粒劑、膠囊、栓劑。每個載體是藥學上可接受的，即製劑時與其它組分相容，對患者沒有損傷，即載體是生物學上可接受的，並且是惰性的。
製劑包括那些適用於口服和非胃腸道給藥(包括皮下、肌肉、靜脈內和皮下注射)的劑型，優選的是口服製劑。優選的口服製劑是來自何首烏、樟屬樹木、桂樹、或者雙孢蘑菇的水提取上清液、或者這些提取物中的兩種或多種混合物的封入膠囊的乾燥粉末。鉻可以以吡啶甲酸鉻(chromium picolineate)或氯化鉻的形式與具有胰島素增強劑共同包被在膠囊之內，以產生協同作用，或可單獨給予。
製劑可以按照傳統的方式製成單位劑型，並且可用藥學領域已知的任何方法來進行製備。這些方法包括將該活性組分與包含一種或多種補充組分的載體聯合起來的步驟，這種載體可以攜帶一種或多種輔助的組分。一般而言，這樣製備製劑使活性組分與液體載體、或細分散的固體載體、或兩者兼有的載體均勻和緊密地混合，需要時使產品成形。可以如本技術領域公知的那樣使用各種單劑量和多劑量的容器，例如密封的安瓿和藥瓶。
例如，為了製備適用於注射的劑型，對溶液或混懸液加以滅菌處理，並且它們最好是與血液是等滲性的。在製備可注射的劑型時，使用在這一領域中通常使用的載體，例如水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的異十八烷醇、多氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇、以及山梨糖酸酯。在這些情況下，還可進一步加入適量的諸如氯化鈉、葡萄糖或甘油的等滲性調整劑以使製劑等滲。水性無菌的注射溶液進一步包括氧化劑、緩衝液、抑菌劑等非胃腸道製劑可接受的添加劑。
為了在治療或控制涉及高血糖症的病症或病情的方法裡作治療用，本發明組合物能方便地以藥物製劑形式給藥，所述的藥物製劑包括至少一種本發明的胰島素增強劑和藥學上可接受的載體。例如，繼對患者用外源性胰島素治療後，給予胰島素增強劑。另一種做法則是將胰島素增強劑的治療與胰島素的治療同時施行。本發明組合物可通過任何合適的途徑，包括口服和非胃腸道(包括腹腔內、皮下、肌肉內、靜脈內、以及皮下注射)的途徑給藥治療。應當了解到，隨著患者的病情和年齡的不同，以及治療所持續時間的長短，最恰當的給藥途徑也就互不相同。
本發明提供了一種治療高血糖症患者的方法，該方法包括對患者給予治療有效量的本發明組合物，該組合物包括至少一種本發明的胰島素增強劑和藥學上可接受的載體。胰島素增強劑的「有效量」是指足以增加患有高血糖症的個體對胰島素的反應的量，對於每一例患者來說，確定這個藥量的最好的經驗主義式的辦法是進行長期血糖控制的監視，因為每一例個體對於治療的反應可互有差別，這一點對於在治療高血糖症方面富有經驗的人們來說是眾所周知的。一般來說，治療高血糖症患者開始時每天的有效量的胰島素增強劑一般在1，000至100，000 IPA單位之間，優選為5，000至50，000IPA單位之間，更好的是20，000-50，000 IPA單位，這一劑量可以根據每例高血糖症中患者的治療反應進行向上或向下的調整。有效量依賴於下列一些因素而定，所述的因素包括，但不限於患者的年齡與體重、所治療的疾病狀態的類型、病程的早或晚、患者的一般健康狀況、症狀的嚴重程度、是否單獨給予胰島素增強劑還是與其它療法或其它活性組分聯合用藥、副作用的發生率和其它因素。通常，高血糖症患者每天攝入1-10個含有胰島素增強劑的膠囊進行治療。每個膠囊含有100～500mg來自何首烏、樟屬樹木、蘑菇科真菌、或它們的混合物的水提取物上清液的乾燥粉末。約100-300微克，通常約200微克的吡啶甲酸鉻也可加入膠囊以產生協同的效應。一種或多種活性組分，即由不含固體碎渣的水提物所製備的乾燥粉末，對患者給藥量範圍是100-5000mg，優選的是200-2500mg，最好是500-1500mg。乾燥粉末可以是何首烏、樟屬樹木蘑菇科真菌的單一組分或它們的混合物。乾燥粉末另外還可包括100-3000微克吡啶甲酸鉻。這種治療所持續的時間一般為大約1-4個月，需要連續治療的個別患者應當加以監視。
用幾種不同的方法被確定高血糖患者對治療的反應和監測該大於提取物的藥量。測定血清中的糖基化蛋白，例如血紅蛋白，是最為可靠的評價糖尿病患者長期控制血糖的一個方法(Bunn，糖尿病(Diabetes)30613-617(1981)；MacDonald人體病原學(Human Pathol．)10279-291(1979)；Mayer等，Clin．Chim．Acta．127147-184(1983)；Schleicher等，臨床化學臨床生化雜誌(J．Clin．Chem．Clin．Biochem．)27577-587(1989)；Takara等，糖尿病護理(Diabetes Care)18440-447(1995))。最初推測血紅蛋白Alc能反映一段特定時間裡簡單平均的血漿葡萄糖水平。考慮到紅細胞的壽命，曾經認為糖基化的血紅蛋白在紅細胞裡均勻積蓄達120天以上。但是，理論和實驗證據表明，隨著血液葡萄糖水平持續降低，HbAlc在頭1-2個月裡迅速改變，在4個月後保持穩定水平(參見Takara等，同上，(1993)；和Takara等，同上，(1995))。在頭兩個月裡，75％HbAlc水平與血液葡萄糖改變成正比。測量兩小時禁食血液葡萄糖水平和血清胰島素是另外的方法，它可用來確定用胰島素增強劑對個體患者的治療效果，並監測給藥的劑量。用本技術領域公知的方法在給藥的0時和給藥後每隔30天測量患者血液中的葡萄糖、血紅蛋白Alc和胰島素水平。例如，通過葡萄糖氧化酶方法分析葡萄糖(Loft等，臨床化學(Clin．Chem．)211754-1760(1975))。通過放射免疫測定法測定胰島素(Albano等，Ecta Endrocrinol．70487-509(1972))。用BioRad HbAlc柱(BioRad，美國加利福尼亞)。血液葡萄糖、血紅蛋白Alc和胰島素水平降低表明有療效。
提取物也可用於降低總膽固醇、LDL-膽固醇和甘油三酯水平，並增加HDL-膽固醇水平。通過測定總膽固醇(Deacon等，臨床化學(Clin．Chem．)25976-984，(1979))和HLD-膽固醇(Warnick等，Am．J．Clin．Nutr 78718-723，(1982))和甘油三酯(Kohimeier，臨床化學3263-66，1986)的水平來決定胰島素增強劑對血清脂質水平的影響。
下列實施例僅供闡述，並非作限定用。
實施例
(a)製備分離的脂肪細胞在進行脂肪細胞的分離和測定中只使用塑料容器。用斷頭法處死2隻大鼠並取出其附睪的脂肪墊。將該脂肪墊的遠端部分(約2克重)用0．9％的NaCl加以浸洗，用剪刀剪成碎塊，並放入10ml含有2mg／ml膠原酶(CLS 47B177P，Worthinton，Freehold，美國馬麻薩諸塞州)的Krebs林格氏緩衝液中，然後在水浴搖器中以150rpm的速度加以搖蕩的條件下，於37℃下培養40-45分鐘。該緩衝液(KRP)含有118mM NaCl、5mM KCl、1．3mM CaCl2、1．2mM MgSO4、1mM KH2PO4和16．2mM Na2HPO4(PH7．4)。用10ml注射器使被消化的組織通過一絲線網(Adcom公司，美國馬裡蘭州)。然後通過與含有2％白蛋白(組分V，批號R53808，Armour Pharmaceutial Co．，美國伊利諾斯州)的KRP離心將該製劑離心沉澱洗滌3次。所使用的KRP和KRP-白蛋白經微孔過濾並充以O2。位於漂浮著的脂肪細胞之下的物質和在脂肪細胞上方的任何脂肪用抽吸去除。加入9ml KRP-白蛋白以分散洗滌後的脂肪細胞。脂肪細胞至少存活4小時。
(b)葡萄糖氧化試驗將25微升樣品和25微升水對照各加入含有1．9ml KRP-白蛋白、0．4μCiC14-葡萄糖(313Ci／摩爾)和68微克右旋糖的試管中。再加入脂肪細胞(100微升)，並用中央有槽的蓋子(Kontes)將試管封閉。在37℃下培養90-120分鐘和以150rpm的速度振蕩後，向中央槽內加入0．2ml季銨鹽氫氧化物(hyaminehydroxide)(10X)(Packard)，向培養混合物中注入0．3ml 1．5N H2SO4以終止反應。將試管培養30分鐘以使季銨鹽捕捉14CO2。去掉中央槽，小心地擦拭，並加入10ml Aquasol Ⅱ(New England Nuclear，美國麻薩諸塞州)，在Beckman液體閃爍計數儀裡進行計數。將樣品存在下釋放的放射活性CO2除以水對照中釋放的放射活性CO2算出胰島素增強活性。胰島素增強活性(IPA)為1表明所測試的樣品對胰島素功能不具有可測量到的作用。
實施例2水提取何首烏將何首烏(根)切碎研磨成小的碎塊。向1g何首烏中加入100ml蒸餾水。將此混合物在室溫下攪拌25分鐘，然後以1200xg的速度離心20分鐘以除去殘渣，收集上清液，按實施例1的方法測定其不同稀釋度下的胰島素增強活性。未經稀釋的，稀釋度為1∶2和1∶10的上清液的IPA分別為3．8、4．8和1．1。在50℃烘箱中使上清液烘乾至少3-4小時，然後1ml上清液便可得出重量為4．4mg的乾燥粉末。該乾燥粉末的胰島素增強活性為87IPA／mg。
實施例3水提取銀葉桂將銀葉桂(樹皮)切碎並研磨成小片，向1g銀葉桂中加入100ml蒸餾水。將此混合物在室溫下攪拌25分鐘，然後以1200xg的速度離心沉澱20分鐘以除去殘渣，收集上清液並按照實施例1中所述的不同稀釋度測定其胰島素增強活性。未稀釋的上清液、稀釋度為1∶2和1∶10的上清的IPA分別為2．3、3．6和3．8。上清液於在50℃烘箱中烘乾至少3-4小時之後，由1ml上清液便得出重量為1．6mg的乾燥粉末。該乾燥粉末的胰島素增強活性為950 IPA／MG。
實施例4水提取雙孢蘑菇本實施例使用了市售的雙孢蘑菇的粉末「百寶」(廈門火炬生物技術有限公司，中國)。百寶是製作雙孢蘑菇罐頭時的一個副產品。在把雙孢蘑菇放入到罐頭瓶內之前，先要在水中加以煮沸。煮過之後便將蘑菇取出，再把水提取物乾燥為粉末，這就是百寶產品。將百寶直接用於提取過程。向1g百寶乾粉中加入20ml水。將此混合物在室溫下搖蕩1小時，然後以1，200xg的速度離心20分鐘以除去殘渣。收集上清液並測定如實施例1所述的不同稀釋度的胰島素增強活性。未稀釋的上清液，稀釋度為1∶5和1∶10的上清液的IPA分別為4．2、2．9和2．1。將上清放入50℃烘箱中烘乾至少3-4小時，從1ml的上清液可得到23．2毫克乾燥粉末。該乾燥粉末的胰島素增強活性為25 IPA／毫克。
實施例5不同提取物的混合物的胰島素增強活性將吡啶甲酸鉻(Nutrition 21，美國加裡弗尼亞州聖地牙哥市)溶解於蒸餾水中達到6．4mg／ml的濃度。製備等體積的(a)何首烏的水提取物(實施例2中的1∶2稀釋的上清液)、(b)銀葉桂的水提取物(實施例3中的1∶10稀釋的上清液)、(c)雙孢蘑菇的水提取物(實施例4中的未稀釋的上清液)或(d)吡啶甲酸鉻溶液(6．4mg／ml水溶液)的混合物。按照實施例1的步驟測定25微升每種混合物的胰島素增強活性。測定結果列於表1表1不同提取物的IPA樣品IPA(a)何首烏+(b)銀葉桂 3．5(b)銀葉桂+(c)雙孢蘑菇7．0(a)何首烏+(c)雙孢蘑菇5．2(b)銀葉桂+(c)雙孢蘑菇+(d)鉻 4．7水對照 1．0實施例6動物實驗中胰島素增強劑的效果根據實施例2-4方案，用100毫升蒸餾水提取1g雙孢蘑菇，銀葉桂，何首烏，或雙孢蘑菇和銀葉桂和何首烏的混合物，或雙孢蘑菇和銀葉桂的混合物。
將20-40隻雄性剛剛斷奶的小鼠隨機地分成表2所列出的7個組進行處理。通過每天用有或沒有吡啶甲酸鉻的微滴管對每隻小鼠口服給予100微升的組織水提取物或水對照。該處理持續1-2個月。在處理的時間0時，處理期間的1和2個月末，測定每個小鼠的血液葡萄糖、血紅蛋白Alc和胰島素水平。用葡萄糖氧化酶方法分析葡萄糖(Loft等，Clin Chem，211754-1760，(1975))。通過放射免疫測定法測定胰島素(Albano等，Acta Endocrinol，70486-509，1972年)；而血紅蛋白A1c則是使用BioRad HbAlc柱(BioRad，美國加裡弗尼亞州)進行測定的。
表2用不同中草藥的水提取物處理小鼠組別 組織Ⅰ 何首烏Ⅱ 銀葉桂Ⅲ 雙孢蘑菇Ⅳ 雙孢蘑菇與銀葉桂(重量比為1∶1)Ⅴ 雙孢蘑菇與銀葉桂與何首烏(重量比為1∶1∶1)Ⅵ 雙孢蘑菇與銀葉桂(1∶1重量比)及200微克吡啶甲酸鉻Ⅶ 無活性組分實施例7試驗性臨床研究選擇35-65歲男性，除Ⅱ型糖尿糖以外不患有其他疾病，其空腹血液葡萄糖濃度為7．2-15．5毫摩爾／升、2小時血液葡萄糖水平為9．4-16．7毫摩爾／升，血紅蛋白Alc的濃度為8．0-12％的患者參加試驗性研究。這些患者仍然繼續使用他們的有規律性的治療其糖尿病的方法，例如磺醯脲類藥物、胰島素、或者不用藥物治療。
七個組中每一組的患者分別服用不同的膠囊。每組包括3-5個患者，讓這些患者每天口服1-10個含有200～500微克無水提取物粉末的膠囊，共治療1-3個月。每組攝入的膠囊含有何首烏、銀葉桂或雙孢蘑菇的水提取物的乾燥粉末。對照組攝入口服安慰劑膠囊(參見下表)。
表3用含有不同胰島素增強劑的膠囊對人體治療組別膠囊內含Ⅰ 何首烏Ⅱ 銀葉桂Ⅲ 雙孢蘑菇Ⅳ 雙孢蘑菇與銀葉桂(重量比為1∶1)Ⅴ 雙孢蘑菇與銀葉桂與何首烏(重量比為1∶1∶1)Ⅵ 雙孢蘑菇與銀葉桂(1∶1重量比)加以200微克吡啶甲酸鉻Ⅶ無活性組分在治療的時間0時，治療期間1、2和3個月分別測定每個患者的血液葡萄糖、血紅蛋白Alc胰島素的水平、總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯水平。血液葡萄糖、胰島素和血紅蛋白Alc都是按照實施例6中所描述的方法測定的。總膽固醇是藉助於化學水解法測定(Deacon等，Clin，Chem，25976-984，(1979))， HDL-膽固醇是用磷鎢酸鹽Mg沉澱法測定(Warnick等，Am．J．Clin．Nutr。78718-723，(1982))，甘油三酯是用直接的酶測定法(Konimeier Clin．Chem 3263-66，1986)測定的。血液尿氮的BUN是用直接法(Foster等，Clin．Chem 17921-925，(1971))測定的。
實施例8臨床研究對於正在進行治療的糖尿病患者加以篩選，從中挑選出符合入選標準的100-200名受試者。入選標準包括對象是除了患有Ⅱ型糖尿病外沒有其它疾病，年齡為35-65歲，其空腹血液葡萄糖水平為7．2-15．5毫摩爾／升，2小時血液葡萄糖水平為9，4-16．7毫摩爾／升，血紅蛋白Alc(HbAlc)為80-12％。入選的受試者必須是成年人，身高、體重及身體質量指數均屬正常，患糖尿病的時間短於10年。入選的患者仍繼續其有規律性的糖尿病治療，例如磺醯脲類藥物、胰島素、或者不用藥物治療。
篩選出來的糖尿病患者被隨機地分配到上述表3中所列的7個組中。指導他們每天口服1-10個膠囊(參見實施例7)。這些受試者還被鼓勵維持其正常的飲食和體育鍛鍊的習慣。受試者要繼續其正常的隨訪就診以監測他們的糖尿病病情。在開始研究時以及治療後的2和4個月獲得患者的空腹血樣和葡萄糖(75g葡萄糖)激發後2小時的血樣。將完成了本項研究中所有各期的所有受試者的資料都包括在所有的有關的分析之中。
本項研究的設計是雙盲的、以安慰劑作為對照的研究。安慰劑膠囊與含有所測試的藥物的膠囊是無法區別開來的。如實施例7所述測定血液葡萄糖、胰島素、血紅蛋白Alc總膽固醇、HDL-膽固醇、甘油三酯、以及血液尿素氮都是按照實例7中所講述的方法測定的。
本項研究中所觀察的一些變數，包括HbAlc、空腹和葡萄糖攻擊後2小時血中葡萄糖，胰島素總膽固醇、HDL-膽固醇、甘油三酯以及血液尿氮的水平。
變量，HbAlc空腹和2-小時葡萄糖，胰島素，總膽固醇，HDL-膽固醇，甘油三酯和血尿氮用PROC MIXED程序(SAS研究所，美國北卡羅來納州)作為混合線性模型3個重複測定的因子進行分析。由於這些變數都是在0、2和4個月對每一名受試者測定的，所以使用了重複的測定分析。
上述實施例顯示了製備何首烏、銀葉桂和雙孢蘑菇水提取物的方法，以及體外測定胰島素增強活性的方法。這些實施例也顯示了何首烏、銀葉桂和雙孢蘑菇的水提取物在體外的脂肪細胞測定分析中具有很高的胰島素增強活性。
在本說明書中提及的所有出版物和專利申請預示著本發明所屬技術領域中熟悉該技術領域人員的水平。所有的出版物和專利申請在此如同每個出版物或專利申請特定和獨立地併入本文供參考那樣的程度來併入本文。
到此為止，對本項發明已經作出了全面的敘述。很顯然熟悉本技術領域的普通人員可對此作出許多改變和修飾，而不偏離所附的權利要求書的精神或範圍。
權利要求
1．一種使高血糖症患者糖基化血紅蛋白水平或血液葡萄糖水平降低的方法，所述的方法包括對所述的患者給予一種組合物，該組合物包含有效量的來源於何首烏、蘑菇科真菌和樟科樹木組織的水提取物或酸提取物的胰島素增強劑，其中所述的胰島素增強劑以足以在所述高血糖症患者中增強胰島素活性的量給予，從而與治療前水平相比，所述糖基化血紅蛋白水平或所述血液葡萄糖水平發生了減低。
2．根據權利要求1所述的方法，其中所述的給藥是在用外源性胰島素治療後進行。
3．根據權利要求1所述的方法，其中所述的方法進一步包括對所述的高血糖症患者給予胰島素。
4．根據權利要求1所述的方法，其中所述的方法進一步包括對所述的高血糖症患者給予口服的降血糖藥。
5．一種組合物，包括來源於選自何首烏、樟屬樹木、以及蘑菇科真菌的水提取物，其中所述的水提取物沒有固體殘渣，所述的組合物包括有效量的至少一種胰島素增強劑用以在高血糖症患者中增強胰島素活性，結果用所述組合物治療的患者的葡萄糖水平或血紅蛋白水平得以降低。
6．根據權利要求5所述的組合物，其中所述的組合物是乾燥的粉末劑型。
7．根據權利要求6所述的組合物，其中所述的有效量是100-5000毫克乾重的所述水提取物。
8．根據權利要求7所述的組合物，還進一步包含三價的鉻鹽。
9．根據權利要求8所述的組合物，其中所述的鉻鹽是劑量為100-300微克的三吡啶甲酸鉻。
10．根據權利要求5所述的組合物，還進一步包含藥學上可接受的載體。
11．一種膠囊，包括選自何首烏、樟屬樹木、以及蘑菇科真菌的藥源的水提取物，其中，所述的水提取物沒有固體碎渣，所述的乾燥粉末的重量為100-500毫克。
12．根據權利要求11所述的組合物，其中所述膠囊進一步包括100-300微克的吡啶甲酸鉻。
13．一種組合物，包括雙孢蘑菇的鹼性提取物或酸性提取物，其中所述的提取物沒有固體碎渣，所述的組合物進一步包括有效量至少一種胰島素增強劑，用以在高血糖症患者中增強胰島素活性，結果使經所提到的組合物治療的患者葡萄糖水平或血紅蛋白水平降低。
14．根據權利要求13所述的組合物，其中所述的鹼性提取物用氫氧化銨或氫氧化鈉提取出來。
15．根據權利要求13所述的組合物，其中所述的酸性提取物用乙酸或鹽酸提取出來。
16．一種製備包含一種基本上沒有組織的酸性或鹼性組分的胰島素增強劑的組合物的方法，所述的方法包括用水提取何首烏、樟屬樹木、或蘑菇科真菌組織並除掉固體殘渣，從而不溶於水的組分不被提取出來，得到了基本上沒有酸性或鹼性組分組合物。
全文摘要
本發明涉及在需要增強胰島素活性的患者中增強胰島素活性。該發明提供了一種包含一種胰島素增強劑的組合物;這種組合物包括一種或多種來源於何首烏、蘑菇科真菌、或銀葉桂的水提取物的物質。本發明還提供了通過給予患者一種胰島素增強劑來治療患者高血糖症的方法。這種方法能用於降低血液葡萄糖和/或糖基化血紅蛋白和/或葡萄糖的水平。
文檔編號A61K33/24GK1281365SQ98812060
公開日2001年1月24日 申請日期1998年11月4日 優先權日1997年11月5日
發明者程南徵 申請人:唐安醫學有限公司