α-澱粉酶同工酶活性的差示測定法的製作方法

2023-12-10 02:31:31

專利名稱：α-澱粉酶同工酶活性的差示測定法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的α-澱粉酶同工酶活性的差示測定法，更具體地說涉及一種通過使用一種新的抑制劑的抑制劑方法簡易而精確地測定樣品中的α-澱粉酶同工酶活性的差示法。
已知人α-澱粉酶一般包括兩種同工酶，一種來自胰臟(以下稱為P型α-澱粉酶)，另一種來自唾液腺(以下稱為S型α-澱粉酶)。
當血清中總的α-澱粉酶活性水平高時懷疑是急性胰腺炎早期或慢性胰腺炎嚴重，這主要是由P型α-澱粉酶活性增加引起的。然而，在患有唾液腺或腮腺疾病時，在手術後以及在某些肝病中也觀察到總α-澱粉酶活性的劇增，這主要是由於S型α-澱粉酶活性的增加，這樣可能經常導致誤診。因此，這些年來一直迫切需要一種差示測定這些同工酶的簡單而精確的方法。
到目前為止已知的人α-澱粉酶同工酶活性的差示測定法有，例如(1)電泳法，(2)凝膠過濾法，(3)酶免疫測定(EIA)法，或(4)使用抑制劑如麥芽抑制劑的抑制劑法。
在這些方法中，方法(1)-(3)的缺陷在於測定操作複雜且耗時。
另一方面，使用麥芽抑制劑的抑制劑法(4)是通過利用下列事實來測定P型和S型澱粉酶的活性，即所說的麥芽抑制劑對S型α-澱粉酶的抑制強於對P型α-澱粉酶的抑制，換句話說，這些抑制作用對這些澱粉酶具有不同的抑制常數。這種操作相對簡單的方法這些年來一直廣泛使用。
然而，麥芽抑制劑是一種蛋白質，因而穩定性差。這給長期貯存用於測定α-澱粉酶同工酶活性的試劑盒帶來困難。再者，麥芽抑制劑還有一個缺點，就是必須對每一試劑盒中麥芽抑制劑的抑制常數進行測定，因為針對α-澱粉酶同工酶的麥芽抑制劑具有不同的抑制常數，這取決於它們的純度。
為了克服常規抑制劑方法中存在的缺陷和提供一種以簡單的操作和高精確性有效地測定α-澱粉酶同工酶活性的方法，完成了本發明。
本發明人為了實現上述目的已進行了各種研究。結果發現63-脫氧麥芽三糖對P型α-澱粉酶和對S型α-澱粉酶的抑制常數之間存在很大的差別，使用上述材料作為抑制劑可以成功地完成用抑制劑法對α-澱粉酶同工酶進行的差示測定。因此在這些發現的基礎上完成了本發明。
也就是說，本發明旨在提供一種α-澱粉酶同工酶活性的差示定量測定法，該方法是利用通過將用於測定α-澱粉酶活性的底物與樣品反應而得到的α-澱粉酶活性測定值和通過將同樣的底物與樣品在抑制劑存在下反應而得到的α-澱粉酶活性測定值，該抑制劑對兩種α-澱粉酶同工酶具有不同的抑制常數，在所謂的抑制劑方法中用下式所示的63-脫氧麥芽三糖[O-6-脫氧-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖)作為抑制劑 下面對本發明進行詳述。
首先，在本發明中用於測定α-澱粉酶活性的底物可以是能夠測定α-澱粉酶活性的任何底物，例如包括下式所示的麥芽低聚糖衍生物
其中R代表氫原子，芳香生色基團或除葡萄糖之外的糖基，R1和R2可以是相同的或不同的，代表滷原子，羥基，疊氮基，醯氧基，烷氧基，芳氧基，烷基磺醯基，芳基磺醯基，烷基巰基，芳基巰基，N-烷基氨基甲醯氧基，N-芳基氨基甲醯氧基，烷氧甲氧基或芳氧甲氧基，或R1和R2一起形成取代的或未取代的亞甲基二氧基，n代表1-6的整數。
在這些材料中，P型和S型α-澱粉酶與底物的反應速率之比至少為0.6，尤其是大約為1在簡易性和精確性方面較有利。
同樣，用作抑制劑的式(Ⅰ)所示的63-脫氧麥芽三糖基本上不被α-澱粉酶水解或甚至不被偶合酶水解，如有必要，在測定α-澱粉酶活性時偶合酶可存在，具體地說，偶合酶特別抑制P型α-澱粉酶。因此，對P型和S型α-澱粉酶的抑制常數差別很大。此外，這種材料不同於其它的蛋白質如麥芽抑制劑，它是高度穩定的，因此它能夠長期貯存並且當將其摻加到試劑盒中時能夠有效地用於測定α-澱粉酶同工酶活性。
下面，具體說明差示測定樣品中的α-澱粉酶同工酶活性的方法。
用常規方法(見下面的實施例)，分別用具有已知活性的P型和S型α-澱粉酶製劑與用於測定α-澱粉酶活性的底物反應首先得到反應速率常數(Kp，Ks)。
同樣，將用作抑制劑的63-脫氧麥芽三糖以各種濃度加入到與上面相同的用於測定α-澱粉酶活性的底物中，確定63-脫氧麥芽三糖對上述P型和S型α-澱粉酶製劑的抑制常數差別最大時的濃度，在此濃度下對P型和S型α-澱粉酶的抑制常數(a，b)可用常規方法得到(見下面的實施例)。
接著，將上述用於測定α-澱粉酶活性的底物加入到用於測定α-澱粉酶活性的樣品中。用常規方法在偶合酶存在或不存在的情況下進行混合物的反應並測定可變吸收度(T)。
然後以上述相同方式，但加入上述確定濃度的63-脫氧麥芽三糖測定可變吸收度(W)。
在這一點上，P型α-澱粉酶活性(P)和S型α-澱粉酶活性(S)之間存在下列關係KpP+KsS＝T (1)(1-a)KpP+(1-b)KsS＝W (2)從這些關係可得到下列公式P＝[(1-b)T-W]/[Kp(a-b)] (3)S＝(T-KpP)/Ks (4)也就是說，如果預先測定Kp，Ks，a和b，則能夠通過使用測定α-澱粉酶活性的底物和相同的底物及63-脫氧麥芽三糖，和通過用酶與樣品的反應中所測得的可變吸收度(T，W)代替式(3)和(4)中的T和W容易地進行樣品中兩種同工酶活性的差示測定。
在本發明的方法中所用的式(Ⅰ)所示的63-脫氧麥芽三糖既可以是α-異頭物也可以是β-異頭物。
同樣，用作測定α-澱粉酶活性底物的式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物既可以是α-異頭物也可以是β-異頭物。而且，作為麥芽低聚糖部分，例如包括麥芽三糖至麥芽八糖，所有這些都可使用，特別優選的是麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖。
通式(Ⅱ)中的基團R代表氫原子，芳香生色基團或除葡萄糖外的單糖部分，特別優選的是芳香生色基團。
作為芳香生色基團，可以使用任何分光鏡法可檢測的基團，例如包括下列基團 其中R3-R7可以是相同的或不同的，代表氫原子，滷原子，硝基，烷基，芳基，烯丙基，氨基，磺酸或羧基，或R3和R4或R4和R5可以鍵合起來形成稠合的芳環， 其中R8代表氫原子或烷基，
其中R9代表氫原子或烷基，和 其中R10-R17可以是相同的或不同的，代表氫原子，滷原子，硝基，烷基，芳基，烯丙基，氨基，磺酸或羧基，或R10和R11或R12和R13可以鍵合起來形成稠合的芳環，或R11和R12和/或R15和R16可代表形成稠合醚環的共用氧原子，Z代表氮原子或基團N→O。
此外，除葡萄糖外的單糖可以是廣義上的單糖或其衍生物，例如包括果糖，肌醇，葡糖醇，山梨糖醇和葡糖-6-磷酸。
通式(Ⅱ)所示的化合物的典型實例包括麥芽五糖，麥芽七糖，2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基45，65-二-O-(N-乙基)氨基甲醯-β-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基45，65-二-O-甲氧甲基-β-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基67-氯-67-脫氧-β-D-麥芽七糖苷，2-氯-4-硝基苯基α-D-麥芽三糖苷，4-硝基苯基65-O-苄基-α-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基45，65-O-亞苄基-β-D-麥芽五糖苷，酚靛-3'-氯苯基65-O-甲苯磺醯-β-D-麥芽五糖苷，65-氯-65-脫氧-D-麥芽五糖，1-(46-O，66-O-二甲磺醯-α-麥芽六糖基)-α-D-葡糖醇等等。
在本文中，符號65，67，6m和4m是指在構成麥芽低聚糖衍生物的葡萄糖單元中從還原末端起第5位，第7位或第m位上的6-羥基或4-羥基被取代。
此外，式(Ⅰ)的63-脫氧麥芽三糖是一種已知的材料(見Carbohydrate Res.，51，73-84(1976))，可以用任何方法製備。例如，目的物63-脫氧麥芽三糖可如下製備用Carbohydr.Res.，238，193-213(1993)中所述的方法使α-環糊精單甲苯磺醯化，使該甲苯磺醯基衍生物與氫硼化鈉反應，生成單-6-脫氧-β-環糊精，後者在與環糊精酶(見日本專利公開No.3-15384)反應過程中或之後與端解型糖化酶如葡糖澱粉酶或α-葡糖苷酶，衍生於麴黴屬的α-澱粉酶等等反應，進而用常規的純化方法處理產物。再者，所說的63-脫氧麥芽三糖可結合各種合成方法進行製備(見J.Biochem.84，835-842(1978))。
此外，作為通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物，可以直接使用市售產品或通過適當結合通常的製備方法而製得的產品[例如見日本專利公開Nos.5-1091，6-56869，60-78994和4-346994，以及Carbohydrate Research，238，109-133(1993)]。
在本發明的方法中，在作為定量測定α-澱粉酶同工酶活性的α-澱粉酶抑制劑的式(Ⅰ)所示的63-脫氧麥芽三糖存在或不存在下，用通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物作為測定α-澱粉酶活性的底物測定α-澱粉酶活性。在這種情況下，一般是在偶合酶存在下使α-澱粉酶和底物反應，底物與偶合酶之間的關係不受特定限制，可以象往常一樣。如下所述，對於某些底物，不需要偶合酶。
例如，可提及的作為底物的通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物和偶合酶的結合如下(1)當n表示1和OR代表α-異頭物時，不需要偶合酶;
(2)在n表示2或更多和R代表氫原子的化合物(α-異頭物和/或β-異頭物)中，使用α-葡糖苷酶和/或葡糖澱粉酶;
(3)在R代表芳香生色基團或除葡萄糖外的單糖部分的化合物中，(ⅰ)就單獨的α-異頭物而言，使用α-葡糖苷酶和/或葡糖澱粉酶;和(ⅱ)就單獨的β-異頭物或α-異頭物和β-異頭物的混合物而言，除了使用α-葡糖苷酶和/或葡糖澱粉酶之外還使用β-葡糖苷酶。
在這一點上，當使用其中非還原末端是具有R1和R2代表的羥基的化合物的通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物作為底物時，象往常一樣不使用作為偶合酶的葡糖澱粉酶。
在此所用的α-葡糖苷酶可以是衍生於動物、植物或微生物的任何一種，優選使用的是衍生於酵母的α-葡糖苷酶。同樣，葡糖澱粉酶也可衍生於任何來源，例如，優選的是衍生於根黴菌種的葡糖澱粉酶。此外，也可使用衍生於任何來源的β-葡糖苷酶，例如，使用得自於杏仁的β-葡糖苷酶。
其次，作為對定量測定α-澱粉酶同工酶活性有利的體系，可提到的有這樣的體系，該體系包括作為底物的通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物，其用量為0.1-10mM;緩衝劑，其用量為2-300mM;如果需要偶合酶，則包括α-葡糖苷酶和/或葡糖澱粉酶，其用量分別為5-1，000單位/ml;和β-葡糖苷酶，其用量為0.5-30單位/ml，由於所說的底物和偶合酶結合，該體系的pH為4-10。
同樣，對於作為抑制劑摻入測定α-澱粉酶活性的體系中的式(Ⅰ)所示的63-脫氧麥芽三糖的濃度，使用的是對P型α-澱粉酶與S型α-澱粉酶的抑制常數之間差別最大的濃度，該濃度一般為0.01-10mM，優選0.05-5mM。
作為所用的緩衝劑，可以提到的有，例如，磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、Good緩衝劑、硼酸鹽、檸檬酸鹽或二甲基葡糖酸鹽。
如有必要，除了上述組分外還可將多種常規的添加劑加入到這樣的體系中，只要不削弱本發明的目的即可。例如，可以加入甘油、牛血清白蛋白、α-或β-環糊精、或Triton X-100作為助溶劑和穩定劑，並且可以加入各種離子如以NaCl，MgCl2，MgSO4，CaCl2或CaCl2·H2O形式存在的Cl-，Ca2+或Mg2+作為人α-澱粉酶活化劑。這些添加劑可以單獨加入或將兩種或多種添加劑聯合加入。這些組分可以在體系製備過程中的合適步驟加入。
當使用R代表氫原子或單糖部分的通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖作為底物時，可用分光鏡法對經酶促反應生成的葡萄糖、麥芽糖或其它的單糖進行定量測定，即，加入在參與NAD(P)→NAD(P)H或NAD(P)H→NAD(P)的氧化-還原反應的測定系統中常用的酶如葡糖-6-磷酸脫氫酶(例如衍生於腸繫膜明串珠菌的葡糖-6-磷酸脫氫酶)，麥芽糖磷酸化酶(例如衍生於短乳桿菌的麥芽糖磷酸化酶)，己糖激酶(例如衍生於酵母的己糖激酶)，β-磷酸變位酶(例如衍生於兔肌肉的β-磷酸變位酶)，山梨糖醇脫氫酶(例如衍生於羊肝臟的山梨糖醇脫氫酶)，NAD(P)[或NAD(P)H]和ATP。
更優選的是使用R為芳香生色基團的式(Ⅱ)的麥芽低聚糖作為底物，因為不是必須使用所說的酶並且可以應用吸收度法。
在附圖中，

圖1是表明在本發明方法的實施例中，作為抑制劑的63-脫氧麥芽三糖(DOS3)的各種不同濃度與P型和S型α-澱粉酶的相對活性之間的關係的示意圖，圖2是表明按照本發明的方法對P型α-澱粉酶活性的測定值與按照麥芽抑制劑法對P型α-澱粉酶活性的測定值之間相關性的示意圖，圖3是表明按照本發明方法中的2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽五糖苷(N3G5CNP)法對P型α-澱粉酶活性的測定值與按照2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽五糖苷(G5CNP)法對P型α-澱粉酶活性的測定值之間相關性的示意圖，和圖4是表明按照雙道法(the two channel method)對P型α-澱粉酶活性的測定值與按照本發明方法中的雙動力學法(the double kinetic method)對P型α-澱粉酶活性的測定值之間相關性的示意圖。
現在參照優選的實施方案來說明本發明的方法。
首先，用通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物作為底物並使用具有已知活性的P型和S型α-澱粉酶製劑，按照常規的方法測定反應速率常數(Kp，Ks)。
同樣，使用具有已知活性的P型和S型α-澱粉酶製劑，將式(Ⅰ)所示的63-脫氧麥芽三糖以不同的濃度加入到相同的底物中以測定對上述P型和S型α-澱粉酶活性的抑制劑之間的抑制常數差別最大時的濃度，在該濃度下對P型和S型α-澱粉酶的抑制常數(a，b)可用常規方法測得。
其次，差示測定法包括雙道法(二次測定法)和雙動力學法(一次測定法，同時做兩項分析)，現在解釋前一種方法。
根據需要，向具有α-澱粉酶活性的樣品中加入作為偶合酶的α-葡糖苷酶和/或葡糖澱粉酶，用量為5-1，000單位/ml，優選的是10-500單位/ml。如果底物含有β-異頭物，則應進一步加入0.5-30單位/ml，優選1-15單位/ml量的β-葡糖苷酶。與此同時或在此之後，與緩衝劑一起加入0.1-10mM，優選0.3-5mM的底物，在溫度為25-45℃，優選35-40℃，和pH值為4-10，優選6.5-7.5的條件下使混合物反應至少1分鐘，優選2-10分鐘。所得到的芳香生色化合物的吸收度(T)的變化可在適宜的波長下直接測定或在調節pH之後連續或間歇測定。
同樣，可變吸收度(W)也可用與上面相同的方法測定，不同的是將抑制劑加入到與上面相同的底物中，其濃度使測定系統中P型和S型澱粉酶的抑制常數差別最大。
就後一種方法而言，可變吸收度(T')可用與上面相同的方法測定，將所說的抑制劑以使抑制常數差別最大的濃度加入到測定系統中，測定可變吸收度(W)。
在這種情況下，T用下列公式表示T＝T'×(T'測定時的總液體量/W測定時的總液體量)在這一點上，可將抑制劑直接加入到底物溶液或測定系統中或者也可將抑制劑加入到所用的偶合酶中。
對於R代表氫原子或單糖部分的通式(Ⅱ)所示的化合物來說，在加入與吸收度體系有關的酶和其它必不可少的組分以後，按照與R為芳香生色基團時相同的方法進行操作。
所得到的值可替代公式(3)和(4)中的Kp，Ks，a，b，T和W，從而可得到P型α-澱粉酶活性(P)和S型α-澱粉酶活性(S)。
在本發明中用作抑制劑的式(Ⅰ)所示的63-脫氧麥芽三糖顯示出對兩種α-澱粉酶同工酶的抑制常數之間的極大不同，因此其優點在於能夠有效地進行人α-澱粉酶同工酶活性的差示測定，與常規方法相比操作簡單，精確性高。因此，本發明的方法適合於疾病診斷的測定方法，其中P型α-澱粉酶和S型α-澱粉酶必須單獨進行定量測定。
同樣，雙動力學法(單測定法，同時進行兩項分析)也可作為本發明的差示測定法應用。此方法是優選的，其中可按照下面的實施例所述進行測定，與雙道法(雙測定法)相比，樣品、底物和偶合酶的用量減半，時間縮短。
現在參照實施例更詳細地闡述本發明。
在實施例中，N3G5-CNP是指2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽五糖苷，DOG3是指63-脫氧麥芽三糖，G5-CNP是指2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽五糖苷。
同樣，除非另有規定，最大吸收度的波長是在甲醇中測定的，比旋度是在25℃用D-射線測定的。
信息實施例1N3G5-CNP的製備(1)6-O-甲苯磺醯基-β-環糊精的製備將市售的β-環糊精(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，50.0g，44.1mmol)溶於500ml吡啶中，並加入33.3g(175mmol)甲苯磺醯氯。在室溫、攪拌下使混合物反應4小時。然後向反應混合物中加入250ml水和1升正丁醇，在減壓下將混合物濃縮至1/2體積並在攪拌下倒入500ml丙酮中使固體產物沉澱，用玻璃濾器過濾並用200ml丙酮洗滌兩次。用ODS柱層析法純化過濾所分離的產物，用乙醇-水混合物(體積比1∶9)洗脫所需級分，將其濃縮並用水重結晶，得到25.3g6-O-甲苯磺醯基-β-環糊精(19.6mmol，產率44.4%)。
熔點(℃)172.0-174.0(分解)紅外光譜(cm-1)3400，2930，1642，1632，1600，1624，1360，1300，1178，1156，1078，1028NMR譜(200MHz)ppm(DMSO-d6)2.44(3H，s)，3.15-4.45(m)，4.76(2H，br.s)，4.85(5H，br.s)，7.44(1H，d，J＝8.8Hz)，7.75(1H，d，J＝8.8Hz)
(2)6-疊氮基-6-脫氧-β-環糊精的製備將上面(1)中得到的6-O-甲苯磺醯基-β-環糊精(16.9g，13.1mmol)溶於500ml水和250ml1，4-二噁烷的混合物中，加入34.1g(525mmol)疊氮化鈉，並在85℃下使混合物反應4小時。然後在減壓下將反應混合物濃縮至1/2體積，用ODS柱層析法純化。用乙醇-水的混合物(體積比1∶9)洗脫所需的級分，將其濃縮並用水重結晶，得到14.3g6-疊氮基-6-脫氧-β-環糊精(12.3mmol，產率93.9%)。
熔點(℃)215.0-218.0(分解)紅外光譜(cm-1)3390，2920，2120，1642，1414，1370，1340，1304，1156，1080，1030高效液相色譜[TSK凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)Tosoh公司生產，RI檢測儀，洗脫劑乙腈/水＝3∶2(V/V)，流速1.0ml/分]tR＝6.6分。
比旋度[α](c0.510，1，4-二噁烷/H2O＝1∶1(V/V));+145°C42H69N3O34元素分析C H N理論值(%) 43.49 6.00 3.62
計算值(%) 43.28 6.11 3.53(3)65-疊氮基-65-脫氧-D-麥芽五糖的製備在攪拌下，將按照與(2)相同的方法得到的6-疊氮基-6-脫氧-β-環糊精(25g，21.6mmol)倒入1.0升已在40℃下加熱的10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.8)中並使之完全溶解。加入490單位按照下述方法得到的環糊精酶，在40℃、攪拌下使混合物反應2小時。反應畢，在80℃、攪拌下加熱反應混合物10分鐘。然後使反應混合物冷卻至室溫，用RADIOLITE(＃100)和膜濾器(0.45μm)過濾，然後在減壓下濃縮至115ml。所得到的濃縮物用ODS柱層析法純化，用乙醇-水的混合物
洗脫並濃縮，得到11.6g6m-疊氮化麥芽七糖(m＝1-7的整數)(9.86mmol，產率45.6%)。
然後在攪拌下使產物溶入250ml 20mM乙酸鹽緩衝液(pH4.5)中，進而將8mg葡糖澱粉酶[250單位，Seikagaku公司]加入到溶液中。在40℃、攪拌下使混合物反應4小時。反應畢，在90℃、攪拌下加熱反應混合物20分鐘。然後使之冷卻至室溫，經膜濾器(0.45μm)過濾並在減壓下濃縮至55ml體積。所得到的濃縮物用活性炭柱層析法純化，用乙醇-水的混合物(5%→45%梯度)洗脫，並將用大約30%乙醇洗脫的級分凍幹，得到1.79g65-疊氮基-65-脫氧-D-麥芽五糖(2.10mmol，產率21.3%)。
熔點(℃)176.0-179.0
紅外光譜(cm-1)3400，2920，2110，1628，1406，1360，1278，1240，1144，1076，1022NMR譜(200 MHz)ppr(D2O)2.80-4.00(m)，4.64(0.5H，d，J=8.0Hz)，5.23(0.5H，d，J＝3.5Hz)，5.35(4H，d，J＝3.5Hz)高效液相色譜[TSK凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)，Tosoh公司生產，RI檢測儀，洗脫劑乙腈/水＝3∶2(V/V)，流速1.0ml/分]tR＝6.9分。
比旋度[α](c0.544，H2O);+169°C30H51N3O25的元素分析C H N理論值(%) 42.21 6.02 4.92計算值(%) 42.03 6.13 4.69(4)N3G5-CNP的製備將按照與(3)相同的方法得到的65-疊氮基-65-脫氧麥芽五糖(5.0g，5.86mmol)溶於100ml吡啶中，加入50ml(529mmol)乙酸酐，並在室溫下使混合物反應2天。使反應混合物中的吡啶、乙酸酐和乙酸蒸發後，將未經純化的殘餘物溶於30ml二氯甲烷中，將556μl(5.86mmol)三溴化磷和211μl(11.7mmol)水加入到溶液中，在室溫、攪拌下使混合物反應20小時。向反應混合物中加入18.6g(135mmol)無水碳酸鉀，並在室溫、攪拌下使混合物反應15分鐘。用玻璃濾器分離不溶物並用200ml二氯甲烷洗兩次。將濾液和洗液合併，蒸發除去二氯甲烷。將未經純化的殘餘物溶於100ml乙腈中，將5.09g(29.3mmol)2-氯-4-硝基苯酚和6.80g(29.3mmol)氧化銀(Ag2O)相繼加入到溶液中，並在35℃、攪拌下使混合物反應17小時。使反應混合物通過玻璃濾器，固體用50ml二氯甲烷洗三次。將濾液和洗液合併在減壓下濃縮以除去濾液中所含的乙腈和二氯甲烷。將300ml二氯甲烷加入到殘餘物中並將混合物經棉塞過濾，然後不溶物用200ml 0.5N氫氧化鈉水溶液洗一次，用200ml飽和鹽水洗三次。將濾液和洗液合併，用10g無水硫酸鈉乾燥，經棉塞過濾，在減壓下濃縮以除去二氯甲烷。將殘餘物直接懸浮於60ml甲醇，30ml28%(重量)氨水和15ml水的混合物中，在35℃、攪拌下使懸浮液反應20小時。然後在減壓下濃縮反應混合物以除去反應混合物中所含的水和甲醇。所得到的殘餘物用ODS凝膠柱層析法純化，用乙醇-水的混合物(體積比1∶4)洗脫所需的級分，濃縮並用水重結晶，得到2.47g所需的N3G5-CNP(2.45mmol，產率41.8%)。
熔點(℃)130.0-135.0(分解)紫外-可見光譜最大吸收波長[λmax](nm)＝290(logε＝3.98)，227(log ε＝3.99)，209(logε＝4.20)
紅外光譜(cm-1)3410，2930，2110，1584，1520，1484，1274，1150，1078，1024NMR譜(200MHz)ppm(DMSO-d6)3.05-3.90(m)，4.20-4.55(m)，4.74(1H，br d，J＝4.8Hz)，4.96(1H，br d，J＝5.4Hz)，5.05(2H，d，J＝3.7Hz)，5.10(2H，d，J＝3.7Hz)，5.25(1H，d，J＝7.6Hz)，5.25-5.60(m)，7.47(1H，d，J＝9.3Hz)，8.19(1H，dd，J＝9.3Hz，2.7Hz)，8.29(1H，d，J＝2.7Hz)高效液相色譜[TSK凝膠Amide-80柱(4.6mm ID×250mm)，Tosoh公司生產，RI檢測儀，洗脫劑乙腈/水＝3∶1(V/V)，流速1.0ml/分]tR＝6.7分。
比旋度[α](c0.516，H2O);+92.4°C36H53ClN4O27的元素分析
C H N理論值(%) 42.84 5.29 5.55計算值(%) 42.88 5.31 5.59信息實施例2DOG3的製備(1)6-脫氧-β-環糊精的製備將信息實施例1第(1)段中得到的1.27g(0.985mmol)6-O-甲苯磺醯基-β-環糊精溶於20ml二甲亞碸(DMSO)中，然後加入384mg(10.2mmol)氫硼化鈉(NaBH4)，並在50℃下使混合物反應12小時。接著，將1，000ml水加入到反應混合物中，用ODS柱層析法純化混合物以除去DMSO。用乙醇-水的混合物(體積比1∶9)洗脫所需的級分，濃縮並用甲醇重結晶，得到839.6mg6-脫氧-β-環糊精(0.750mmol，產率76.1%)。
熔點(℃)280.0-281.0(分解)紅外光譜(cm-1)3370，2920，1152，1080，1020NMR譜(200 MHz)ppm(DMSO-d6)1.20(3H，d，J＝6.1Hz)，2.80-4.05(m)，4.84(7H，br s)C42H70O34的元素分析C H理論值(%) 45.08 6.31計算值(%) 44.99 6.45
(2)DOG3的製備在攪拌下將15g按照與(1)中所述相同的方法得到的6-脫氧-β-環糊精加入到1.0升100mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中並使之完全溶解。向此溶液中加入24單位用下述方法得到的環糊精酶，並在40℃、攪拌下使混合物反應48小時。反應畢，將鹽酸加入到反應混合物中以調節pH至大約2.0並使反應停止。加入氫氧化鈉溶液中和混合物並使該混合物通過ODS柱以使未反應的6-脫氧-β-環糊精吸附於柱上並得到洗脫的級分。反覆進行此程序以處理總共63g 6-脫氧-β-環糊精。將洗脫的級分與1/10體積的100mM乙酸鹽緩衝液(pH4.5)混合後，進一步用100mM乙酸將其調至pH4.5。隨後，加入2，500單位葡糖澱粉酶，在40℃下進行酶反應8小時，將鹽酸加入到混合物中調節pH至大約2.0並使反應停止，加入氫氧化鈉溶液中和反應混合物。然後使反應混合物通過活性炭柱，用0-35%的乙醇梯度洗脫6-脫氧麥芽低聚糖，其中將用約21%乙醇洗脫的級分凍幹，得到大約1.1g 63-脫氧-D-麥芽三糖，其純度約98%。紅外光譜(cm-1)3400，2950，1690，1146，1042NMR譜(200MHz)ppm(D2O)1.28(3H，d，J＝6.1Hz)，3.17(1H，t，J＝8.9Hz)，3.29(1H，t，J＝8.9Hz)，3.50-4.05(m)，4.65(ca.0.5H，d，J＝7.8Hz)，5.25(ca，0.5H，d，J＝3.7Hz)，5.27(1H，d，J＝3.0Hz)，5.36(1H，d，J＝3.9Hz)高效液相色譜[TSK凝膠Amide-80柱(4.6mmID×250mm)，Tosoh公司生產，RI檢測儀，洗脫劑∶乙腈/水＝3∶2(V/V)，流速1.0ml/分]tR＝5.9分。
C18H32O15的元素分析C H理論值(%) 44.26 6.60計算值(%) 44.28 6.58信息實施例3環糊精酶的製備將100ml包含1%(W/V)β-環糊精，1%(W/V)腖，0.5%(W/V)NaCl和0.1%(W/V)酵母浸膏的液體培養基(所用的水是自來水，pH7.0)置於500ml Sakaguchi燒瓶中並於120℃進行巴氏滅菌20分鐘。將1鉑環量的球形芽孢桿菌E-244(FERM BP-2458)的原種斜面接種於培養基中並於30℃振蕩培養1天。將50ml培養基接種於3，000ml容器中，容器內含有2，000ml具有相同組成並經與如上所述相同的巴氏滅菌製得的培養基，在30℃，1vvm和350rpm的條件下通氣攪動發酵2天。發酵完成後，經在8，000rpm下離心20分鐘從培養物中分離出細菌細胞，將其懸浮於500ml含有2%(W/V)Triton X-100的10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中，將懸浮液在25℃下攪拌1天。經在12，000rpm下離心20分鐘從懸浮液中除去殘餘的細菌細胞後，上清液對10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)透析，透析的產物在12，000rpm下離心20分鐘以除去不溶物。上清液作為粗酶溶液(1)使用。
將大約500ml粗酶溶液(1)(總活性為200單位;蛋白量為2083mg;比活性為0.1;pH7.0)置於用10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)平衡的DEAE瓊脂糖填充柱(直徑34×170mm)上並使酶吸附於柱上，然後用0-0.5M NaCl的梯度進行洗脫。將所得到的活性級分合併，得到105ml粗酶溶液(2)(總活性為145單位;比活性為0.58;產率為72.5%)。
然後，將20ml粗酶溶液(2)(總活性為31單位;蛋白量為29mg)置於用含有1M硫酸鈉的100mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)平衡的醚5PW填充柱(直徑21.5×150mm)上並使酶吸附，用1M-0M硫酸鈉的梯度進行洗脫。將所得到的活性級分合併，得到50ml粗酶溶液(3)(總活性為72單位;比活性為2.93;產率為36%)(見日本專利公開No.3-15384)。
實施例1(1)用於測定α-澱粉酶活性的底物N3G5-CNP的Km值的測定(a)N3G5-CNP溶液的製備在含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中溶解得自信息實施例1的N3G5-CNP，製備濃度為0.16，0.32，0.48，0.64，0.80和0.96mM的用於測定α-澱粉酶活性的底物溶液。
(b)偶合酶溶液的製備將市售的衍生於根黴種的葡糖澱粉酶和衍生於杏仁的β-葡糖苷酶混合併溶解於含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中使葡糖澱粉酶和β-葡糖苷酶的濃度分別達163單位/ml和16.3單位/ml。在此，所用的這些市售葡糖澱粉酶和β-葡糖苷酶都是Toyobo有限公司生產的。
(c)α-澱粉酶溶液的製備將市售的人P型α-澱粉酶和人S型α-澱粉酶各自溶解於水中以確保每種澱粉酶的濃度為大約150IU/升。
所用的市售的人α-澱粉酶是日本國際試劑公司生產的CARIBZYME AMY。
2-氯-4-硝基苯酚的分子消光係數(ε)定義為16，100，對於α-澱粉酶活性來說，在37℃下每分鐘分解1μmol N3G5-CNP的酶量被定義為1個國際單位(IU)(依此類推)。
(d)Km的測定就人P型α-澱粉酶溶液和人S型α-澱粉酶溶液而言，將1.0ml偶合酶溶液加入到250μl α-澱粉酶溶液中並一起攪拌，溫熱至37℃保持1分鐘，加入2.0ml每種濃度的N3G5-CNP溶液並攪拌，溫熱至37℃保持2.5分鐘，在400nm處測定可變吸收度2分鐘。同時，用250μl蒸餾水代替α-澱粉酶溶液進行空白試驗。用Lineweaver-Burk法對所得到的測定結果作圖以通過最小二乘方法計算Km值。結果，N3G5-CNP對人P型和S型α-澱粉酶的Km值分別為0.17mM和0.27mM。
(2)用於測定α-澱粉酶活性的底物N3G5-CNP的反應速率常數Kp和Ks的測定，和證實線性的試驗(a)α-澱粉酶溶液的製備將上述的市售人P型和S型α-澱粉酶溶解於蒸餾水中以製備濃度分別為541IU/升和510IU/升的α-澱粉酶溶液。用這些溶液作為貯備溶液，用蒸餾水進行稀釋製得濃度為100%，80%，50%，30%，20%和10%(V/V)的6種α-澱粉酶溶液。
(b)偶合酶溶液的製備按與上述(1)的(b)相同的方法製備偶合酶溶液。
(c)N3G5-CNP溶液的製備將上述的N3G5-CNP溶解於含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中使得緩衝液中N3G5-CNP的濃度為3.25mM[終濃度(在測定體系中的濃度)2.0mM]。此濃度相當於對人P型和S型α-澱粉酶的Km值的11.8和7.4倍，因此是足以獲得最大反應速率的濃度。
(d)線性的證實和Kp、Ks值的測定對於各自含有人P型α-澱粉酶和人S型α-澱粉酶的6種溶液，分別將1.0ml偶合酶溶液加入到250μlα-澱粉酶溶液中並一起攪拌，將其溫熱至37℃保持1分鐘。加入2.0mlN3G5-CNP溶液並攪拌，將混合物溫熱至37℃保持2.5分鐘，在400nm處測定可變吸收度2分鐘。用250μl蒸餾水代替α-澱粉酶溶液進行空白試驗。結果，證實了線性對於人P型α-澱粉酶來說達到541IU/升的濃度(r＝0.999)，對於人S型α-澱粉酶來說達到510IU/升的濃度(r＝0.998)。
下列公式也衍生於用最小二乘方法所得到的線的傾角Kp＝1.1×10-3Ks＝1.1×10-3(3)測定DOG3對人P型α-澱粉酶和人S型α-澱粉酶的抑制常數的試驗(a)底物(N3G5-CNP)和抑制劑DOG3的混合溶液的製備將N3G5-CNP和得自信息實施例2的DOC3溶解於含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中使得N3G5-CNP的濃度為3.25mM(終濃度為2.0mM)而DOG3具有7種濃度，即0.05，0.11，0.54，1.09，2.16，3.25，5.41mM(終濃度分別為0.03，0.07，0.33，0.67，1.33，2.00和3.33mM)。
(b)α-澱粉酶溶液的製備將市售的人P型α-澱粉酶和人S型α-澱粉酶溶解於蒸餾水中使得它們的濃度為大約150IU/升。
(c)偶合酶溶液的製備按照如第(1)節(b)中所述的相同方法製備偶合酶溶液。
(d)抑制常數的測定將250μlα-澱粉酶溶液與1.0ml偶合酶溶液混合併溫熱至37℃1分鐘後，加入2.0ml底物(N3G5-CNP)和抑制劑DOG3的每種混合物(具有7種濃度)，攪拌並溫熱至37℃保持2.5分鐘，測定每個樣品在400nm處的可變吸收度2分鐘。
含有0mM DOG3(不含DOG3)的人P型α-澱粉酶和人S型α-澱粉酶的活性被視為100%，在不同濃度的DOG3存在下人P型α-澱粉酶和人S型α-澱粉酶的相對活性得自於如上所述的每一測定值。結果示於圖1。在圖中，○是指P型α-澱粉酶，●是指S型α-澱粉酶。
然後，根據前述所測定數值，得到在DOG3的濃度為0.33mM時人P型和S型α-澱粉酶差別最大(0.548)的相對活性(分別為13.1%，67.9%)和抑制常數(a，b)。
a＝1-0.131＝0.869b＝1-0.679＝0.321如此得到Kp，Ks，a和b的值，通過用測得的可變吸收度替代公式(3)和(4)中的T和W可得到人P型和S型α-澱粉酶的活性(P，S)。
(4)差示測定試驗將具有已知活性的人P型和S型α-澱粉酶按不同的比例混合，用N3G5-CNP作為底物，用DOG3作為抑制劑觀察根據混合比得到的理論值和得自於公式(3)和(4)的計算值的配合性。
(a)底物(N3G5-CNP)溶液的製備將底物(N3G5-CNP)溶解於含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中使得底物的濃度為3.25mM(終濃度為2.0mM)。
(b)底物(N3G5-CNP)和抑制劑(DOG3)的混合溶液的製備將N3G5-CNP和DOG3溶解於含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中使得底物和抑制劑的濃度分別為3.25mM(終濃度為2.0mM)和0.54mM(終濃度為0.33mM)。
(c)偶合酶溶液的製備按照如第(1)節(b)中所述相似的方法製備偶合酶溶液。
(d)α-澱粉酶同工酶試驗溶液的製備將市售的人P型和S型α-澱粉酶溶解於蒸餾水中，製備理論值相當於(P∶S)＝(10∶0)和(0∶10)的α-澱粉酶溶液。其活性在保持上述第(2)節中所測試的線性的範圍內。
用這些溶液作為貯備溶液，將P型和S型α-澱粉酶的混合溶液按下列混合比(V/V)混合，製備11種α-澱粉酶同工酶試驗溶液(P∶S)＝(10∶0)，(P∶S)＝(9∶1)，(P∶S)＝(8∶2)，(P∶S)＝(7∶3)，(P∶S)＝(6∶4)，(P∶S)＝(5∶5)，(P∶S)＝(4∶6)，(P∶S)＝(3∶7)，(P∶S)＝(2∶8)，(P∶S)＝(1∶9)和(P∶S)＝(0∶10)。
(e)差示測定試驗將1.0ml偶合酶溶液與250μl每種α-澱粉酶同工酶試驗溶液混合併將混合物溫熱至37℃保持1分鐘後，加入2.0mlN3G5-CNP溶液或N3G5-CNP和DOG3的混合溶液並溫熱至37℃保持2.5分鐘以在400nm處測定吸收度(△OD)。用250μl蒸餾水代替α-澱粉酶同工酶試驗溶液進行空白試驗以得到T和W值。用得自混合前活性和混合比的活性值作為理論活性，用得自通過用Kp，Ks，a，b，T和W值替代公式(3)和(4)的計算的值作為計算活性(實測值)。試驗結果示於表1中。活性單位為IU/升。

從表1看出計算(實測)值和理論值具有高度相關性。
實施例2α-澱粉酶活性的差示定量測定是用具有α-澱粉酶活性的人血清進行的。
(1)按照本發明的方法(雙道法)的差示測定(a)底物(N3G5-CNP)的製備，(b)底物(N3G5-CNP)和抑制劑(DOG3)混合物的製備，和(c)偶合酶溶液的製備都是按與實施例1(4)的(a)-(c)中相同的方法進行的。
(d)α-澱粉酶試驗溶液具有α-澱粉酶活性的人血清(50個樣品)。
(e)差示定量測定除了用250μl人血清代替α-澱粉酶同工酶試驗溶液外按與實施例1(4)的(e)中相同的方法進行操作。用在此得到的Kp，Ks，a和b以及T和W值替代公式(3)和(4)得到P和S值(IU/升)。
(2)使用麥芽抑制劑的方法(a)底物(N3G5-CNP)溶液和(b)α-澱粉酶試驗溶液的製備與上述(1)中的(a)和(b)相同。
(c)偶合酶和麥芽抑制劑混合物的製備將1小瓶麥芽抑制劑[Seikagaku公司生產，8AIU(1AIU是指足以抑制50%人S型澱粉酶的量(2單位/升))(藍色澱粉法)]溶解於50ml按與實施例1(1)的(b)中相同的方法製備的偶合酶溶液中。
(d)差示定量測定將1.0ml(c)中製備的混合溶液與250μl人血清混合併溫熱至37℃保持1分鐘。將N3G5-CNP溶液(2.0ml)摻混於所說的混合物中並溫熱至37℃保持2.5分鐘，此後測定在400nm處的可變吸收度(△OD)2分鐘。用250μl蒸餾水代替α-澱粉酶試驗溶液進行空白試驗，用此方法得到W值。
另一方面，除了用1.0ml偶合酶溶液本身代替(c)中的混合溶液外按照如上所述相同的方法進行操作，用此方法得到T值。
在麥芽抑制劑方法中的Kp，Ks，a和b值作為測定結果為1.1×10-3，1.1×10-3，0.262和0.726。用這些值以及用此方法得到的T和W值替代公式(3)和(4)得到P和S值(IU/升)。
(3)用本差示測定法得到的P值和用麥芽抑制劑法得到的P值示於圖2中。結果發現這兩個P值的相關性為r＝0.989，Y＝0.962X-1.469，這兩種方法彼此間完全一致。
(4)使用其它α-澱粉酶試驗溶液的本差示測定法和麥芽抑制劑法的測定誤差的比較按照與上述(1)和(2)中的差示測定法相同的方法測定了P型α-澱粉酶活性，不同之處在於用Enzyme Reference[人α-澱粉酶的商品名(P型α-澱粉酶∶S型α-澱粉酶＝1∶1)，Wako PureIndustries，Ltd.生產]代替人血清以比較這些方法的測定誤差。結果示於表2中。

從表2中的偏離係數可以看出α-澱粉酶同工酶活性能夠按照本方法進行差示測定，與麥芽抑制劑法相比其測定誤差小，精確度高。
實施例3(1)G5-CNP的Km值，反應速率常數Kp和Ks及DOG3的抑制常數a和b的測定G5-CNP的Km值和反應速率常數(Kp和Ks)及DOG3的抑制常數a和b是按實施例1的方法測定的，不同之處在於用市售的G5-CNP[Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.生產]代替N3G5-CNP作為測定α-澱粉酶的底物並用406單位/升α-葡糖苷酶[Toyobo Co.，Ltd.生產]代替葡糖澱粉酶作為偶合酶。
結果，G5-CNP的Km值，Kp和Ks分別為0.45mM，1.2×10-3和1.2×10-3，DOG3的濃度為0.50mM時a和b分別為0.617和0.141。
(2)差示定量測定(a)底物G5-CNP溶液的製備除了用3.25mM上述的G5-CNP(終濃度為2.0mM)代替N3G5-CNP外按與實施例1(4)的(a)中相同的方法製備底物G5-CNP溶液。
(b)底物(G5-CNP)和抑制劑(DOG3)混合溶液的製備按照與實施例1(4)的(b)中相同的方法製備底物(G5-CNP)和抑制劑(DOG3)的混合溶液，不同之處在於用3.25mM(終濃度2.0mM)的上述G5-CNP代替N3G5-CNP並使用濃度為0.81mM(終濃度0.50mM)的DOG3。
(c)偶合酶溶液的製備除了用406單位/mlα-葡糖苷酶[Toyobo Co.，Ltd.生產]代替葡糖澱粉酶外按與實施例1(4)的(c)中相同的方法製備偶合酶溶液。
(d)α-澱粉酶試驗溶液具有α-澱粉酶活性的人血清(50個樣品)。
(e)差示定量測定試驗除了用上述(a)-(d)中的溶液代替實施例1中(4)的(a)-(d)外按與實施例1(4)中相同的方法進行差示測定。
(3)用N3G5-CNP作為底物溶液的差示測定除了用上述(d)中的α-澱粉酶試驗溶液代替實施例1(4)的(d)中的α-澱粉酶同工酶試驗溶液外按與實施例1(4)中相同的方法進行差示測定。
(4)用通過上述程序(2)和(3)中的差示測定法得到的P值繪製的圖示於圖3中。結果發現P值的相關性為r＝0.986，Y＝0.974X+1.155，這兩種方法彼此間完全一致。
此外，圖3中的G5-CNP法和N3G5-CNP法是指分別在(2)和(3)中所述的差示測定法。
實施例4(1)用雙動力學法(單測定法)測定T和W的方法(a)α-澱粉酶試驗溶液具有α-澱粉酶活性的人血清(70個樣品)(b)底物(N3G5-CNP)溶液的製備將N3G5-CNP溶於含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中使得底物的濃度為3.25mM(終濃度2.0mM)。
(c)偶合酶溶液的製備按照實施例1(1)的程序(b)的方法製備偶合酶溶液，不同之處在於使用濃度分別為181單位/ml和18.1單位/ml的葡糖澱粉酶和β-葡糖苷酶。
(d)DOG3溶液的製備將上述的DOG3溶解於含有40mM NaCl和2mM MgCl2的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中使得其濃度為10.73mM(終濃度為0.33mM)。
(e)差示定量測定攪拌0.9ml偶合酶溶液和250μl每種人血清的混合物並於37℃溫熱1.0分鐘，然後混入2.0mlN3G5-CNP溶液。得到的混合物於37℃溫熱1.0分鐘，測定在400nm處的可變吸收度(△OD)2分鐘。30秒鐘後，進一步將0.10ml DOG3溶液加入到測定體系溶液中。將得到的混合物於37℃溫熱1.5分鐘，測定在400nm處的可變吸收度(△OD)2分鐘。用250μl蒸餾水代替α-澱粉酶試驗溶液進行空白試驗以測定T'和W'。
在這種情況下，T＝T'×3.15/3.25接著，通過用在實施例1中得到的Kp，Ks，a和b值以及在該程序中得到的T和W值替代上述的公式(3)和(4)計算P和S值(IU/升)。
(f)用所得到的P值和用實施例2(1)的方法(雙道法)得到的P值繪製的圖示於圖4中。結果發現P值的相關性為r＝0.9995，Y＝0.994X-0.415，這兩種方法彼此間完全一致。
換句話說，本方法是這樣一種方法，即能夠在一次測定中以良好的精確度對α-澱粉酶同工酶進行差示測定，能夠以在雙道法中用量的半量測定底物和偶合酶，因此從經濟角度看它也是一種優異的方法。
權利要求
1.一種α-澱粉酶同工酶活性的差示測定法，該方法是利用通過將用於測定α-澱粉酶活性的底物與樣品反應而得到的α-澱粉酶活性測定值和通過將同樣的底物與樣品在抑制劑存在下反應而得到的α-澱粉酶活性測定值，該抑制劑對兩種α-澱粉酶同工酶具有不同的抑制常數，該方法包括用下式所示的63-脫氧麥芽三糖[O-6-脫氧-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖]作為抑制劑
2.根據權利要求1的方法，其中所說的α-澱粉酶是人α-澱粉酶，兩種α-澱粉酶同工酶是衍生於胰液的α-澱粉酶和衍生於唾液腺的α-澱粉酶。
3.根據權利要求2的方法，其中式(Ⅰ)所示的63-脫氧麥芽三糖在α-澱粉酶活性測定體系中的濃度為0.01-10mM。
4.根據權利要求1的方法，其中所說的差示測定法是雙動力學法或雙道法。
5.根據權利要求1的方法，其中所說的用於測定α-澱粉酶活性的底物是下列通式所示的麥芽低聚糖衍生物 其中R代表氫原子，芳香生色基團或除葡萄糖之外的糖基，R1和R2可以是相同的或不同的，代表滷原子，羥基，疊氮基，醯氧基，烷氧基，芳氧基，烷基磺醯基，芳基磺醯基，烷基巰基，芳基巰基，N-烷基氨基甲醯氧基，N-芳基氨基甲醯氧基，烷氧甲氧基或芳氧甲氧基，或R1和R2一起形成取代的或未取代的亞甲基二氧基，n表示1-6的整數。
6.根據權利要求5的方法，其中所說的通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物是麥芽五糖，麥芽七糖，2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基45，65-二-O-(N-乙基)氨基甲醯-β-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基45，65-二-O-甲氧甲基-β-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基67-氯-67-脫氧-β-D-麥芽七糖苷，2-氯-4-硝基苯基α-D-麥芽三糖苷，4-硝基苯基65-O-苄基-α-D-麥芽五糖苷，2-氯-4-硝基苯基45，65-O-亞苄基-β-D-麥芽五糖苷，酚靛-3'-氯苯基65-O-甲苯磺醯-β-D-麥芽五糖苷，65-氯-65-脫氧-D-麥芽五糖或1-(46-O，66-O-二甲磺醯-α-麥芽六糖基)-α-D-葡糖醇。
7.根據權利要求6的方法，其中所說的通式(Ⅱ)所示的麥芽低聚糖衍生物是2-氯-4-硝基苯基65-疊氮基-65-脫氧-β-D-麥芽五糖苷或2-氯-4-硝基苯基β-D-麥芽五糖苷。
8.根據權利要求5的方法，其中衍生於人胰液的α-澱粉酶和衍生於人唾液腺的α-澱粉酶之間的反應速率與所說的底物之比為0.6或更大。
全文摘要
一種用抑制劑法對α-澱粉酶同工酶活性進行差示測定的方法，其中用上式所示的文檔編號C12N9/99GK1106068SQ9411717
公開日1995年8月2日 申請日期1994年10月19日 優先權日1993年10月20日
發明者內田理一, 德武昌一, 山次信幸, 本山義則, 細井健二 申請人:龜甲萬株式會社, 第一化學藥品株式會社