植物降解材料的合成和應用的製作方法

2023-04-27 21:26:21

專利名稱：植物降解材料的合成和應用的製作方法
植物降解材料的合成和應用
背景技術：
用於合成纖維素乙醇的生物質，其組成和多樣性取決於高濃度下多酶體系所釋 放出的用於製備纖維素乙醇的糖。目前所有用於合成纖維素乙醇的酶均通過價格昂貴的 發酵系統製得，並採用與胰島素等生物製藥類似的工藝進行純化。因此，用於生產乙醇 的試劑級酶價格極其昂貴。如目前Sigma產品目錄上Novozyme公司銷售的0 -葡萄糖 苷酶、果膠酶和纖維素酶，其價格分別為12.4萬美元/kg、41.2萬美元/kg和4.049萬美 元/kg。在未標註酶成分的情況下，上述酶被添加到生物煉廠的配方中。因此，大批量 銷售的酶的真實價格難以估算。酶生產纖維素乙醇的成本預計為2 3美元/加侖，這 導致大規模應用的成本顯著提高。除此之外，目前發酵系統的產能仍較為有限。隨著對 酶需求量的不斷增加及有限產能之間的矛盾日益突出，酶的價格有望進一步提高。制約生物質轉化為乙醇發展的主要原因在於生產成本過高，而水解過程又需大 量酶的參與。目前Sigma目錄上Novozyme公司銷售的或其他公司生產的0 -葡萄糖苷 酶、果膠酶和纖維素酶，其價格分別為12.4萬美元/kg、41.2萬美元/kg和4.049萬美元 /kg。因此，美國能源部早就指出酶的價格及相對於絕大多數木質纖維素原料而言較高的 負荷水平是纖維素乙醇生產的主要障礙。目前，所有市售酶均採用發酵工藝製備，但發 酵工藝的裝置建造和維護費用高昂，通常需5 9億美元的預投資。而取代生產成本高 昂的發酵工藝的批量生產工藝尚未出現。本發明即闡述了這一領域的市場空白。


圖1 (a)為葉綠體16S trnl/trnA片段圖示。轉基因被植入菸葉葉綠體基因組的 tml/tmA間區。(b)葉綠體轉化載體圖示。感興趣的基因(GOI)為celD、celO、pelA、 pelB、pelD、角質酶、lipY、egll、egl、swol、xyn2、axel 或 bgll。Prrn、rRNA 啟雲力 子促進劑；aadA、氨基糖苷_3』 _腺苷醯(基)轉移酶基因抵抗奇黴素；5' UTR、促 進劑和psbA基因的5 『未翻譯區；3 『 UTR、psbA基因的3 『未翻譯區。(c)經由pelB 印跡法所進行的轉基因整合和同型異源性評估。(d)pelD和(e)celD葉綠體轉基因線與側 序列探針雜交(1未轉化；2 4葉綠體轉基因線)。(f)未轉化的顯型(UT)和在溫室生 長的葉綠體轉基因線均顯示正常生長。圖2蛋白質印跡分析和葉綠體轉基因線定量分析。葉綠體轉基因線的蛋白質印 跡表達為(a) PelB或(b) PelD。UT 未轉化成熟葉片在10AM，2PM, 6PM和10PM進 行採摘；5ng、10ng和25ng: PelA純化的蛋白質，未成熟、成熟和舊葉片。(c)PelB和 PelD(c)或CelD的酶單元(d)不同年份或採摘時間下的葉片，其質量為lg或100mg。圖 3 基材、pH、溫度和輔因子對 cpPelB、rPelB、cpPelD、rPelD、rCelD 和 cpCelD酶活性的影響。(a)PGA濃度增長對果膠酸裂解酶活性的影響。(b)無CaCl2存 在下，pH對果膠酸裂解酶活性的影響以及(c)CaCl2#在下，pH對果膠酸裂解酶活性的影 響。所用緩衝溶液如下50mM磷酸鹽緩衝溶液(pH 6-7)，Tris緩衝液(pH 8)，甘氨酸 /NaOH緩衝溶液(pH 9)以及CAPS緩衝溶液(pH 10.0)，含有從植物和腸埃希氏菌所獲得的含有4 ii g TSP的PelB和PelD。以2.5mg/ml PGA為基材，在40°C下對最佳pH進行 測定。(d)無CaCl2存在下，pH = 8.0時溫度(30-70°C )對酶活性的影響和(e)CaCl2存 在下，pH = 8.0時溫度(30-70°C )對酶活性的影響。(f)為cpCelD和rCelD活性在60°C CMC (2 % )情況下進行30分鐘的pH值最優化。依據最大活性，cpCelD和rCelD的相 對活性(％ )分別為 25 u g/ml 和 10 u g/m。 (g)在 pH = 6.0，CMC (2% )下進行 30min 研究溫度升高對cpCelD和rCelD相對活性的影響。依據最大活性，cpCelD和rCelD的 相對活性(％ )分別為25 u g/ml和10 u g/m。 (h)長期酶水解中通過，分別採用lOmM CaCl2和20 u g/ml BSA或上述兩種溶液或50mM醋酸鈉的混合溶液對cpCelD (25 u g TSP/ ml反應)活性提高進行研究。上述水解在CMC (2% )存在下於60°C，pH = 6.0的條件 下反應36小時。圖4含不同蛋白質濃度的粗提取物中腸埃希氏菌VS葉綠體衍生酶。(a)採用 羧甲基纖維素(2% )為基材時的cpCelD和rCelD的酶反應動力學。反應混合物中含 有10mM CaCl2和50mM醋酸鈉緩衝溶液，且cpCelD和rCelD TSP ( U g/ml)濃度不斷增 加，pH = 6.0。酶水解反應在60°C下進行30分鐘。插圖為cpCelD TSP含量(P g/ml) vs CMC(2% )時的酶反應動力學飽和點。插圖中裝有反應混合物的離心管為1未轉化 植物，2和3 rCelD和cpCelD 10 ug TSP。 (b)以5.0mg/ml多聚半乳糖醛酸鈉為基材， cpPelB、cpPelD、rPelB和rPelD對水解反應的影響。反應混合物溶於20mM Tris_HCl緩 衝溶液(pH = 8.0)，且 cpPelB、cpPelD、rPelB 和 rPelD (u g/ml)的濃度不斷增加。依 據D-半乳糖醛酸標準圖譜採用DNS方法測定多聚半乳糖醛酸鈉(Sigma)。酶水解反應 在40°C下，以150rpm的震蕩速度反應2小時。圖5濾紙、深加工木及桔皮所用的多酶混合物。(a)pH = 5.5，50°C下， 採用Whatman公司1號濾紙條(50mg/ml測定法)測定濾紙活性。多酶混合物中含 有 rEgl (100 y g/ml)、rBgll (200 u g/ml) > rSwol (120 u g/ml) > rCelO (100 u g/ml)和 cpCelD (100 u g/ml)的粗提取物。樣品在 10mM CaCl2 禾口 20 ii g BSA 中，以 150rpm 的震蕩速度培養24小時。(b)深加工木樣品(200mg/5ml反應)的水解反應採用 含有 cpPelB(250iig/ml)、cpPelD (250 u g/ml) (pH = 8.0), cpCelD (200 u g/ml) > cpXyn2 (200 ii g/ml)、rEgl (100 y g/ml)、rBgll (200 u g/ml) > rSwol (120 u g/ml) > rCelO (100 u g/ml)、rAxel (100 u g/ml)、rPelA(200 u g/ml)、rCutinase (50 u g/ml)、 rLipY(100 u g/ml)粗提取物的多酶混合物。含有10mM CaCl2和20 u g/ml BSA的反應 混合物以150rpm的震蕩速度反應36小時；pH(5.5-8.0)和反應溫度(40°C -50°C )依據 最佳條件進行調整。反應所釋放出的等當量葡萄糖的終點採用DNS方法進行測定。(c) 瓦倫西亞桔皮水解(200mg/5ml 反應)在含有 cpPelB (250 u g/ml)、pPelD (250 u g/ml)、 cpCelD (100 u g/ml)禾口 cpXyn2 (100 ii g/ml)、rEgl (100 u g/ml) > rBgll (200 u g/ml) > rSwol (120 ii g/ml)、rCelO (100 u g/ml)禾 P cpCelD (100 u g/ml) > rAxe2 (100 u g/ml) > rCutinase (50 u g/ml)、rLipY (100 u g/ml)和 rPelA (200 u g/ml)粗提取物的多酶混合物 中進行。還原糖的終產物採用DNS法進行分析31，D-葡萄糖和D-半乳糖醛酸為標準 物。加入100y g/ml氨苄青黴素和卡那黴素以避免水解過程中的微生物生長。樣品在 10mMCaCl2和20 u g/ml BSA中，以150rpm的震蕩速度培養24小時；pH (5.5-8.0)和反 應溫度(40°C -50°C )依據最佳條件進行調整。所有實驗中對不含酶的基材或無基材的酶進行控制。所有實驗和分析均平行進行三次。圖6市售葉綠體轉基因菸草的生成(A)CelD LAMD芽根部(B)溫室中培養的 CelD LAMD葉綠體轉基因植物(C)正常開花的CelD LAMD葉綠體轉基因植物(D)CelD TN90 首次轉化株(E)CelD TN90 的第二次再生株(F) PelBTN90 (G-I)根部，PelB LAMD 的第一、第二和第三再生株(J)PelD LAMD芽根部(K)溫室培養的PelD LAMD葉綠體轉 基因植物(L)正常開花的PelD LAMD葉綠體轉基因植物(M)實施例1中LAMD芽根部 (N)實施例1中LAMD盆栽葉綠體轉基因植物。圖7採用菸草側探針DNA雜交技術對同型異源性進行驗證(A) CelDLAMD (B) PelB LAMD (C) PelB TN90 (D) PelD LAMD 和(E)實施例 1 的 LAMD (UT 未轉化植物；
數字葉綠體轉基因線和B:空白)。圖8哈瓦那雪茄、TN90和LAMD菸草中果膠裂解酶B和D的酶活性(A) PelB(B)PelD注用於分析TN90和LAMD菸草酶活性的葉片採摘自體外植物，而哈瓦那 雪茄所用的葉片採摘自溫室。由於轉基因由psbA通過光線和發育調控元件進行控制，當 轉入溫室後，市售品種的表達水平較高。圖9為一些植物降解複合基因的序列信息。

發明內容
針對上述技術難題，本發明所述實施例從植物或細菌或植物和細菌中製備出所 需酶，大幅度降低了發酵和純化成本。在一個具體實施例中闡述了製備降解生物質樣 品，進而生成可發酵性糖的方法。上述方法包括製備含有至少兩種細胞提取物的植物降 解多酶混合物，每種細胞提取物均含有活性植物降解化合物，並在獲得上述細胞提取物 的細胞中重組表達。上述至少兩種細胞提取物為植物提取物或細菌提取物，或植物和細 菌提取物。植物降解多酶混合物與生物質樣品進行混合生成可發酵性糖。在一個更為具 體的實施例中，含有細胞提取物的植物降解多酶混合物為植物降解酶，如纖維素酶、木 質素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸 裂解酶、脂肪酶、麵包酶、果膠酶或有助於進入上述酶的化合物，或稱輔助植物降解化 合物，包括但並不限於角質酶或擴展蛋白(如裡氏木酶)。本發明作者發現輔助植物降解 化合物可輔助植物降解酶，進而增加生物質樣品中可發酵性糖的產量。絕大部分植物細胞提取物含有一定量的1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 (加氧酶)，而上述加氧酶來源於獲得植物細胞提取物的細胞。加氧酶是地球上最常 見的酶，約佔葉綠體中可溶蛋白質的30 50%，可固二氧化碳，但加氧酶的活性嚴重 抑制光和作用及作物產量(Ogren，W.L. (2003)Photosynth.Res.76, 53-63，2.Spreitzer， R.J.& Salvucci，M.E. (2002) Annu.Rev.Plant Biol.53, 449-475)。加氧酶含有 8 個較大的 亞單元(LSUs)和8個較小的亞單元(SSUs)。SSU從胞液中輸入，在合併為功能性全 酶前，兩種亞單元進行幾次轉譯後修飾(Houtz，R.L.& Portis, A.R. (2003) Arch.Biochem. Biophys.414, 150-158)。由於表達蛋白質嚴重影響植物壽命和生長，因此植物基因轉化通常不被視為對 生成植物降解酶的傳統發酵過程的可行性取代。本發明作者設計了一種合成不影響植 物細胞表達的植物降解酶的方法。本發明首次證實了植物中可行性植物降解酶的表達。本發明作者同時認為在不影響植物的前提下，許多生物降解酶的表達均可在葉綠體中實 現。葉綠體的存在可使植物細胞免於酶的破壞。儘管此處只列舉了葉綠體中的表達，除 非特別說明，否則本發明實施例並不僅限於植物降解酶的葉綠體表達。某些實施例採用 了可重組表達植物降解化合物的植物和細菌提取物。此處所用的「重組表達」是指從與細胞異源的多核苷酸合成多肽，且上述多核 苷酸在上述細胞中轉染。重組表達可能來源於可在細胞基因組中或細胞器基因組或僅通 過轉染而存在於細胞之中的穩定轉化的異源多核苷酸。廣義的葉綠體包括所有質體，包含元質體、黃化質體、成熟葉綠體和有色體。完整的纖維素酶體系包含內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡萄糖苷酶。 內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶協同作用將纖維素降解為纖維二糖，纖維二糖隨後加 氫，在葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖。纖維二糖酶或葡萄糖苷酶的活性決定纖 維二糖轉化為葡萄糖的反應，且通過減輕對終產物的抑制(纖維二糖)在纖維素降解過程 中起重要作用。絕大部分這些來源於不同微生物體的酶的基因序列列於公共資料庫中。果膠或果膠質是異源、接枝、高度水合的多糖的總稱，且果膠為植物細胞壁的 主要成分。這些多糖含有天然糖類，如阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。活性 蛋白質酶可製備下列酶兩種a-L-鼠李水解酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、內果 膠酸鹽裂解酶(果膠基質)、果膠裂解酶和較少含量的木聚糖酶。果膠降解酶、木聚糖酶 和纖維素酶的核苷酸序列列於公共資料庫。實施例9中討論了一個序列。本發明作者認為用於製備纖維素乙醇的每種生物質所需的酶各不相同。因此， 本發明所述實施例中涉及來源於植物表達和/或細菌表達中的多酶混合物，上述多酶混 合物對生物質極其有效。乙醇生產中所需的降解生物質及其權利要求，包括但並不限於穀類，如玉米、 小麥、黑麥、大麥和上述穀物殘留物(主要殘留物為秸稈、葉片和夾殼)、甜菜、甘蔗、 草類如柳枝稷和細葉芒，木類如楊樹、桉樹、柳樹、美洲楓香樹和刺槐以及森林廢物 (如鋸木廠的碎片和鋸末)。其他生物質可能包括，但不限於，水果，如柑橘及其殘留 物，如桔皮等。本發明中菸草作為表達植物降解酶的示例植物。但是，除非特別說明，本發明 實施例不局限於菸草。本發明所述基因表達可應用於多種植物，包括，但並不局限於 菸草、生菜、菠菜、向日葵，豆科作物如黃豆、大豆、豌豆和苜蓿、番茄、土豆、胡蘿
卜、甜菜、十字花科、纖維作物如棉花，園藝作物如非洲菊和菊花，油菜和亞麻籽。在一個具體實施例中，黑麴黴、棘孢麴黴、裡氏黑黴和/或熱纖梭菌中可解碼 不同酶的基因通過基因特異性引物而相互隔離。為了在感興趣的葉綠體內表達不同的 酶，採用以下方法含有葉綠體基因組側翼序列的葉綠體載體有助於同源重組。在一個 具體實施例中，外源基因單獨在葉綠體基因組區域進行整合。不同酶的解碼序列經由適 當的調控基因進行調控。重組質體進攻菸草生成葉綠體轉基因植物。在一個具體實施例中，粉末狀菸草葉片作為酶源，對生物質生成乙醇進行評 估。在一個更為具體的實施例中，生物質源為穀物，如玉米、草類或柑橘殘留物。相對於轉基因葉綠體而言，同型異源性葉綠體對轉化更為有利。轉基因整合和 同型異源性分別經PCR和DNA雜交技術證實。轉基因標準經蛋白質分析證實，且經ELISA定量分析。從轉基因葉綠體菸草植物提取的蛋白質，對其降解柑橘廢物生物質的 穩定性進行了測試。根據以上實驗結果，可加入更多酶以提高植物生物質轉化為用於發 酵生成乙醇所需的糖類。每種用於生成酶的菸草植物可生成1百萬個種子，播種於100 英畝。同源植物質，如粉末狀菸草葉片或植物提取物，或經由植物質而來的經純化的酶 可作為酶源對柑橘廢物轉化為乙醇進行評估。本發明包含將異源基因安放於植物細胞核內，CT轉化位於菸草植物細胞中的約 100個葉綠體基因組。每個菸草植物葉綠體含有約100個葉綠體基因質的複製，這使得蛋 白質數量(酶蛋白質將生物質轉化為糖類，進而用於生產乙醇)以指數形式增加。這也是 通過細胞壁降解酶生產纖維素乙醇價格昂貴的主要原因。菸草中含有大量生物質(40噸 葉片/英畝)，在佛羅裡達地區生長季內可收穫幾次。同時，如前所述，採用單一菸草播 種100英畝較為容易。最後，由於葉綠體具有遺傳母源性，其在菸草花粉中無功能性。在一個具體實施例中描述了一種降解植物生物質生成可發酵性糖類的方法。該 方法包括製備含有至少一種葉綠體基因組或可解碼纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷 酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、果膠 酶中的一種或幾種的基因片段的植物降解多酶混合物，其中上述植物質含有纖維素酶、 木質素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠 酸裂解酶、脂肪酶、澱粉酶、麵包酶、果膠酶或擴展蛋白中的一種或幾種，且上述酶在 獲得上述植物質的植物中表達；上述植物降解質與上述生物質樣品混合。在一個更為具 體的實施例中，酶或酶混合物的含量為植物質中總蛋白質含量的0.1%以上。在一個具體實施例中描述了一種降解植物生物質生成大量可發酵性糖類的方 法，該方法包括製備含有至少一種可解碼纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶、半纖 維素酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、澱粉酶、面 包酶、果膠酶或擴展蛋白中的一種或幾種的葉綠體的植物；採摘上述植物；加工上述植 物，生成適於混合和降解生物質樣品的酶。在一個更為具體的實施例中，上述植物為煙 草、生菜、菠菜、向日葵；纖維類植物如棉；園藝作物如非洲菊和菊花；豆科作物如黃 豆、大豆、豌豆和苜蓿、番茄、土豆、甜菜、十字花科如油菜和亞麻籽。在一個更為具 體的實施例中，植物為菸草。本發明的目的在於提供一種來源豐富、價格低廉的酶用於生物質降解。含有表 達植物降解化合物的植物或細菌經乾燥和粉末化處理。在一個具體實施例中，從植物和/ 或細菌中製備粗液體提取物。在另一個具體實施例中，植物降解質可為完全或部分純化 的酶，上述酶在植物和/或細菌中表達。由於植物降解質為幹態或植物和/或細菌質粗 提取物，這使得操作時間大大縮短，並避免了價格昂貴的淨化步驟。因此，與傳統植物 降解和發酵工藝相比，植物質的保存時間增加，且更易與植物生物質樣品混合。在一個具體實施例中，製備植物的方法為製備葉綠體轉化為表達第一種酶的 第一種植物和製備葉綠體轉化為表達第二種酶的第二種植物。從第一種和第二種植物制 備的植物質可進行混合，進而生成包含至少一種植物降解酶的植物降解樣品。在另一個 具體實施例中，製備植物的方法至少含有下列兩步製備含有表達纖維素酶的葉綠體的 第一種植物，製備含有可表達木質素酶的葉綠體的第二種植物，製備含有可表達葡 萄糖苷酶的葉綠體的第三種植物，製備含有可表達半纖維素酶的葉綠體的第四種植物，製備含有可表達木聚糖酶的葉綠體的第五種植物，製備含有可表達a-澱粉酶的葉綠體 的第六種植物，製備含有可表達澱粉葡糖苷酶的葉綠體的第七種植物，製備含有可表達 果膠酸裂解酶的葉綠體的第八種植物，製備含有可表達角質酶的葉綠體的第九種植物， 製備含有可表達脂肪酶的葉綠體的第十種植物，製備含有可表達麵包酶的葉綠體的第 十一種植物，製備含有可表達果膠酶的葉綠體的第十二種植物和/或製備含有可表達擴 展蛋白的葉綠體的第十三種植物(如裡氏木酶)。如上所述，本發明作者認為在某些具體實施例中，從植物中獲得的酶增加了在 細菌中重組表達的植物降解酶。因此，植物降解多酶混合物可以包括在植物中重組表達 的酶和在細菌中重組表達的酶，如但並不限於腸埃希氏菌。在一個具體實施例中，用於降解植物生物質的植物質，上述物質包括至少一種 葉綠體基因組或可解碼纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、 a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、澱粉酶、麵包酶、果膠酶或擴展 蛋白中的一種或幾種的異源基因的基因片段；上述植物質含有纖維素酶、木質素酶、
葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、 脂肪酶、澱粉酶、麵包酶、果膠酶或擴展蛋白中的一種或幾種。在一個更為具體的實施 例中，植物質包括以下兩種第一種葉綠體基因組或可解碼纖維素酶的異源基因的基因 片段。第二種葉綠體基因組或可解碼木質素酶維異源基因的基因片段，第三種葉綠體基 因組或可解碼葡萄糖苷酶的異源基因的基因片段，第四種葉綠體基因組或可解碼半 纖維素酶的異源基因的基因片段，第五種葉綠體基因組或可解碼木聚糖酶的異源基因的 基因片段，第六種葉綠體基因組或可解碼a-澱粉酶的異源基因的基因片段，第七種葉 綠體基因組或可解碼澱粉葡糖苷酶的異源基因的基因片段，第八種葉綠體基因組或可解 碼果膠酸裂解酶的異源基因的基因片段，第九種葉綠體基因組或可解碼脂肪酶的異源基 因的基因片段，第十種葉綠體基因組或可解碼澱粉酶的異源基因的基因片段，第十一種 葉綠體基因組或可解碼麵包酶的異源基因的基因片段，第十二種葉綠體基因組或可解碼 果膠酶的異源基因的基因片段，以及第十三種葉綠體基因組或可解碼擴展蛋白的異源基 因的基因片段(如裡氏木酶)。在另一個具體實施例中，含有植物細胞的植物，其中上述植物細胞其纖維素 酶、木質素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、 果膠酸裂解酶、脂肪酶、澱粉酶、麵包酶、果膠酶或擴展蛋白中的一種或幾種的含量高 於一般含量；上述植物質含有纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶、半纖維素酶、木 聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、澱粉酶、麵包酶、果膠酶 或擴展蛋白中的一種或幾種以及活性酶。在一個具體實施例中，酶或混合酶的含量為細 胞中總蛋白質含量的0.1%以上。在另一個具體實施例中，酶或混合酶的含量為細胞中總 蛋白含量的以上。在一個具體實施例中，植物中含有纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶、半纖 維素酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、脂肪酶、澱粉酶、麵包 酶、果膠酶和/或裡氏木酶以及一定量的加氧酶。在一個具體實施例中，加氧酶和酶的 比例為99 1 1 99。在一個具體實施例中，重組表達一種或幾種植物降解化合物的市售品種。市售菸草品種，如但並不限於LAMD和TN90，較實驗品種具有更多的葉片。然而，市售品 種對異源基因更為敏感。經過反覆實驗，本發明作者成功對細胞進行轉染，並對市售品 種中植物降解化合物進行表達。
具體實施例方式實施例1 構建葉綠體表達框架tail和trnA基因間轉錄活性區域用於轉基因整合(圖la)。PCR顯示了各種感興 趣基因(GOI)，包括來自於熱纖梭菌基因組DNA的內切葡聚糖酶(celD)、外切葡聚糖酶 (celO),來自於結核分枝桿菌基因組DNA的脂肪酶(lipY)，來自於苜蓿根腐病菌的果膠 酸裂解酶(pelA，pelB, pelD)和角質酶。使用一種基於新型PCR的方法，在未使用來源 於裡氏木酶基因組DNA內含子(範圍為1 5)的前提下，克隆包括內切葡聚糖酶(egll 和egl)、裡氏木酶(swol與擴展蛋白相同)、木聚糖酶(xyn2)、乙醯木聚糖酯酶(axel)和
葡萄糖苷酶(bgll)在內的GOI的解碼序列。採用每種GOI製備菸草葉綠體轉化載體 (圖lb)。所有的葉綠體載體都含有用於將同源重組為倒向重複區域的葉綠體基因組16S trnl/trnA側翼序列和抑制奇黴素的aadA基因。aadA基因由rRNA操縱促進劑和GGAGG 核蛋白體結合位點控制。GOI由psbA促進劑和5' UTR控制，以此獲得較高水平的表 達。3' UTR位於控制轉錄穩定的GOI末端。實施例2 表達果膠酸裂解酶(PelB & PelD)和內切葡聚糖酶(CelD)的葉綠體轉 基因菸草的製備和表徵葉綠體轉基因植物採用如前所述方法製備28』 29。採用DNA雜交分析技術對 pLD-pelB, pLD-pelD和pLD-celD盒整合入葉綠體基因組進行驗證，以確定其同型異源 性。採用從未轉化和葉綠體轉化線和植物總DNA進行消化，當與[32Ph標記的tml-trnA 探針進行雜化，生成4.014kb的未轉化片段(UT)或6.410kbpelB，6.377kb pelD或7.498kb celD片段，這證實了轉基因特定點整合入位於tail和trnA基因間的區域(圖lc-e)。此 外，葉綠體轉基因線中4.014kb片段的缺失也證實了同型異源性(在可檢測範圍內)。而 與未轉化植物相比，顯型葉綠體轉基因線也較正常。(培養的花朵和種子，圖If)。帶有PelA抗體的表明PelB和PelD為PelA免疫30。因此，儘管其葉綠體轉基 因線的相似性各不相同，PelA抗體仍用於檢測PelB和PelD表達。所有的葉綠體轉基因 線均顯示PelB或PelD蛋白質表達。儘管PelB和PelD由光線調控，但依據收穫時間， 與酶活性相對應的表達水平並未發生顯著變化(圖2a，b)。這可能是因為PelB、PelD和 PelA抗體的抗原表位相似性不同造成的。酶濃度隨葉片成熟度略有降低(圖2a，b)。實施例3 :不同採摘時間和葉片成熟度下的果膠酸裂解酶(PelB，PelD)和內切 葡聚糖酶(CelD)酶活性隨葉片成熟度和採摘時間而顯著變化。PelB、PelD和CelD成熟葉片的酶 活性最高，老葉片中的酶活性下降(圖2c，d)。在6PM採摘的成熟葉片，其PelB和PelD 均顯現出最高酶活性，而10PM採摘的葉片，其CelD顯現出最高活性(圖2c，d)。這 可能是由於植物提取物中內切葡聚糖酶對蛋白酶的穩定性增加的原因。在室溫儲存時， cpCelD在植物提取物中的活性並未顯著降低，可保持超過30天(數據未列出)。根據IUPAC協議32，採用DNS試劑31對CelD酶活性進行計算。對於從10PM採摘的成熟葉片所製備的粗提取物而言，採用2% CMC計算的cpCelD活性為493unitS/mg 總可溶蛋白質(TSP)或lOOmg葉片組織。採用葡萄糖專用的葡萄糖激酶測定法，當分別 採用5%微晶纖維素和sigmacell溶液為基材時(pH = 6.0，60°C )，測得活性為4.5units/mg TSP和6.28units/mg TSP。採用相同基材測得的市售纖維素酶(裡氏木酶，EC 3.2.1.4， Sigma)活性為 4.2units/mg 和 3.43units/mg。圖 2c 和 2d 表明每 g 在 6PM 或 10PM 採摘 的成熟葉片約可獲得26單位、32單位和4930單位的PelB，PelD jmd CelD。因此，每 株菸草植物可獲得2048、2679和447938單位的PelB、PelD和CelD (實驗品種，哈瓦那 菸草)。每英畝可種8000株菸草，因此可分別獲得16.21億和35.84億單位PelB、PelD 或CelD (表1)。以每年可收割三季計算，每年可收穫49.64億和107.51億單位的PelB、 PelD或CelD。市售品種可收穫40噸生物質，而實驗哈瓦那品種只可收穫2.2噸生物質。 因此，市售品種產量為實驗品種的18倍。實施例4 pH和溫度對果膠酸裂解酶(PelB & PelD)和內切葡聚糖酶(CelD)活 性的影響植物和腸埃希氏菌提取物都表明在2.5mg/ml PGA時活性最高(圖3a)。 因 此，所有的酶均在此濃度下進行研究。動力學研究在4iigTSP，不斷增加濃度的 PGA(0-2.5mg)及標準分析條件下進行，結果表明葉綠體(cp)和腸埃希氏菌(r)PelB的 Km值分別為0.39和1.19 u g/ml，而葉綠體和腸埃希氏菌PelD的Km值分別為0.50和 1.29ug/mL cpPelB、rPelB、cpPelD 和 rPelD 的 Vmax 值分別為 2.75、3.19、2.75 禾口 3.14units/mg(圖 3a)。植物或腸埃希氏菌提取物(4-5 u g TSP)用於研究pH和溫度對酶活性的影響。標 準測試條件下，腸埃希氏菌和由葉綠體生成的果膠酸裂解酶的最佳溫度為40°C，最佳pH 值為8.0。在lmMCaCl2#在下，葉綠體生成的果膠酸裂解酶其最佳pH為6.0。而對於 腸埃希氏菌粗提取物而言，無論CaC12存在與否，其最佳pH值為8.0 (圖3b，c)。溫度 升高對由植物生成的果膠酸裂解酶活性影響很小，而對於腸埃希氏菌酶，在較高溫度下 其活性較低(圖3d，e)。兩種不同寄主所表現的不同酶特性可能是由於其摺疊性。用 HIS-標記抗體，而不是葉綠體酶(數據未列出)可檢測腸埃希氏菌酶的事實也證實了上 述結論。眾所周知葉綠體二硫鍵形成的外源蛋白質33_35，而不是腸埃希氏菌酶所形成的外 源蛋白可在細胞質中表達。PelB和PelD酶有偶數個(12或14)可形成二硫鍵的半胱氨酸
30
o在不同pH和溫度下測定含有2 % CMC的CpCelD活性。cpCelD的最佳pH值
在5.0 7.0之間(圖3f)，而腸埃希氏菌的最佳pH值為6.5。腸埃希氏菌的最佳溫度為 50-60植物酶的最佳溫度為50-70°C (圖3g)。熱纖梭菌CelD其結構與CaC12具有相 似性，且具有熱穩定性36。10mM CaC12可將含有2% CMC的腸埃希氏菌粗提取物中的 CelD活性提高兩倍，但在培養初期，這對葉綠體CelD粗提取物卻不適用。這可能是由 於植物細胞中的Ca2+達到最佳濃度。含有20 y g BSA的CaC12，在24小時培養末期， 可使cpCelD粗提取物活性提高5倍(圖3h)。實施例5 腸埃希氏菌vs葉綠體CelD、PelB & PelD含有CelD酶的腸埃希氏菌粗提取物，當反應混合物含有超過lOygTSP時，酶 活性下降，而含有CelD的植物粗提取物則可釋放出較多還原糖，且蛋白質濃度增加(圖
144a)。葉綠體表達CelD活性在150 u g TSP時達到飽和(2% CMC)(圖4a插圖)，且通 過終點監測，即使TSP含量高達500i!g，仍可觀測到葉綠體CelD酶活性增加。這些結 果表明含有cpCelD的粗植物提取物不需要提純即可直接用於生物質降解，而腸埃希氏菌 可能含有內切葡聚糖酶抑制劑。同樣，在較高蛋白質濃度下，腸埃希氏菌表達rPelB和 rPelD表現出還原果膠酸降解酶活性，而即使在600iigTSP時，cpPelB或cpPelD仍表現 為活性增加(圖4b)。腸埃希氏菌中可能含有果膠酸裂解酶抑制劑，而植物粗提取物中卻 不含上述抑制劑。這些發現極其重要，因為粗提取物的使用意味著不再需要對酶進行提 純。如下所示大量粗植物酶可用於多酶混合物而不影響酶活性、水解或產率。實施例6:用於濾紙水解的多酶混合物在評估多酶混合物前，每種酶的活性分別用適宜的基材進行測試。葉綠體或腸 埃希氏菌表達內切葡聚糖酶(cpCelD或rEgl)不會產生可檢測量的纖維素，但當二者混合 後，最多可產生19%的水解反應(圖5a，條1)。這可能是由於內切葡聚糖酶和濾紙間 不同的碳水化合物鍵合所致。當內切葡聚糖酶(cpCelD和rEgl)與裡氏木酶(rSwol)或
葡萄糖苷酶(rBgll，圖5a，條2&3)混合，協同活性可提高47%或48%。如向多酶 混合物中添加纖維二糖水解酶，可使濾紙水解提高兩倍，最大程度的釋放還原糖類(圖 5a,條4)。這種協同作用可能是由於纖維二塘水解酶37還原末端的外切模型，上述模型 中通過內切葡聚糖酶(cpCelD和rEgl)任意切割纖維素鏈，同時伴隨擴展蛋白和0 _葡萄 糖苷酶的運動。實施例7:用於深加工木水解反應的多酶混合物採用可從濾紙上釋放最大等當量纖維素的多酶混合物(除rEgl)對深加工木基材 進行測試。水解24小時後，該多酶混合物發生31%的水解反應(圖5b，條1)。內切葡 聚糖酶的多酶混合物和乙醯木聚糖酯酶表現出41%的水解反應(圖5b，條2)。當這兩種 多酶混合物進行混合，水解程度增加至88% (圖5b，條3)。當深加工木基材用果膠酸 裂解酶處理後，再加入條3中的多酶混合物，水解程度進一步提高，培養36小時後，可 釋放出275 u g葡萄糖(圖5b，條4)。加入角質酶和脂肪酶提取物後(均帶有脂肪酶活 性)未對可發酵性糖類的生成產生顯著影響(數據未列出)。Novozyme 188多酶混合物 未從深加工木中產生可檢測量等當量葡萄糖，而Celluclast 1.5L產量較粗提取多酶混合物 多10 %，與CMC水解酶單位相同。在一個具體實施例中，消化木質生物質樣品的方法，包括製備含有內切葡聚糖 酶或乙醯木聚糖酯酶中的一種或兩種的植物質，上述內切葡聚糖酶或乙醯木聚糖酯酶在 植物中表達，且全部或部分植物質從上述植物中獲得；上述植物質與上述木質生物質樣 品混合。本實施例所述方法可進一步包括與木質生物質樣品混合之前或同時與內切葡聚 糖酶或乙醯木聚糖酯酶混合，植物質含有在植物表達的果膠酸裂解酶，且部分或全部果 膠酸裂解酶來源於上述生物質。生物質還可含有加氧酶。另一個具體實施例包括用於消化木質生物質樣品的植物降解多酶混合物，其中 上述消化木質生物質樣品含有在植物中表達的纖維素酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、 a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、裡氏木酶或果膠酶中的一種或幾種，也可含 有一定量的加氧酶。實施例8 用於柑橘廢物水解反應的多酶混合物
內切葡聚糖酶的多酶混合物(cpCelD)、外切葡聚糖酶、裡氏木酶和葡萄糖 苷酶與桔皮可最多進行24%的水解反應(圖5c，條1)。當桔皮經果膠酸裂解酶處理後 (cpPelB, cpPelD和rPelA)，水解程度可以成倍提高(圖5c，條2)。果膠酸裂解酶在此 多酶混合物中可貢獻47%的水解反應，原因在於桔皮中較高的果膠含量(23% )41。向上 述兩種多酶混合物中添加內切葡聚糖酶、乙醯木聚糖酯酶、角質酶和脂肪酶，培養24小 時後，lOOmg桔皮可釋放360i!g/ml等當量葡萄糖(圖5c，條3)。桔皮中的酶類如角質 酶和脂肪酶可能含有水解親油體，更有助於內切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酸裂解酶水 解桔皮。NovozymellS多酶混合物可使桔皮的葡糖糖產量提高11%，而較含有等當量酶 單元的粗提取多酶混合物，可使CMC水解產量提高137%。在一個具體實施例中，消化柑橘生物質樣品的方法，其中包含製備含有纖維素 酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶或果膠酶中 的一種或幾種的植物質，上述酶在獲得上述植物質的植物中表達；且上述植物質和上述 柑橘生物質樣品混合。在一個具體實施例中，用於消化柑橘生物質的植物降解多酶混合物，上述植物 降解多酶混合物含有纖維素酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、a-澱粉酶、澱粉葡糖苷 酶、果膠酸裂解酶、裡氏木酶或果膠酶中的一種或幾種，上述酶在植物中表達，還可含 有一定量的加氧酶。與實施例1-8相關的方法基因隔離和建造質體轉化載體熱纖梭菌和裡氏黑黴的DNA基因組從ATCC中獲得，並作為擴增不同基因的 模板。使用在pLD介質克隆的含有Ndel點的正向引物和含有Xbal點的反向引物為基 因特異性引物，上述基因特異性引物專門用於celD、celO和lipY基因。從熱纖梭菌 DNA基因組對纖維素基因celD(X04584)和celO (AJ275975)的成熟區進行擴增。從結 核分枝桿菌DNA基因組對LipY(NC_000962)進行擴增。採用新型方法，運用重疊引物 在裡氏黑黴 DNA 基因組中對各種 egll(M15665)，egl (AB003694)，swol (AJ245918)， axel (Z69256)，xyn2 (X69574)和bgll (U09580)的外顯子進行擴增。採用基於PCR的新 型方法從不同外顯子中對這些基因的全長cDNA進行擴增，上述方法分別採用含有Ndel 位點的首個外顯子的正向和含有Xbal位點的末端外顯子的反向。帶有相同限制性位點的 苜蓿根腐病菌的果膠酸裂解酶基因pelA，elB&pelD，分別採用pHILD2A，HILD2B3°和 HILD2D45的基因特意性引物進行擴增。採用相同的方法從苜蓿根腐病菌的重組克隆對角 質酶基因46進行擴增。所有全長擴增產物與pCR鈍化IITopo載體(Invitrogen)相連，並 作為DNA序列(Genewiz)。Topo載體中的每種克隆基因採用Ndel/Xbal消化，並嵌入 pLD載體17』 47,以使菸草葉綠體表達載體。轉基因葉綠體植物的再生及通過PCR和DNA雜交技術對轉基因整合進行評估哈瓦那品種菸草在含有30g/l蔗糖的無激素MS瓊脂培養基中進行無菌培養。 如前所述，採用pLD-PelB、pLD-PelD和pLD-CelD塗布的金粒子轟擊未成熟葉片，進 而再生為轉基因葉綠體植物28』 29。採用Qiagen公司DNeasy植物試劑盒，從葉片處對植 物DNA基因組進行隔離。分別採用3P/3M和5P/2M引物進行PCR分析，以確定轉基 因整合入葉綠體基因組的反向重複區17。PCR反應如前所述17』 29。PCR正端莖處的葉片被切成小片，並轉入含有500mg/l奇黴素的RMOP(植物再生介質)介質用於下一輪篩 選，隨後再轉入含有500mg/l奇黴素的MSO (不含維他命和生長激素的MS鹽)介質用 於下一輪篩選，以生成同質性線。進行DNA雜交技術分析，根據實驗室要求確定同質 性48。總而言之，與葉片隔離的總植物基因組DNA(l-2iig)採用Smal消化，並與含有 trnl-trnA基因的32P a [dCTP]標記的葉綠體側翼序列探針(0.81kb)雜交。採用Stratagene 公司QUICK-HYB雜交溶液進行雜化。免疫分析如前所述，約lOOmg葉片在液氮中粉碎用於免疫分析48。蛋白質濃度Bradford 蛋白質定量試劑盒(Bio-Rad)進行測試。採用SDS-PAGE將相同量的總溶蛋白質分離， 並轉移至硝酸纖維素膜。採用兔子體內對PelA免疫的多克隆血清檢測其轉基因蛋白質表 達。腸埃希氏菌酶(粗)的製備含有用於表達rCelD、rEgl (EC 3.2.1.4)、rCelO (EC 3.2.1.91)、 rXyn2(EC3.2.1.8)、rAxel (EC 3.1.1.72)、rBgll (EC 3.2.1.21)、rCutinase (EC 3.1.1.74)、 rLipY (lipase, EC 3.1.1.3)、rPelA、rPelB、rPelD (EC 4.2.2.2)或 rSwol 葉綠體表達載體 的腸埃希氏菌株(XL-10金)在37°C下隔夜培養。在4°C下收集細胞，並在含有蛋白酶 抑制多酶混合物(Roche)和疊氮化鈉(0.02% )的緩衝溶液中(對於CelD、Egl、CelO、 Swol、Xyn2、Axel和Bgll，採用pH = 5.5，50mM醋酸鈉緩衝溶液，對於角質酶、脂肪 酶、PelA、PelB和PelD，採用pH = 7.0，100mM Tris-HCl)採用30s脈衝聲處理四次。 16000xg下離心10分鐘，收集上清液，並測定蛋白質含量。從菸草葉綠體轉基因葉片中製備酶採摘新鮮綠葉，在液氮中粉碎。採用pH = 5.5，50mM醋酸鈉緩衝溶液提取 cpCelD和cpXyn2中的總可溶蛋白質，採用pH = 7.0，100mM Tris_Cl緩衝溶液提取PelD 和PelB中的總可溶蛋白質。所有緩衝溶液均含有蛋白酶抑制多酶混合物(Roche)和疊氮 化鈉(0.02% )。採用0.22 P m針管過濾器過濾總可溶蛋白質。採用Bradford法測定TSP
中蛋白質含量。果膠酸裂解酶B和果膠酸裂解酶D中酶定量分析採用分光光度法，通過測量A235增加來測定果膠酸裂解酶B和D3°』 49』 5°。對果 膠酸裂解酶B和D的動力學進行研究，以便在相同蛋白質和輔因子濃度下優化基材濃度 (0-2.5mg)。反應混合物含有 1ml 50mM 的 Tris-HCl 緩衝溶液(pH 8.0)，ImM CaCl2 (新 鮮配製)，1ml 0.0-2.5mg/ml多聚半乳糖醛酸鈉(Sigma)和0.5ml適宜的稀釋酶溶液。測 量在40°C下進行。定義一單位酶為與摩爾消光係數為4600 u moTcm 1的1 y mol產品/ min中的酶含量。在40°C，pH = 8.0的50mM Tris_HCl緩衝溶液中進行動力學研究。採 用Graphpad Prism 5.0軟體，利用非線性回歸法計算動力學參數(Km & Vmax)。計算每 種基材濃度的起始斜率，且通過生成的不飽和半乳糖醛酸確定速度(單位/mg/min)。pH =8.0，50mM Tris-HCl緩衝溶液中，果膠酸裂解酶B和D活性最佳溫度為30°C 70°C。 基材均在適宜溫度下預培養5min。為了研究酶的熱穩定性，在不同溫度固定時間內對緩 衝酶樣品進行培養。40°C下，採用具有相同離子強度的不同緩衝溶液確定果膠酸裂解酶B和D的最佳pH值為6 10。在不同pH值下對酶進行培養以確定粗提取物中酶的最佳穩定性。 在不同pH值和不同溫度下，通過添加和不添加CaCl2來確定輔因子CaCl2對果膠酸裂解 酶活性的影響。CelD和市售多酶混合物(Celluclast 1.5L和Novozyme 188)中酶的定量分析根據IUPAC建議32，採用Acicel和Sigmacell (Sigma)作為基材，通過在2 % CMC 中培養粗提取物來測定cpCelD中纖維素酶的活性。在60°C下，pH = 6.0，50mM醋酸緩 衝溶液中，對CMC培養30min，對Avicel和Sigmacell培養2h。在相同的分析條件下， 採用2% CMC對市售多酶混合物Celluclast 1.5L和Novozyme 188的酶單位進行測定。採 用3，5- 二硝基水楊酸測定還原性糖含量31。D-葡萄糖和D-半乳糖醛酸作為標準物， 對生成的等當量葡萄糖和不飽和半乳糖醛酸進行測定。cpCelD的pH和溫度活性採用 CMC(2%)進行測定。定義一單位酶為生成lymol等當量葡萄糖/min的酶含量。根 據製造商提供的葡萄糖己糖激酶法計算Avicel和Sigmacell (Sigma)的纖維素酶單位。濾紙、深加工木和桔皮的酶水解反應對濾紙、深加工木和桔皮中的單一酶組分或多酶混合物的酶進行定量分析，採 用DNS法對生成的還原性糖進行測定。瓦倫西亞桔皮(瓦倫西亞橙)在空氣中過夜幹 燥，並在液氮中粉碎。粉碎的瓦倫西亞桔皮和預處理過的木質生物質在蒸餾水中清洗幾 遍，直至無還原性糖可被DNS試劑和葡萄糖己糖激酶法檢測出為止。採用50-200mg深加工木或粉碎桔皮進行酶消化。含有腸埃希氏菌和植物的 酶的粗提取物加入多酶混合物用於水解反應。採用DNS試劑31和D-葡萄糖作為標準 物，終產物還原性糖類進行測定。加入100 yg/ml氨苄青黴素和卡那黴素以抑制酶水解 反應過程中的微生物生長。在相同測試條件下，測試市售酶多酶混合物Celluclast 1.5L 和Novozyme 188對桔皮和深加工木的水解反應。用於水解分析的Celluclast 1.5L和 Novozyme 188的酶單位與粗提取物中多酶混合物中的cpCelD酶單位相同(依據CMC水 解反應)。所有實驗中，對無酶的基材和無基材的酶進行控制。且所有實驗和分析均平 行進行三組。本發明發明者採用細菌或黴菌基因組的解碼序列構建葉綠體載體。基於PCR的 新型方法，在不採用黴菌基因組DNA的內含子的基礎上克隆ORF。採用腸埃希氏菌表 達系統評價在製備轉基因葉綠體線前每種酶的功能或其在多酶混合物中的功效；來源於 黴菌的酶在不使用後翻譯修飾的基礎上處於活性狀態(二硫鍵或糖基化)。同質轉基因葉綠體線的顯性正常，且可生成花朵&種子。 根據一年所收穫的三季菸草，實驗品種每年可獲得49.64億和107.51億果膠酸裂解酶單位 和內切葡聚糖酶活性。當採用市售品種培養的酶，產量可提高18倍。根據USDA經濟 研究局的報告，2004年白肋煙的生產成本為3981美元/英畝。由於用於植物生物質水解 的酶在高溫下活性較高，因此對於葉綠體製備的木聚糖酶，如前所述，建議將採摘的葉 片在陽光下乾燥25。根據本發明所觀察到的植物粗提取物中的酶活性，無需對其進行提 純。因此，不考慮加工成本的話，對PelB而言，其酶的生產成本為0.008分/酶單位， 對於PelD而言，其酶的生產成本為0.006分/酶單位(如Megazyme市售產品所定義)。 對於果膠酸裂解酶而言，與市售成本相比，其成本可降低925 1233倍(Megazyme由長 梗鬱李製備)。儘管對於葉綠體製備的酶，其成本或產量不盡相同，但本發明提供了一種
18廉價多酶混合物，用以從木質纖維生物質製備可發酵性糖類。據我們所知，本發明是首個針對植物多酶混合物表達木質纖維素生物質生成可 發酵性糖類的水解反應進行研究的報導，並直接比較使用相同基因和調控序列，經由發 酵或外來植物所製備的酶的特性。對天然基因，如預處理木材、玉米稈或麥稈的酶水解 研究已開始使用市售酶3』 42或參雜純化的市售酶的純化重組酶4°』43。由於酶組分未知，因 此無法準確比較粗提取多酶混合物與市售多酶混合物。因此，基於CMC水解的等當量酶 單位用於基本對比參照。由於需要機構協議，因此ACCELLERASE TM 1000 (Genencor) 未被用於本發明。經Novozyme 188純化的多酶混合物未從深加工木中產生任何可檢 測範圍內的等當量葡萄糖，且上述多酶混合物與橘皮作用，將等當量葡萄糖的產量提高 11%,較粗提取多酶混合物，Celluclast可使上述兩種生物質基材在CMC水解過程中的等 當量葡萄糖產量分別提高10%和137%。由於純化多酶混合物經某些特定黴菌株發酵生 成，而在此過程中上述純化多酶混合物分泌某些酶，因此粗多酶混合物性能與純化多酶 混合物相似或更好。根據Novozymes的建議，仔細設計幾種單一組分的酶的混合物對合 理利用多酶混合物是必要的44。實施例9 植物降解酶的表達上述實施例1 8可用於製備異源基因表達盒，構建轉化載體，轉化葉綠體及本 發明作者所列舉的有助於降解植物生物質源的葉綠體表達。同時，葉綠體轉化和蛋白質 表達請參見美國專利20070124830和20060117412。一些非限制性酶列於表I:表IGOI (感興趣基因)
權利要求
1.一種降解植物生物質樣品以釋放其中可發酵性糖的方法，所述方法包括獲取含 有至少兩種細胞提取物的植物降解多酶混合物，每種細胞提取物均含有活性植物降解化 合物，並在獲得所述細胞提取物的細胞中重組表達，所述至少兩種細胞提取物為植物提 取物或細菌提取物或兩者的組合；且所述生物質樣品與植物降解多酶混合物混合。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述至少兩種細胞提取物含有至少一種含有植 物降解化合物的植物細胞提取物和至少一種含有另一種植物降解化合物的細菌細胞提取 物。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物降解多酶混合物含有至少三種細胞提 取物，所述至少三種細胞提取物均含有纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素 酶、木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂肪酶、麵包酶、 果膠酶或擴展蛋白。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物生物質樣品含有穀物和/或穀物殘留 物、甜菜、甘蔗、草類、木質生物質、水果和/或水果殘留物或所述幾種的混合物。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述植物生物質為玉米、小麥、大麥或柑橘或所 述殘留物。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述植物生物質為柳枝稷。
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述植物生物質為鋸末或深加工木。
8.根據權利要求4所述的方法，其中所述植物生物質為甘蔗。
9.根據權利要求4所述的方法，其中所述植物生物質為桔皮。
10.根據權利要求4所述的方法，其中所述植物生物質為甜菜。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物降解多酶混合物還含有加氧酶。
12.—種製備植物生物質降解物的方法，包括製備一種含有表達其植物降解酶葉綠體的植物和另一種含有表達其植物降解酶葉綠 體的植物；採摘所述兩種植物；並且加工所述兩種植物，生產含有適於混合和降解生物質樣品的酶。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述第一種和/或第二種植物為菸草。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述加工工藝包含對所述第一種和/或第二種 植物或部分第一種和/或第二種植物進行均質。
15.根據權利要求12所述的方法，其中所述步驟包括至少以下兩步合成含有表達 纖維素酶葉綠體的第一種植物；合成含有表達木質素酶葉綠體的第二種植物；合成含有 表達葡萄糖苷酶葉綠體的第三種植物；合成含有表達半纖維素酶葉綠體的第四種植 物；合成含有表達木聚糖酶葉綠體的第五種植物；合成含有表達α-澱粉酶葉綠體的第 六種植物；合成含有表達澱粉葡糖苷酶葉綠體的第七種植物；合成含有表達果膠酸裂解 酶葉綠體的第八種植物；合成含有表達角質酶葉綠體的第九種植物；合成含有表達脂肪 酶葉綠體的第十種植物；合成含有表達麵包酶葉綠體的第十一種植物；合成含有表達果 膠酶葉綠體的第十二種植物或合成含有表達擴展蛋白(如裡氏木酶)葉綠體的第十三種植 物。
16.一種用於降解植物生物質的植物降解多酶混合物，所述多酶混合物含有至少三種重組表達植物降解酶和加氧酶或擴展蛋白。
17.根據權利要求16所述多酶混合物，其中所述多酶混合物含有至少四種植物降解酶。
18.根據權利要求17所述多酶混合物，其中所述至少兩種植物降解酶含有下列酶中的 幾種纖維素酶、木質素酶、β 「葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α 「澱粉酶、澱 粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂肪酶、果膠酶或麵包酶。
19.一種降解植物生物質的植物，所述植物含有從第一種植物提純而來的第一種植物 降解酶和由第二種植物提純而來的第二種植物降解酶。
20.一種降解植物生物質的植物，所述植物含有第一種葉綠體基因組或解碼第一種植 物降解酶的外源酶的基因片段和第二種葉綠體基因組或解碼第二種植物降解酶的外源酶 的基因片段。
21.根據權利要求20所述的植物，其中所述植物含有至少以下兩種第一葉綠體 基因組或可解碼纖維素酶的外源酶的基因片段，第二種葉綠體基因組或可解碼木質素酶 的外源酶的基因片段，第三種葉綠體基因組或可解碼葡萄糖苷酶的外源酶的基因片 段，第四種葉綠體基因組或可解碼半纖維素酶的外源酶的基因片段，第五種葉綠體基因 組或可解碼木聚糖酶的外源酶的基因片段，第六種葉綠體基因組或可解碼α-澱粉酶的 外源酶的基因片段，第七種葉綠體基因組或可解碼澱粉葡糖苷酶的外源酶的基因片段， 第八種葉綠體基因組或可解碼果膠酸裂解酶的外源酶的基因片段，第九種葉綠體基因組 或可解碼角質酶的外源酶的基因片段，第十種葉綠體基因組或可解碼脂肪酶的外源酶的 基因片段，第十一種葉綠體基因組或可解碼果膠酶的外源酶的基因片段，第十二種葉綠 體基因組或可解碼麵包酶的外源酶的基因片段，或第十三種葉綠體基因組或可解碼擴展 蛋白的外源酶的基因片段。
22.含有可重組表達纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖 酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂肪酶、果膠酶或麵包酶或擴 展蛋白的植物細胞的植物，其中所述植物為市售菸草。
23.根據權利要求22所述的植物，其中所述酶位於所述葉綠體的細胞內。
24.—種消化柑橘生物質樣品的方法，包括獲取含有纖維素酶、葡萄糖苷酶、 木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶或果膠酶的一種或幾種的植物，所 述酶在全部或部分獲得所述植物的植物中表達；所述植物與所述柑橘生物質樣品混合。
25.根據權利要求12所述的方法，其中所述第一種和第二種植物為單子葉植物、雙子 葉植物或藻類中的一種或幾種。
26.—種均質植物，含有至少兩種下列活性蛋白質纖維素酶、木質素酶、葡萄 糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、 脂肪酶或果膠酶，或者他們的組合酶；所述植物含有纖維素酶、木質素酶、葡萄糖 苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂 肪酶，果膠酶或麵包酶；所述植物也可含有加氧酶和/或裡氏木酶。
27.根據權利要求26所述均質植物，其中酶含量佔所述木質植物總蛋白質含量的 0.1%以上。
28.根據權利要求26所述均質植物，其中所述植物含有加氧酶。
29.根據權利要求26所述均質植物，其中所述植物含有可在植物中表達的纖維素酶、 β-葡萄糖苷酶，木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、裡氏木酶或果 膠酶，或它們的組合，也可含有一定量的加氧酶。
30.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼纖維素酶的外源基因的基因片段。
31.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼木質素酶的外源基因的基因片段。
32.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼葡萄糖苷酶的外源基因的基因片段。
33.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼半纖維素酶的外源基因的基因片段。
34.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼α-澱粉酶的外源基因的基因片段。
35.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼澱粉葡糖苷酶的外源基因的基因片段。
36.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼果膠酸裂解酶的外源基因的基因片段。
37.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼角質酶的外源基因的基因片段。
38.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼脂肪酶的外源基因的基因片段。
39.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼果膠酶的外源基因的基因片段。
40.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼麵包酶的外源基因的基因片段。
41.根據權利要求1所述的方法，其中所述多酶混合物含有葉綠體基因組或帶有可解 碼裡氏木酶的外源基因的基因片段。
42.降解植物生物質樣品的方法，包括製備包含至少一種葉綠素基因組或帶有外源 基因的可解碼纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-澱粉 酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂肪酶、果膠酶或麵包酶中的一種或幾種 的基因組片段的第一種植物降解質；所述第一種植物含有纖維素酶、木質素酶、葡 萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質 酶、脂肪酶、果膠酶、麵包酶或裡氏木酶中的一種或幾種，所述酶在獲得所述植物質的 植物中表達；製備包含至少一種葉綠素基因組或帶有外源基因的可解碼纖維素酶、木質 素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂 解酶、角質酶、脂肪酶、果膠酶或麵包酶中的一種或幾種的基因組片段的第二種植物降 解質；所述第二種植物含有不同於所述第一種植物的纖維素酶、木質素酶、葡萄糖 苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂 肪酶、果膠酶、麵包酶或裡氏木酶中的一種或幾種，所述酶在獲得所述植物質的植物中表達；所述第一種植物降解質，所述第二種植物降解質和所述生物質樣品混合。
43.一種製備植物生物質降解質的方法，包括製備至少一種含有可表達纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚 糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂肪酶、果膠酶、麵包酶或 裡氏木酶的葉綠體的植物， 採摘所述植物；並加工所述植物，生成適於混合且可降解生物質樣品的植物降解質。
44.根據權利要求43所述的方法，其中加工過程包括純化表達酶。
45.根據權利要求43所述的方法，其中所述植物為菸草、生菜、甜菜、菠菜或胡蘿
46.根據權利要求43所述的方法，其中所述加工過程包括對所述植物或部分植物進行 均質。
47.根據權利要求43所述的方法，其中包括至少製備下列兩種植物製備含有可表 達纖維素酶的葉綠體的第一種植物，製備含有可表達木質素酶的葉綠體的第二種植物， 製備含有可表達葡萄糖苷酶的葉綠體的第三種植物，製備含有可表達半纖維素酶的 葉綠體的第四種植物，製備含有可表達木聚糖酶的葉綠體的第五種植物，製備含有可表 達α-澱粉酶的葉綠體的第六種植物，製備含有可表達澱粉葡糖苷酶的葉綠體的第七種 植物，製備含有可表達果膠酸裂解酶的葉綠體的第八種植物，製備含有可表達角質酶的 葉綠體的第九種植物，製備含有可表達脂肪酶的葉綠體的第十種植物，以及製備含有可 表達果膠酶的葉綠體的第十一種植物。
48.可有效降解植物生物質生成可發酵性糖的植物質，所述物質含有加氧酶、裡氏木 酶以及至少一種纖維素酶、木質素酶、β-葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-澱 粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂肪酶或果膠酶。
49.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物為粉末狀。
50.根據權利要求12所述的方法，其中相對於表達第一種或第二種酶的葉綠體而言， 所述第一種或第二種植物為同源或異源。
51.含有一種表達的介質含有可用結合組分、在葉綠體內作用的促進劑、可解碼植物 降解酶的異源核苷酸序列，至少一種可解碼制定特性的多肽的結構基因或功能性基因片 段，其中對所述異源核苷酸序列的轉錄通過所述促進劑和轉錄終止區進行控制，葉綠體 DNA序列側翼序列側翼表達盒有助於通過重組實現表達盒向葉綠體基因組的平穩整合。
52.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為纖維素酶。
53.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為木質素酶。
54.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為葡萄糖苷酶。
55.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為半纖維素酶。
56.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為木聚糖酶。
57.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為α-澱粉酶。
58.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為澱粉葡糖苷酶。
59.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為果膠酸裂解酶。
60.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為角質酶。
61.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為脂肪酶。
62.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為果膠酶。
63.根據權利要求51所述的介質，其中所述植物降解酶為麵包酶。
64.根據權利要求16所述的植物質，其中酶與加氧酶的比例為99 1 1 99; 50 1 1 50 ； 25 1 1 25 ； 10 1 1 10 ； 5 1 1 5 ；或 2 1 1 2。
65.消化柑橘生物質的植物降解酶多酶混合物含有植物表達的纖維素酶、β-葡萄糖 苷酶，木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶或果膠酶中的一種或幾種， 所述多酶混合物中也可含有一定量的加氧酶。
66.一種消化木質生物質樣品的植物降解酶多酶混合物，含有植物表達纖維素酶、 β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、裡氏木酶和果 膠酶，以及一定量的加氧酶。
67.—種植物降解酶多酶混合物，含有三種或三種以上下列基因產物celD、egl、 egll、cellO、IipY> pelA、pelB、pelD、cut、swol、xyn2、axel、bgll、manl、abfl 或 lipJ，所述基因與細胞異源，可穩定的轉化表達所述基因。
68.根據權利要求67所述多酶混合物，其中所述細胞為植物細胞。
69.根據權利要求67所述多酶混合物，其中所述細胞為植物細胞核細菌細胞。
70.根據權利要求22所述植物，其中所述市售品種為LAMD或TN90。
71.降解植物生物質和從所述生物質有效生成可發酵性糖的植物降解多酶混合物，所 述多酶混合物含有至少三種重組表達植物降解酶、加氧酶和裡氏木酶。
72.根據權利要求71所述多酶混合物，其中所述多酶混合物至少含有四種植物降解酶。
73.根據權利要求72所述多酶混合物，其中至少兩種植物降解酶含有下列酶中的幾 種纖維素酶、木質素酶、葡萄糖苷酶，半纖維素酶、木聚糖酶、α-澱粉酶、澱粉 葡糖苷酶、果膠酸裂解酶、角質酶、脂肪酶、果膠酶或麵包酶。
全文摘要
本文披露用於降解植物生物質的材料。在典型實施例中，植物材料含有一種或幾種在植物和/或細菌中表達的酶。更具體的說上述植物降解酶在葉綠體中表達。葉綠體表達酶可用作多酶混合物，通過與傳統方法結合將生物質轉化為生物燃料，如纖維素乙醇。
文檔編號C12N15/52GK102016041SQ200980115298
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月2日 優先權日2008年2月29日
發明者亨利·丹尼爾 申請人:中央佛羅裡達大學研究基金會有限公司