一種測定雷公藤多苷效價的方法
2023-12-05 15:30:36
專利名稱：一種測定雷公藤多苷效價的方法
所屬技術領域本發明用於測定雷公藤多苷的免疫控制效價，特別是一種通過檢測小白鼠胸腺萎縮程度來測定雷公藤多苷效價的方法。
背景技術：
雷公藤多苷是用於治療類風溼性關節炎的首選臨床藥物，它是從衛矛科植物雷公藤根中提取出來的一些次代謝產物的混合體，成分複雜，毒性大。國家至今尚未制訂出一個控制其質量好壞的檢測標準，生產雷公藤的廠家通常都採用LD50測定法來控制毒性。半數致死量(簡稱LD50)是指藥物引起實驗動物半數死亡的劑量。由於個體差異，同一劑量的藥物給同一動物，可以出現死亡或不死亡。而LD50在表示藥物毒性時，比較靈敏，準確。一般以mg/kg表示(藥物劑量/體重)。測定LD50常用動物為小白鼠，體重18-22g，雄雌均可(雌的不得懷孕)將不同性別和體重的動物均勻分成4或6組，每組10隻。給藥途徑和臨床應用相同，給藥容量不超過0.6ml為宜。一般觀察7天，以死亡為主要指標。但實驗證明毒性相同的兩批雷公藤多苷產品其效價有很大的區別，僅靠LD50測定法不能測定雷公藤多苷的效價，無法確保生產的雷公藤多苷低毒高效。
發明內容本發明所要解決的技術問題是克服單純依靠LD50測定法控制雷公藤多苷質量，難以區分毒性相同的不同批次雷公藤產品的效價比的缺陷，提供一種通過檢測小白鼠胸腺萎縮程度測定雷公藤多苷效價的方法，將生物效價法和LD50法結合起來，控制雷公藤多苷的質量，使生產的雷公藤多苷低毒高效。
本發明解決現有技術問題所採用的技術方案是一種測定雷公藤多苷效價的方法，其特徵是首先對一批次的多組小白鼠分別進行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，尋求導致小白鼠胸腺萎縮呈線性關係的劑量範圍；接著在該劑量範圍對同一批次的多組小白鼠分別進行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，連續數天給藥後，稱重，將小白鼠斷頸處死，剖取胸腺稱重，計算比較兩者的胸腺指數。以注射氫化可的松的小白鼠胸腺為參照確定雷公藤多苷的效價，所述的胸腺指數＝[胸腺(mg)/100g體重]的平方根。實驗證明雷公藤多苷在小劑量時對幼年小鼠胸腺無明顯影響，大劑量時才能使胸腺萎縮。本發明通過對小白鼠分組進行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，使小白鼠胸腺萎縮，將小白鼠處死後取出胸腺稱重，求出胸腺指數；以注射氫化可的松的小白鼠胸腺指數為基準，比較雷公藤多苷的生物效價。
本發明中所述的實驗小白鼠隨機分成四或六組，其中二分之一組注射氫化可的松，劑量範圍為16.4mg/kg～40mg/kg；另二分之一組注射雷公藤多苷，劑量範圍為64mg/kg～125mg/kg。
本發明中所述的小白鼠為出生18～20日齡，體重11～13g，胸腺為67mg～77mg的ICR幼鼠。因為幼鼠體重及胸腺重量都是隨著日齡的增加而增加，並且18日齡、19日齡及20日齡時幼鼠胸腺指數趨向平衡，有利於實驗，減小胸腺指數相差太大帶來的不利影響。經過大量實驗檢測表明符合該日齡和體重的ICR幼鼠其胸腺重量多在67mg～77mg之間，ICR為國際通用對標準小鼠品系的稱呼。(實驗小鼠的品系之一)本發明中所述的給藥注射時間為每天一次，每次0.2ml/只，連續給藥3天，在給藥後第4天處死稱重。因為給藥5天的實驗結果數據差異較大，故選擇給藥3天。
本發明中所述的雷公藤多苷採用一種或多種助溶劑加熱溶解，再用生理鹽水稀釋至無顆粒物質沉澱即可；氫化可的松用生理鹽水稀釋至所需濃度。由於高濃度的氫化可的松藥液在低溫下容易產生析晶現象，過高濃度的氫化可的松不利於腹腔注射(20mg/ml的有析晶現象產生)。本發明中採用吐溫-80作為助溶劑。
本發明中所述的注射採用腹腔注射方式。因為腹腔注射較皮下肌肉注射反應更明顯，而尾靜脈注射操作難度大，技術要求較高，普通人員不容易掌握，故選擇腹腔注射的方式進行。
本發明首次將小白鼠胸腺萎縮檢測應用在中藥領域測定雷公藤多苷的生物效價，通過對小白鼠腹腔注射雷公藤多苷或氫化可的松，使小鼠胸腺萎縮，剖取胸腺並稱重，計算比較胸腺指數，確定雷公藤多苷相對於氫化可的松的效價比和不同雷公藤多苷之間的效價比，以此來控制雷公藤多苷的毒性，做到低毒高效。此外，本發明還可以用在雷公藤製劑和其內含成分(主要二萜類、三萜類)或單體(雷公藤甲素、生物鹼、氯內酯甲等等)及具有免疫抑制作用的其它中藥類(主要內含二萜類成分)，測定相應生物效價。
下面結合具體實施方式
對本發明作進一步的說明。
具體實施方式(1).正常小鼠胸腺的重量取留仔數為8隻/窩出生為18日齡，19日齡、20日齡、21日齡的ICR清潔級健康小鼠，稱重，解剖取其胸腺稱重。由表一可見，幼鼠體重及胸腺重量都是隨著日齡的增加而增加，並且18日齡、19日齡及20日齡時幼鼠胸腺指數趨向平衡，故本發明選擇日齡為18～20、體重為11g～13g、胸腺為67mg～77mg的幼鼠作為雷公藤多苷效價實驗的標準動物，以胸腺指數作為反應指標，胸腺指數＝[胸腺(mg)/100g體重]的平方根。
表一 正常ICR小鼠胸腺參數表 (2).雷公藤多苷劑量範圍的摸索取出生為18～20日齡，體重為11～13g的ICR小鼠75隻，雌雄不計。按體重將其隨機分成五組(雷公藤多苷125mg/kg，100mg/kg，80mg/kg，64mg/kg，51.2mg/kg)，15隻一組，連續給藥3天，在給藥後第四天，稱重，將小鼠斷頸處死，解剖取其胸腺稱重，計算。表二表明和胸腺指數呈線性關係的雷公藤劑量範圍在64mg/kg～125mg/kg。
表二 雷公藤多苷注射劑量與胸腺指數對照表
(3).氫化可的松劑量範圍的摸索取出生為18～20日齡，體重為11～13g的ICR幼鼠75隻，雌雄不記。按體重將其隨機分成5組(氫化可的松40mg/kg，32mg/kg，20.5kg/mg，16.4mg/kg)，15隻/組。連續給藥3天，在給藥後第四天，稱重，將小鼠斷頸處死，解剖取其胸腺，計算。表三表明和胸腺指數呈線性關係的氫化可的松劑量範圍在16.4mg/kg～40mg/kg。
表三 氫化可的松注射劑量與胸腺指數對照表
(4).市購雷公藤多苷(批號2001001)與氫化可的松的對比實驗取出生為18～20日齡，體重為11～13g的ICR幼鼠60隻，雌雄不計，按體重將其隨機分成4組，15隻/組)，氫化可的松2組高劑量(20mg/kg)，低劑量(16mg/kg)；雷公藤多苷2組高劑量(80mg/kg)，低劑量(64mg/kg)。連續給藥3天，給藥後第四天，稱重，將小鼠斷頸處死，解剖取其胸腺，計算胸腺指數。R值按量反應平行線簡算法計算，表四計算得R＝0.130，即雷公藤多苷效價是氫化可的松的0.130倍。
表四 雷公藤多苷小鼠重量法實驗結果
(5).本單位生產的雷公藤多苷(批號001121)與氫化可的松的對比實驗取出生為18-20日齡，體重為11-13g的ICR幼鼠60隻，雌雄不計。按體重將其隨機分成4組，15隻/組，氫化可的松2組高劑量(21mg/kg)，低劑量(14.7mg/kg)；雷公藤多苷2組高劑量(120mg/kg)，低劑量(84mg/kg)。連續給藥3天，給藥後第四天，稱重，將小鼠斷頸處死，解剖取其胸腺，計算胸腺指數。R值同樣按量反應平行線簡算法計算，由表五計算得R＝1.525，即本單位生產的雷公藤多苷效價是氫化可的松的1.525倍。
表五 本單位生產的雷公藤多苷小鼠重量法實驗結果
上述(2)～(5)操作步驟中的雷公藤多苷採用吐溫-80加熱溶解，再用生理鹽水稀釋至無顆粒物質沉澱即可；氫化可的松用生理鹽水稀釋至所需濃度採用腹腔注射給藥，注射時間為每天一次，每次0.2ml/只，連續給藥3天，在給藥後第4天處死稱重。
單次給藥量0.2ml是根據小鼠的體重與所確定的劑量mg/kg及所配置的藥物濃度而定，實驗中小鼠體重按其平均體重20g。
如 事先按照給藥0.2ml/只配好所需的藥物濃度即可。
權利要求
1.一種測定雷公藤多苷效價的方法，其特徵是首先對一批次的多組小白鼠分別進行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，尋求導致小白鼠胸腺萎縮呈線性關係的劑量範圍；接著在該劑量範圍對同一批次的多組小白鼠分別進行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，連續數天給藥後，稱重，將小白鼠斷頸處死，剖取胸腺稱重，計算比較兩者的胸腺指數。
2.根據權利要求1所述的測定雷公藤多苷效價的方法，其特徵是所述的實驗小白鼠隨機分成四或六組，其中二分之一組注射氫化可的松，劑量範圍為16.4mg/kg～40mg/kg；另二分之一組注射雷公藤多苷，劑量範圍為64mg/kg～125mg/kg。
3.根據權利要求1或2所述的測定雷公藤多苷效價的方法，其特徵是所述的小白鼠為出生18～20日齡，體重11～13g，胸腺為67mg～77mg的ICR幼鼠。
4.根據權利要求1或2所述的測定雷公藤多苷效價的方法，其特徵是所述的給藥注射時間為每天一次，連續給藥3天，在給藥後第4天處死。
5.根據權利要求3所述的測定雷公藤多苷效價的方法，其特徵是所述的給藥注射時間為每天一次，連續給藥3天，在給藥後第4天處死。
6.根據權利要求1所述的測定雷公藤多苷效價的方法，其特徵是所述的雷公藤多苷採用一種或多種助溶劑加熱溶解，再用生理鹽水稀釋至無顆粒物質沉澱即可；氫化可的松用生理鹽水稀釋至所需濃度。
7.根據權利要求1所述的測定雷公藤多苷效價的方法，其特徵是所述的注射採用腹腔注射方式。
全文摘要
本發明用於測定雷公藤多苷的免疫控制效價，特別是一種測定雷公藤多苷效價的方法。雷公藤多苷成分複雜，毒性大。生產廠家通常用LD50法來控制毒性。但毒性相同的兩批雷公藤多苷產品效價有很大的區別，僅靠LD50測定法不能測定雷公藤多苷的效價，無法確保產品低毒高效。本發明公開了一種測定方法，其特徵是先對一批次的多組小白鼠分別進行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，尋求導致小白鼠胸腺萎縮呈線性關係的劑量範圍；接著在該劑量範圍對同一批次的多組小白鼠分別進行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，連續數天給藥後，稱重，將小白鼠斷頸處死，剖取胸腺稱重，計算比較兩者胸腺指數，將生物效價法和LD50法結合起來控制雷公藤多苷的質量。
文檔編號G01N33/48GK1727894SQ20041005335
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月28日 優先權日2004年7月28日
發明者金春暉, 吳錦權, 章美英, 朱承偉 申請人:浙江得恩德製藥有限公司