一種南極低溫適生解澱粉芽孢桿菌EZ15‑07及其應用的製作方法

2023-12-05 01:29:26

本發明屬於生物技術和農業病害防治
技術領域：
，涉及一種南極低溫適生解澱粉芽孢桿菌ez15-07及其應用。
背景技術：
：近年來在河北等地區大規模爆發了一種由菠蘿泛菌(pantoeaananatis)引起的玉米細菌性褐腐病，症狀表現為葉梢枯死捲曲，葉脈產生黃色病斑，莖稈處黃褐色幹腐。長期以來人們對玉米細菌性病害關注較少，由於缺乏有效的防控手段，玉米細菌性病害給農業生產帶來的損失往往十分嚴重。我國是玉米生產和消費大國，玉米播種面積以及產量都位居世界第二。近年來，由於玉米播種面積擴大、氣候條件變化、新品種的推廣以及耕作制度的改變，玉米病害的發生呈上升趨勢，給農業生產以及食品安全帶來了嚴重危害。河北是玉米種植大省，無論種植面積還是產量均居華北地區首位，玉米病害是影響河北地區玉米產量與品質的主要原因。以往多採用化學農藥防治田間病害的發生，但該種防治方式的弊端日漸突出：一方面容易使病原菌產生抗藥性，另一方面更與國家大力倡導的「兩減」政策相違背。目前，很多人開始從生防的角度來尋找答案，並且已經有很多生物農藥應用於生產實踐中，已經取得了很好的經濟效益和生態效益。根際微生物種類繁多，其中，有很多細菌能夠促進植物生長、防治植物病害、增加作物產量等，這類微生物一般被稱為根圍促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,簡稱pgpr)。他們與植物之間有很好的互利共生關係，不僅能使植物產生誘導抗病性，而且可以提高作物的產量和品質。所以，根圍促生菌在植物病害防治中有很重要的應用價值。技術實現要素：本發明提供一種解澱粉芽孢桿菌，有針對性地解決當前植物病害防治中存在的問題。該菌為低溫適生菌，對玉米細菌性褐腐病菌等病原菌有抑菌效果，有潛在的生防價值。本發明的另一目的是提供該解澱粉芽孢桿菌的應用。本發明涉及的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07，於2016年12月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為cgmccno.13494。所述解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494，是一種從南極企鵝聚集地土壤中分離得到的生防芽孢桿菌。經80℃水浴後稀釋塗平板獲得。所述解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494為革蘭氏陽性細菌，杆狀。所述解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494的16srrna的部分核苷酸具有如序列表seqidno.1所示序列。所述解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494的gyrb的部分核苷酸具有如序列表seqidno.2所示序列。本發明涉及的菌株，參照《芽孢桿菌屬》(蔡妙英等譯.農業出版社，1988年)和《微生物分類學》(張繼忠.上海復旦大學出版社，1995)的檢索表進行檢索，對其在生理生化上進行鑑定，以及16srrna和gyrb基因序列結果，經多相分類鑑定為解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)，命名為ez15-07。所述解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07cgmccno.13494能在10℃生長，是一種低溫適生菌。一種由所述的解澱粉芽孢桿菌ez15-07製備的生防菌劑。所述的生防菌劑優選通過以下方法製備得到:將ez15-07菌株接種在lb培養基上，過夜培養，然後將活化的ez15-07菌株轉接到landy培養基中進行搖瓶發酵，溫度為30℃，搖床轉速為200rpm，發酵時間35-40小時至菌量達到2.06×109cfu/ml；其中landy培養基組成為：20g葡萄糖，5gl-穀氨酸，0.5gmgso4，0.5gkcl，1gkh2po4，0.15mgfe2so4·6h2o，5.0mgmnso4·h2o，0.16mgcuso4·5h2o，ph7.0，1000ml蒸餾水。所述的解澱粉芽孢桿菌ez15-07在抑制玉米細菌性褐腐病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、小麥赤黴病菌和/或玉米輪枝鐮孢菌中的應用。應用方法是發酵培養ez15-07獲得發酵液，對發酵液進行稀釋後葉面噴施。所述的解澱粉芽孢桿菌ez15-07在製備防治玉米細菌性褐腐病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、小麥赤黴病菌和/或玉米輪枝鐮孢菌的生防菌劑中的應用。本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株，是一種對玉米細菌性褐腐病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、小麥赤黴病菌和/或玉米輪枝鐮孢菌有良好防效的芽孢桿菌，是一種低溫適生菌，對環境無汙染，具有潛在的應用價值。附圖說明圖1ez15-07生長情況a為ez15-07，b為對照菌株fzb42，c為ez10-01圖2ez15-07對玉米細菌性褐腐病菌的抑菌效果圖3ez15-07對玉米細菌性褐腐病的田間防效a為ck，b為ez15-07圖4ez15-07菌株對水稻白葉枯病菌的抑菌效果圖5ez15-07菌株對水稻細菌性條斑病菌的抑菌效果圖6ez15-07對小麥赤黴病菌的抑菌效果圖7ez15-07對玉米輪枝鐮孢菌的抑菌效果生物材料保藏信息ez15-07，分類命名為解澱粉芽孢桿菌bacillusamyloliquefaciens，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年12月26日，保藏地位為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13494。具體實施方式下面結合實施例進一步說明本發明。實施例1：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的篩選。用於分離的土壤樣品均來自南極企鵝聚居地，土樣採集於距地面10-15cm處。稱取5g土樣於45ml生理鹽水中，搖床上震蕩30分鐘，靜置使澄清。吸取上清液分別用無菌水稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五個濃度梯度，80℃水浴10min。吸取200μl塗lb平板，37℃過夜培養。待平板上長出菌落後，挑取單菌落，劃線純化後編號保存。實施例2：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的抗低溫篩選過程。具體實施步驟：培養基：1c培養基成分濃度1×1c5×1c蛋白腖0.74.2g21g氯化鈉0.53g15g大豆粉0.31.8g9g總體積加水至600ml加水至600ml土壤浸出液終培養基成分終濃度體積(ml)5×1c1×5020％葡萄糖0.1％1.25土壤浸出液10％25水173.75將菌株接種到上述液體培養基中，37℃培養過夜，取10μl菌液點到距離固體培養基平板中心2.5cm的十字交叉點，每個菌株5個重複，分別放置在4℃、10℃、14℃、18℃、30℃培養箱中培養，每天記錄菌株生長情況，記錄15天。該菌株能在溫度≤10℃的環境中生長，我們將在此溫度下，能在一周內顯現菌落的菌株記為低溫生長菌株。進一步測試該菌株可以在10℃的條件下生長，且平板培養7d後，將平板上顯示出菌落的區域連同培養基一併從平板上剝離，置於離心管中並加入1ml無菌水震蕩10min。震蕩後取上清稀釋塗平板計數。此時，菌量增長為5.85×107cfu/ml，是初始菌量的2.9倍。菌量的增長率是對照菌株fzb42的2.72倍。生長情況如附圖1所示。實施例3：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的16srrna基因的pcr擴增和序列測定。將該菌株接種於液體lb培養基，180rpm，37℃震蕩培養10小時，離心收集菌體，懸浮後加入溶菌酶和sds破壁，採用酚—氯仿法提取基因組dna，用正向引物27f(5』-agagtttgatcmtggctcag-3』)和反向引物1492r(5』-ggytaccttgttacgactt-3』)，對16srrna基因進行pcr擴增，將其進行pcr產物回收以後送測序進行測序。pcr條件為：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。16srrna基因序列長度約為1400bp，在genbank中與bacillusamyloliquefaciensrx-34相似性為99％。其結果如seqidno.1所示。實施例4：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的gyrb基因的pcr擴增和序列測定。將該菌株接種於液體lb培養基，180rpm，37℃震蕩培養10小時，離心收集菌體，懸浮後加入溶菌酶和sds破壁，採用酚—氯仿法提取基因組dna，用正向引物up1f(5』-gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggnggnaarttyga-3』)和反向引物up2r(5』-agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngcrtcngtcat-3』)，對gyrb基因進行pcr擴增，將其進行pcr產物回收以後送測序進行測序。pcr條件為：95℃，4min；94℃，1min；62℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。gyrb基因序列長度約為1200bp，在genbank中與bacillusamyloliquefacienscc178相似性為100％。其結果如seqidno.2所示。參照《芽孢桿菌屬》(蔡妙英等譯.農業出版社，1988年)和《微生物分類學》(張繼忠.上海復旦大學出版社，1995)的檢索表進行檢索，對其在生理生化上進行鑑定，以及16srrna和gyrb基因序列結果，經多相分類將細菌ez15-07鑑定為解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)。實施例5：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株的發酵培養。將ez15-07菌株接種在lb培養基上，過夜培養，然後將活化的ez15-07菌株轉接到landy培養基中進行搖瓶發酵，溫度為30℃，搖床轉速為200rpm，發酵時間為38小時。其中landy發酵培養基組成為：20gglucose，5gl-glutamicacid，0.5gmgso4，0.5gkcl，1gkh2po4，0.15mgfe2so4·6h2o，5.0mgmnso4·h2o，0.16mgcuso4·5h2o，ph7.0，1000mldistilledwater。搖瓶發酵38h後菌量達到2.06×109cfu/ml。實施例6：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對玉米細菌性褐腐病菌的抑菌作用。採用平板抑菌法，吸取5ml液體培養18h的玉米細菌性褐腐病病原菌菌液於放涼至50℃左右的lb培養基中搖勻後倒平板吹乾。在上述平板中放入無菌濾紙片，吸取液體培養18h的芽孢桿菌菌液5μl滴加於濾紙片之上，37℃恆溫培養20h。觀測ez15-07對玉米細菌性褐腐病菌的抑菌效果，抑菌圈平均直徑為12.3mm，如附圖2所示。實施例7：通過發酵液能夠抑制玉米細菌性褐腐病，具體過程為：對菌株ez15-07進行發酵，發酵液稀釋100倍後進行葉面噴施處理。在玉米的灌漿期進行葉面噴施，其生防效果可達59.3％。發酵培養條件為：將ez15-07菌株接種在lb培養基上，過夜培養，然後將活化的ez15-07菌株轉接到landy培養基中進行搖瓶發酵，溫度為30℃，搖床轉速為200rpm,發酵時間為38小時。田間防效如附圖3所示。實施例8：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對水稻白葉枯病菌的抑菌作用。採用平板抑菌法，在150ml的na培養基中加入培養好水稻白葉枯病菌5ml，倒na平板，每個平板放四個滅菌的濾紙片，然後吸取5μl的芽孢桿菌菌懸液滴在濾紙片上，28℃培養3天後觀察結果。重複3次，觀測菌株ez15-07對水稻白葉枯病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直徑為25.3mm，如附圖4所示。實施例9：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對水稻細菌性條斑病菌的抑菌作用。採用平板抑菌法，在150ml的na培養基中加入培養好水稻細菌性條斑病菌5ml，倒na平板，每個平板放四個滅菌的濾紙片，然後吸取5μl的芽孢桿菌菌懸液滴在濾紙片上，28℃培養3天後觀察結果。重複3次，觀測菌株ez15-07對水稻細菌性條斑病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直徑為15.1mm，如附圖5所示。實施例10：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對小麥赤黴病菌的抑菌作用。採用平板對峙法，倒好pda平板，在平板中央放置直徑1cm的小麥赤黴病菌菌塊，在其四周距離2cm處對稱放置四個濾紙片，在濾紙片上滴加5μl的芽孢桿菌發酵液，重複三次，在25℃光照培養箱中培養3天，觀測ez15-07對小麥赤黴病菌的抑菌效果，抑菌圈平均直徑為31mm，如附圖6所示。實施例11：本發明提供的解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07菌株對玉米輪枝鐮孢菌的抑菌作用。採用平板對峙法，倒好pda平板，在平板中央放置直徑1cm的玉米輪枝鐮孢菌菌塊，在其四周距離2cm處對稱放置四個濾紙片，在濾紙片上滴加5μl的芽孢桿菌發酵液，重複三次，在25℃光照培養箱中培養3天，觀測ez15-07對玉米輪枝鐮孢菌的抑菌效果，抑菌圈平均直徑為22mm，如附圖7所示。南京農業大學一種南極低溫適生解澱粉芽孢桿菌ez15-07及其應用211451dna解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-0716srrna1gacggggcgctctatactgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttag60cggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaa120accggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttc180ggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcacc240aaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacgg300cccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacgg360agcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaa420caagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaac480tacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgt540aaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagg600gtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcgg660tgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaact720gacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgcc780gtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcat840taagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggc900ccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtc960ttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtg1020gtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgca1080acccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaa1140ccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacg1200tgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatc1260tgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaat1320cgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac1380cacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggaccagccgccgaaggg1440acagagtt144821138dna解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ez15-07gyrb基因2cgcgctttttcaagattaaaatcttctccgattcctgttccgagggccgtgatcattgat60ctgacctcattgtttgagagaattttatcaagtctggctttctcaacgttcagaatctta120ccgcgcagcggcagaatggcttggaaatgacggtcccgtccctgtttcgctgatccgccc180gcagagtcaccctctacgatatacagctcggaaatgctcggatctttagaagaacagtcc240gccagtttgcccggcagattggaaatctcaagcgcacttttgcggcgggtcaattcccgc300gcttttttcgctgccatccgcgctcttgcggccattaaacctttttcaacgattttgcgg360gctgagtccggattttcaagaaggaatgtttccagcgcagaagaaaacagcgtatcagtg420atcgttctcgcttcggagttgccgagcttcgttttcgtctgcccttcgaattgcggatca480gggtgcttaattgaaataatggcagtcagcccttctctcacatcatccccgcttaaattc540ggatcattttctttgaaaatcccttttcttcttgcatagtcgtttatgacacgggtcaga600ccggttttaaatccggcttcgtgcgtcccgccttcgtatgtgttgatgttatttgtgaaa660gaataaatgttgcttgtatagctgtcgttgtattgcaacgcaacttcaaccgttatgccg720tctttctcgccttcgatataaatcggctcttcatgaacgacttctttggaacggtttaag780tactcaacatagcttttgattccgccttcgtagtggtactcgtttttccgttcttgtcct840tcacgtttgtcttcaatcgtgatgtttacgccttttgtcaggaaggccaattcccggaca900cggtttgaaagcagatcatagtcgtatacgattgtttctttgaagatttccggatccgga960acgaagtgcgtaatcgttccggtcttatcagtatcaccgatcacttcaagatcagccaca1020ggtacaccgcgctcgtacgcctgatagtggatttttccgtcacgatgaaccgtaacgtca1080agagtggtcgacaaggcgtttacgacggacgcccctacaccgtgaagaccgccggata1138當前第1頁12