日本血吸蟲Ago蛋白、基因、小RNA及其用途的製作方法

2023-12-01 01:06:51 2

專利名稱：日本血吸蟲Ago蛋白、基因、小RNA及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及日本血吸蟲Ago蛋白、基因及其小RNA及其用途。背景資料血吸蟲病由血吸蟲感染引起，包括日本血吸蟲(Schistosoma japonic·)，曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)禾口埃及血吸蟲(Schistosoma haematobium),在世界上有 76 個國家和地區遭受危害，受感染者約1.5億。在我國流行的是日本血吸蟲。血吸蟲病的流行給人民身體健康和經濟發展造成了巨大的損失。因此，防治血吸蟲病、開發研製治療血吸蟲病和抗血吸蟲的藥物具有巨大的社會和經濟效益。研製新的治療血吸蟲病和抗血吸蟲的藥物，首先必須找到合適的藥物作用靶位。 近十餘年，研究表明小編碼 RNA，包括 siRNA(small interfering RNA)、miRNA(microRNA) 和piRNA(piwi interacting RNA)，在生物體生長發育過程中起著重要的調控作用。隨著對小編碼RNA研究的不斷深入，越來越多與之相互作用的蛋白也開始引起人們的關注。Arg0naUte(Ag0)蛋白是其中重要一員，它通過與小編碼RNA選擇性結合，在生物體生長發育過程中發揮著重要作用。Ago蛋白是約IOOkD的鹼性蛋白家族，其成員通常含 PAZ (PIffI-Argonaute-Zwi 11 Ie)和PIWI兩個結構域，因此，通常將Ago蛋白分成PAZ和PIWI 兩個亞家族。大多數生物都有多種Ago家族蛋白，不同的Ago通常具有不同的功能。目前， 未見有關日本血吸蟲Ago蛋白的研究報導，但利用體外合成的小幹擾RNA分子可成功將血吸蟲蟲體體內基因敲降，並在血吸蟲不同發育時期表達一系列非編碼小RNA分子，{可引用 ^^E^^JCW. :In vitro and in vivo evaluation of small interference RNA-mediated gynaecophoral canal protein silencing in Schistosoma japonicum. Cheng G, Fu Z, Lin J, Shi Y, Zhou Y, Jin Y, Cai Y.J Gene Med. 2009May ； 11 (5) :412-21}.提示 Ago 蛋白在血吸蟲的生長發育中可能發揮著重要作用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一類日本血吸蟲Ago基因、蛋白及小RNA及其用途。為此，一方面，本發明公開了一類日本血吸蟲Ago蛋白，為如下(a)或(b)的蛋白質(a)其胺基酸序列如SEQ ID NO. 1 3所示的蛋白質中之一；(b)在(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸或修飾且具有抗細胞凋亡活性的由(a)衍生的蛋白質中之一。另一方面，本發明還公開了一種編碼本發明所述日本血吸蟲Ago蛋白的基因。在一實施例裡，所述基因為SEQ ID N0. 4 6所示核酸序列中之一。另一方面，本發明還公開了一種包含上述基因的重組表達載體。在一些實施方式中，所述重組表達載體可為原核表達載體或真核表達載體，其中優選真核表達載體。另一方面，本發明還公開了一種包含本發明所述重組表達載體的轉化體。另一方面，本發明公開了一種日本血吸蟲小RNA分子，分別具有如下特徵(a)具有SEQ ID NO. 7-15所示核酸序列中之一；或(b)由(a)的小RNA分子發生一個或幾個核酸置換、缺失或插入而形成的具有(a) 相同種子序列的小RNA分子。所述種子序列通常為物種間非常保守的2-6核苷酸，一般位於小RNA的第2_8位。較佳地，所述小RNA分子的核酸序列為SEQ ID NO. 7 15所示核酸序列中之一。另一方面，本發明公開了一種編碼上述小RNA分子的基因，為SEQ IDN0. 16-25所示的核苷酸序列中之一；或與SEQ ID NO. 16-25所示的核苷酸序列中每條序列的互補序列中之一；或與SEQ ID NO. 16-25所示的核苷酸序列中每條序列有至少70%同源性、且編碼相同小RNA分子序列中之一；較佳地，所述基因是具有SEQ ID NO. 16-25所示的核酸序列。另一方面，本發明還提供了一種特異性識別日本血吸蟲Ago蛋白的抗體，其特徵在於所述抗體的免疫原為本發明上述蛋白。另一方面，本發明還提供了日本血吸蟲Ago蛋白在製備防治和/或治療日本血吸蟲病藥物中的用途。此外，本發明還提供了日本血吸蟲小RNA分子在製備血吸蟲病診斷試劑中或製備防治和/或治療日本血吸蟲病藥物中的用途。本發明首次公開了日本血吸蟲Ago蛋白和日本血吸蟲小RNA分子。本發明所提供的日本血吸蟲Ago蛋白和日本血吸蟲小RNA分子可作為抗血吸蟲藥物的作用靶點，從而在開發研製預防或治療血吸蟲病的藥物的過程中發揮重要作用。另外，本發現中的血吸蟲小 RNA分子可作為血吸蟲病診斷的標誌分子。


圖1日本血吸蟲Ago蛋白的表達；圖2特異性抗體識別日本血吸蟲Ago蛋白；圖3日本血吸蟲小RNA分子在血吸蟲病中的檢測。
具體實施例方式下文將進一步詳細討論本發明的多個方面。在本發明中，術語「日本血吸蟲Ago蛋白，，指具有日本血吸蟲具Ago家族蛋白特徵的SEQ ID 1-3所示胺基酸序列的蛋白質。該術語還包括具有與日本血吸蟲Ago蛋白相同功能的SEQ ID 1-3序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為 1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代， 以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個相似或相近的胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。
在本發明中，術語「編碼日本血吸蟲Ago蛋白的基因」指編碼具有日本血吸蟲Ago 蛋白家族的核苷酸序列，如SEQ ID 4-6所示的核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID 4-6序列中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID 4-6所示核苷酸序列的同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出SEQ ID 1-3所示的胺基酸序列。在本發明中，術語「日本血吸蟲一組小RNA分子」指具有日本血吸蟲具SEQ ID 7-15所示核酸序列的小分子。該術語還包括具有與日本血吸蟲小RNA分子相同功能的SEQ ID 7-15序列的變異形式。這些變異形式包括核酸的缺失、插入和/或取代，以及在3末端和/或5末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)核酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的核酸進行取代時，通常不會改變分子的功能。又比如，在3末端和/或5末端添加一個或數個相似或相近的核酸通常也不會改變分子的功能。在本發明中，術語「編碼日本血吸蟲小RNA基因」指編碼具有日本血吸蟲小RNA序列(SEQ ID 7-15)基因的核酸序列，如SEQ ID 16-25所示的核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID 16-25序列中，有一個或多個位於小RNA非編碼區的序列發生變化，也能編碼出SEQ ID 7-15所示的小RNA序列。本發明包括編碼本發明所述蛋白的DNA以及含有這些DNA的載體、轉化體。本發明中，轉化體(transformant)，即帶有異源DNA分子的受體細胞。本發明還包括通過合成和重組技術生產本發明所述蛋白的方法。通過本領域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、宿主細胞和生物體。用於本發明的載體可以是如噬菌體、質粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉錄病毒載體。可用於克隆和/或表達本發明的多核苷酸的載體是能在需複製和/或表達多核苷酸的宿主細胞中複製和/或表達多核苷酸的載體。一般說來，多核苷酸和/或載體可用於任何真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網織紅細胞)、大鼠、倉鼠(如CH0、NS0和幼倉鼠腎細胞)或小鼠細胞(如L細胞))、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞(如大腸桿菌)。有關適用於多種類型宿主細胞的適當載體的例子可參見例如 F. Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。可以使用含有這些多核苷酸的宿主細胞來大量表達可用於例如藥物、診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質。已開發出多種方法用於經由互補的粘性末端使DNA與載體可操作相連。例如，可在欲插入載體DNA內的DNA區段添加互補的同聚體序列片段。然後通過互補同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區段以形成重組DNA分子。含有一或多種限制性位點的合成接頭提供了另一種連接DNA區段與載體的方法。 用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過內切核酸酶限制性消化產生的 DNA區段，所述的兩種聚合酶用其3'，5』-核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，並用其聚合活性補平3』-凹端。因此，這些活性的聯合產生了平端DNA區段。然後在能催化平端 DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶的存在下將平端區段與大摩爾過量的接頭分子一起保溫。因此，反應產物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區段。然後用適當的限制性酶裂解這些DNA區段，並連接至已用酶裂解的表達載體中，所述酶能產生與所述DNA區段相容的末端。從多個商家可以買到含有多個限制性內切核酸酶位點的合成接頭。多核苷酸插入物可操作地連接於同表達多核苷酸的宿主細胞相容的適當啟動子上。啟動子可以是強啟動子和/或誘導型啟動子。列舉的一些啟動子的例子包括噬菌體久 PL啟動子、大腸桿菌lac、trP、phoA、tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉錄病毒 LTR啟動子。其它適當啟動子是本領域技術人員已知的。表達重組載體進一步含有轉錄起始、終止位點，並在轉錄區含有用於翻譯的核糖體結合位點。重組載體表達的轉錄物的編碼部分可包括位於起點處的翻譯起始密碼子和適當地位於被翻譯多肽的末端的終止密碼子 (UAA，UGA 或 UAG)。如上所述，表達載體可包括至少一個選擇標記。所述標記包括對真核細胞培養物而言的二氫葉酸還原酶、G418、穀氨醯胺合酶或新黴素抗性；以及用於大腸桿菌和其它細菌培養的四環素、卡那黴素或氨卞青黴素抗性基因。適當宿主的代表性例子包括但不限於細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲細胞，如果蠅S2和夜蛾SF9細胞；動物細胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。上述宿主細胞的適當培養基和培養條件是本領域已知的。本發明還包括含有本發明的核苷酸序列的宿主細胞，所述核苷酸序列經本領域已知的技術與一或多種異源控制區(如啟動子和/或增強子)可操作相連。可以選擇能調節插入的基因序列的表達，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產物的宿主菌株。在某些誘導物的存在下，某些啟動子啟動的表達會升高；因此，可以控制經基因改造的多肽的表達。另外，不同宿主細胞具有特徵性的和特殊的翻譯、翻譯後加工和修飾(如磷酸化、裂解) 蛋白質的機制。可以選擇適當的細胞系以確保對表達的外源蛋白質進行合乎需要的修飾和加工。通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其它方法，即可將本發明的核酸和核酸重組載體導入宿主細胞。所述方法描述於多個標準的實驗室手冊中，如Davis et al. ,BasicMethods In Molecular Biology (1986)。編碼本發明的蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標記的載體連接以在宿主中增殖。 一般說來，可在沉澱物，如磷酸鈣沉澱物或其與帶電脂質的複合物中導入質粒載體。如果載體是病毒，可使用適當的包裝細胞系在體外對其進行包裝，再轉導至宿主細胞。通過眾所周知的技術可以鑑定出被成功轉化的細胞，即含有本發明的DNA重組載體的細胞。例如，可培養導入表達重組載體所得的細胞以產生所需多肽。收集並裂解細胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent et al (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，檢測其DNA內容物中DNA的存在。或者，使用抗體檢測上清液中蛋白質的存在。通過眾所周知的方法從重組細胞培養物中回收和純化本發明的人重組chemer in 蛋白較為有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層析。 在一些實施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進行純化。在一些實施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發明的所述蛋白。 在其它實施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本發明的人重組chemerin蛋白，所述層析柱有Q sepharose FF 柱、SP sepharose FF 柱、Q sepharose High Performance 柱、Blue sepharose FF柱、Blue 柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF或Methyl 柱。另外，可使用國際公開號W000/44772(全文列入本文作為參考)中描述的方法純化本發明所述蛋白。本領域技術人員可以容易地改動其中所述的方法以用於純化本發明所述蛋白。可以從包括例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞的原核或真核宿主經重組技術產生的產物中回收本發明所述蛋白。在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來製備針對日本血吸蟲Ago蛋白的抗體。例如，將提純的日本血吸蟲Ago蛋白產物或它的抗原片段注射入動物體內，產生多克隆抗體。同樣，表達日本血吸蟲Ago蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物免疫而產生抗體。本發明製備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術製備。在本發明中，應用日本血吸蟲Ago蛋白和/或一組小RNA分子，可以作為血吸蟲治療藥物的作用靶位，從而在開發研製預防或治療血吸蟲病的藥物的過程中發揮重要作用。 另外，本發現中的血吸蟲小RNA分子可作為血吸蟲病診斷的標誌分子。無需進一步描述，可以相信本領域技術人員可使用上文的描述和下文性的實施例來製備和利用本發明中檢測到的改變並且實踐所要求的方法。因此，下述工作實施例具體描述了本發明的某些實施方案，不能將其看成是對其餘內容的限制。實施例1日本血吸蟲Ago蛋白基因的克隆(1)日本血吸蟲總RNA抽提。日本血吸蟲尾蚴感染紐西蘭大耳兔14天後，收集日本血吸蟲童蟲，液氮中保存待用。利用Trizol法提取血吸蟲總RNA，並利用DNA酶處理所得總RNA，去除基因組汙染。(2)日本血吸蟲Agol蛋白的RACE和RACE擴增和全長克隆以人和鼠的Ago蛋白胺基酸序列查詢日本血吸蟲EST庫中(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)獲得1個日本血吸蟲的相應EST片段(GenBank登錄號AY809756. 1)， 長701bp，不含完整的0RF。以該EST序列為模板設計合成5' RACE引物(5GSP1 :5 『 -GAC TAG GTC GAG AAG TGC CTTGAA TAC CA-3' ；5GSP2 5' -ACG CAT GCT TCA CGT ATT GCA CGG AGT TC-3' ；5GSP 3 5' -CGA GCA GGT GGC TCA AAC TGT ATA AGG TG-3' ；5GSP4 5' -CAACTT GGT CCG CTG GTC CGT TAC CAA TC-3)，具體實驗步驟按 5『 -Full RACE Kit 操作手冊進行。將RACE產物克隆到pMD19-T Vector中，挑選陽性克隆，進行序列測定分析。根據生物信息學分析獲得的日本血吸蟲EST片段(GenBank登錄號AY809756. 1) 設計引物(3GSP1 5' -GTG GGA TGA TAA TAG ATT CAG CG-3 ；3GSP25' -GTT ATG TCA TAC ATA TGT ACG TTG-3，進行；TRACE擴增。將RACE產物克隆到pMD19_T Vector中，挑選陽性克隆，進行序列測定分析。將3、RACE和5、RACE擴增獲得的序列進行電子延伸，根據電子延伸的全長的Agol 序列，設計引物(Forwa rd CCG GAA TTC ATG CTG AAT ATG TAT GGAACT ATT ；Reverse CCC GCT CGA GTG AAT GGA GGT TGA CTG GTG)，利用日本血吸蟲cDNA為模板，進行擴增，獲得的 PCR產物進行測序分析，進一步驗證全長cDNA的獲得。(2)日本血吸蟲Ago2和Ago 3蛋白的RACE和RACE擴增和全長克隆Ago3
根據Genbank登錄號為AY814744. 1和AY813675. 1的序列分別設計針對Ago2和 Ago 3 的 3，RACE 引物(Agol :3GSP1ATG TCA CTC ACC CAG CTC CCA CTC, 3GSP2TAT TTT ACC GCG ATG GCG TGT CAGA ；Ago3 =GSPl :5~CAC GGA ATG TGGAAC CAG GAA CT ，GSP2 :5~TTC CCA TTT AGC TGC ATT TCG TG 3、)，根據試劑盒說明書進行套式PCR，反應條件94°C，3分鐘，然後94°C，30秒；53°C，20秒；72°C，3分鐘，進行20循環擴增，最後72°C 10分鐘。PCR 產物克隆到PMDTM19-T載體，並將重組質粒轉入到大腸桿菌感受態細胞DH5 α。利用GSP2、 3~RACE試劑盒inner引物為引物進行PCR鑑定，將陽性重組克隆送北京六和華大基因科技股份公司上海測序部測序分析。按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書處理日本血吸蟲總 RNA獲得5、RACE cDNA模板。Genbank登錄號為AY813675. 1序列設計5、RACE引物GSPl 5~GCC TTC ATG AGA ACA AAT ATA GAA ATC A3~， GSP2 :5~TTC TGA ACG ACG ATA AAT GTA ATA GCA G3~ ；Genbank登錄號為ΑΥ814744. 1 設計5、RACE引物5GSP1 :GTG AAT AAC TCG AGC GTT AAC AAC CAC AGG 5'，5GSP2 :ATG CTG CAA CCG ATT GCT TTA GCT CTT C。根據試劑盒說明書進行套式PCR，將第二輪PCR按上述3』 RACE方法克隆、序列測定分析。將;T RACE和5、RACE擴增獲得的Ago2和Ago 3片段進行電子延伸，根據電子延伸的結果設計引物(Ago2 =Forward CGA GCT CCA TGT CTC AGA GAG GTTTCT, Rever se ATT TGC GGC CGC CTA CAG ATA AM CAT CCC AT ；Ago3 =ForwardCGC GGA TCC ATG GAG GAC GGG AGC TCG AAT, Rever se CGG AAT TCTTAC AAG AAA AAC ATT CCA TC)，利用日本血吸蟲 cDNA為模板，進行擴增，獲得的PCR產物進行測序分析進一步驗證全長cDNA的獲得。實施例2日本血吸蟲Ago蛋白重組表達和抗體製備(1)日本血吸蟲Agol蛋白的重組表達和抗體製備根據;TRACE和RACE擴增結果，選取PIWI保守功能域設計引物，sense 5 『 CTCGAATTCTCTTGGTGCAGATGTTAC 3' (2306-2323bp), anti-sense 5' GCGAAGCTTATGCGTTTAAAATTATGC 3『 (3102_3119bp) 並在上下遊引物分別引入Hindlll、EcoR I酶切位點序列，利用14d cDNA為模板進行PCR 擴增，利用Spin Column DNA Gel Extraction Kit回收擴增產物並對PCR產物進行酶切處理，將酶切處理的PCR純化產物連接到經相同酶切處理的表達載體pET28b(+)上，構建重組質粒pET28M+)-agol，並轉化到大腸桿菌BL21中培養。挑取陽性克隆分別進行PCR、酶切鑑定和測序驗證。將驗證為正確的單克隆轉至500mlLB培養基中37°C培養，以200rpm搖瓶培養誘導他。離心收集菌體，超聲裂解菌體蛋白，通過M柱純化蛋白，純化產物用SDS-PAGE 電泳檢測分析。將純化後蛋白免疫昆明系小鼠製備多克隆抗體。具體為，應用206佐劑乳化純化蛋白，免疫劑量為50 μ g/只/次，每隔14天背部皮下多點強化免疫1次，共4次，在第8周收集動物血清，-20°C保存備用。(2)日本血吸蟲Ago2和Ago 3蛋白的重組表達和抗體製備根據;T RACE和RACE 擴增結果，設計引物，上遊引入BamHI酶切位點，下遊引入終止密碼子TAA以及HindIII酶切位點(Ago2 =Forward CGC GGA TCC ATG TTA CAT TGTTTA TAT AGA, Rever se CCC AAG CTT CTA TAG ATA AAA CAT CCC ；Ago3 =ForwardCGC GGA TCC ATG GAG GAC GGG AGC TCG AAT, Rever se CCC AAG CTT TTA TTGCTG TAT GTC ATC AGT)。將 32d 血吸蟲蟲體總 RNA 反轉錄為cDNA以該cDNA為模板PCR擴增出約為717bp目標基因片段，將片段以及pET28a (+)均用BamHI和HindIII雙酶切後回收。將該回收目標片段連接到pET28a(+)，連接產物轉化B121。挑選單克隆經PCR和酶切鑑定均為陽性後送陽性克隆到北京六和華大基因科技股份公司上海測序部測序測序。構建重組表達載體pET28a-SjAG03，轉化BL21。將以PCR、酶切和測序鑑定均為陽性的菌pET28a-SjAG03/BL21接種於LB培養基，37°C，200rpm振蕩培養，當0D600 = 1.0時加入終濃度為0. 8mmol/L的IPTG誘導表達。在IPTG誘導後0h、lh、 au3h、4h、5h、不同時間點分別收集菌液，確定最佳誘導時間和相關誘導表達條件；同時以 SDS-PAGE電泳分析經超聲波裂解後的菌體蛋白，判定其表達狀況。選擇最佳表達時間大量表達蛋白，超聲波裂解收集蛋白，BBST NTA Resin蛋白純化柱純化重組蛋白。將純化的重組蛋白與206佐劑乳化抗原(體積比55 45)混合均勻，用30ug/只的劑量將重組蛋白免疫昆明系小鼠，每兩周免疫一次，共免疫三次後收穫抗體。昆明鼠免疫前和每次免疫後7d後進行採血，共採血4次。將免疫前、一免後7d、二免後7d、三免後7d血清1 200稀釋，用酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)檢測抗體效價。三免14d後收穫抗血清，-20°C保存，獲得針對Ago2和Ago3的抗體。(3) Western Blot法檢測抗體特異性日本血吸蟲總蛋白進行SDS-PAGE電泳，半乾轉法進行轉膜；5%的脫脂奶粉溶液(溶於PBST中)中室溫封閉2小時；免疫所得抗血清作為一抗進行孵育，4°C孵育過夜；PBST洗滌三次，每次5分鐘，然後抗兔IgG (AP標記)室溫孵育1-2小時，PBST洗滌三次，進行底物顯色，結果分別如圖1和圖2。實施例3RNA幹擾Ago蛋白影響日本血吸蟲的存活將紐西蘭大白兔腹部貼片感染 8000條日本血吸蟲的尾蚴，感染14天後將其剖殺，用37°C預熱的滅菌PBS (加入雙抗)在無菌條件下以門靜脈灌洗法收集蟲體，再用37°C預熱PBS洗蟲體兩遍，然後再用37°C預熱的 0.5%水解乳蛋白溶液洗兩次，去除洗液，添加童蟲培養基分至12孔培養板於37°C含有5% C02細胞培養箱中進行體外培養，每孔培養基為anl，蟲體約為100條。培養4h後，換新鮮培養基，加入新鮮兔紅細胞和 SiRNA(Si :sense 5' ACG CGU AAA UC⑶GA GAU ATT 3'， antisense 5' UAU CUC ACG AUU UAC GCG UTT 3' ；S2 :sense 5' GGG UAA AUC UGG UAA UAU ATT 3' ,antisense 5' UAU AUUACC AGA UUU ACC CTT 3' ；S3 :AG0_3075CCT GM ACA TT AAG AGT AA, sense 5' CCU GAA ACA UUA AGA GUA ATT 3'，antisense 5' UUA CUC UUA AUG UUUCAG GTT 3 ；Negat ive cont rol sense 5'-UUC UCC GM CGU GUC AC⑶TT-3， antisense 5' -ACG UGA CAC GUU CGG AG AATT-3，)。實驗共設空白，陰性對照，陽性對照，Si，S2，S3共6組，每組設3個重複孔，加入的siRNA終濃度為ΙΟΟηΜ，24h後更換一次童蟲培養基，加入新鮮兔紅細胞，以及siRNA。培養4 後觀察蟲體，去除培養基，收集蟲體，液氮保存。結果表明SiRNA持續幹擾日本血吸蟲三天後，觀察蟲體存活率以及蟲體活力發現空白組存活率較高，蟲體活動較活躍，而幹擾組存活率僅為空白組的52. 4%,39. 2-58. 4%, 蟲體活力較低。實施例4日本血吸蟲小RNA分子的發現收集血吸蟲不同發育時期蟲體(14天到32天)，雌雄蟲分開(圖3)，利用Trizol 提取總RNA，將提取的總RNA按圖2進行18_30nt大小的篩選，擴增，，在;T和5、端分別加上接頭，將加接頭的分子進行擴增，擴增結果利用solexia進行序列測定。將Solexa測序所得35nt小RNA進行分析，鑑定miRNA。
實施例5日本血吸蟲小RNA分子在血吸蟲病診斷中的應用將小鼠感染日本血吸蟲，在感染後的14天，對小鼠採血。利用Trizol分離血液中的總RNA，根據實施例4研究獲得小RNA分子設計引物，將分離的總RNA進行逆轉錄，獲得 cDNA,以此cDNA為模板，擴增上述研究發現的小分子RNA，將擴增的小分子RNA進行序列測定。結果表明應用本研究獲得小RNA分子，利用Stem-loop RT-PCR技術可檢測到感染血吸蟲的宿主血液中存在此分子(圖4)，提示這些小分子可作為血吸蟲病診斷的潛在標緻分子。本發明的範圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明範圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的範圍之內。上文提及的參考文獻皆全文列入本文作為參考。
權利要求
1.一種日本血吸蟲Ago蛋白，其特徵在於其為如下(a)或(b)的蛋白質(a)其胺基酸序列如SEQID NO. 1 3所示的蛋白質中之一；(b)(a)中所述胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸或修飾且具有抗細胞凋亡活性的由(a)衍生的蛋白質中之一。
2.一種編碼權利要求1所述日本血吸蟲Ago蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於所述基因的核酸序列為SEQID N0.4 6中之一。
4.一種包含權利要求2所述基因的重組表達載體。
5.一種包含權利要求4所述重組表達載體的轉化體。
6.一種日本血吸蟲小RNA分子，其特徵在於其為如下(a)或(b)的小RNA分子(a)具有SEQID NO. 7 15所示核酸序列中之一；或(b)由(a)的小RNA分子發生一個或幾個核酸置換、缺失或插入而形成的具有(a)相同種子序列的小RNA分子。
7.一種編碼權利要求6所述小RNA分子的基因，其特徵在於其核苷酸序列為SEQ ID NO. 16 25所示的核苷酸序列中之一；或與SEQ ID NO. 16 25所示的核苷酸序列中每條序列的互補序列中之一；或與SEQ ID NO. 16 25所示的核苷酸序列中每條序列有至少 70%同源性、且編碼相同小RNA分子序列中之一。
8.一種特異性識別權利要求1所述日本血吸蟲Ago蛋白的抗體，其特徵在於所述抗體的免疫原為本發明上述蛋白。
9.權利要求1所述日本血吸蟲Ago蛋白在製備防治和/或治療日本血吸蟲病藥物中的用途。
10.權利要求6所述小RNA分子在製備血吸蟲病診斷試劑中或製備防治和/或治療日本血吸蟲病藥物中的用途。
全文摘要
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及日本血吸蟲Ago蛋白、基因及小RNA及其用途。本發明首次公開了一種日本血吸蟲Ago蛋白，其特徵在於其為如下(a)或(b)的蛋白質(a)其胺基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的蛋白質；(b)(a)中所述胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸或修飾且具有抗細胞凋亡活性的由(a)衍生的蛋白質。
文檔編號A61K38/17GK102329386SQ20111024755
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月25日 優先權日2011年8月25日
發明者程國鋒, 羅榮 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所