一種神農香菊的離體培養方法

2024-02-25 20:15:15

一種神農香菊的離體培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種神農香菊的離體培養方法，以經滅菌的帶芽點幼嫩莖段為外植體，經過叢生芽的誘導、壯苗培養、生根、煉苗和移栽後獲得神農香菊再生植株，其中：所述帶芽點幼嫩莖段在滅菌前進行清洗，使用濃度為0.2-0.8％的洗潔精溶液浸泡20-40min，之後刷洗再用水衝洗1-2h；所述壯苗培養和生根培養時均在培養基中加入了野古草提取液和活性炭；並且在生根培養時對再生植株進行聲波刺激。本發明所述方法可高頻率地誘導出大量的神農香菊叢生芽，再生植株成活率高，可達100％，為提高神農香菊的繁殖係數、為該物種的種質保存及其遺傳轉化奠定了良好的基礎，應用前景廣闊。
【專利說明】一種神農香菊的罔體培養方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及神農香菊的繁殖技術，更具體地涉及一種神農香菊的離體培養方法。

【背景技術】
[0002] 神農香菊（Dendranthema indicum(L. )Des Moul. var. aromaticum Q. H. Liu et S. F. Zhang Var. Nov.)是武漢植物研究所劉啟宏先生1982年在神農架首先發現並命名的 一種新資源植物，多年生草本，葉片較小而厚，深綠色，上面葉脈明顯隆起，下面具凹陷極 小腺體，頭狀花序較小，通常直徑不超過1. 5釐米，與野菊的主要區別在於花、葉及根均具 有特殊的濃鬱香氣。神農香菊集中分布在神農架海拔2600-2700米的向陽開闊的山坡、 路旁，是神農架特有的菊科（Asteraceae)菊屬（Dendranthema)的一個新變種，形似野菊 (Dendranthema indicum(L.)Des Moul.)。鄂西山區民間以神農香菊陰乾的花、葉用於治療 感冒、咽喉腫痛、目赤腫痛、癰腳瘡癤等。化學成分分析表明神農香菊的揮髮油成分主要以 萜類中的單萜和倍半萜及其含氧衍生物為主。神農香菊揮髮油中的萜類化合物有菔烯、萜 品醇、側柏烯、樟烯、龍腦、1，8_桉葉油素、乙酸龍腦酯等化合物，藥理試驗分析表明這些成 分具有抗菌、抗病毒、鎮痙、祛痰、止咳平喘等作用；揮髮油不僅在醫藥上具有重要的作用， 還可用於飲料、香菸及化妝品等香料及日用化學工業上，其開發利用率高，經濟價值將十分 明顯。
[0003] 神農香菊的分布範圍窄，且資源十分有限。為此，很多研究人員都積極的進行神農 香菊的人工繁殖與栽培。技術人員分別對神農香菊進行了引種栽培試驗，通過植物組織培 養技術可快速獲得大量的再生個體，器官直接發生途徑獲得再生植株可有效地縮短培養周 期和減少變異環節，對擴大該物種的繁殖係數不失為一種有效方法。其中有以神農香菊的 幼葉為外植體及微扦插方式，建立神農香菊試管內繁殖體系。以神農香菊花蕾為外植體，成 功誘導神農香菊花蕾愈傷組織並獲得再生植株，但受材料來源限制。也有通過神農香菊離 體萌發腋芽誘導不定芽建立神農香菊離體再生體系，但其組培苗細弱和徒長的問題一直沒 有得到有效解決，其壯苗的優化體系也存在問題。基於上述問題，迫切需要通過外植體、植 物生長調節劑、基本培養基和培養條件的篩選，建立繁育周期短、遺傳穩定高頻率發生的神 農香菊再生體系，從而為神農香菊的生物技術育種、種質資源保存、快速繁殖、人為控制條 件下的生長發育研究提供良好的實驗體系。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種神農香菊的離體培養方法，可高頻率地誘導出大量的神 農香菊叢生芽，經過壯苗生根後再生植株成活率高，可達100%。
[0005] 本發明所述神農香菊的離體培養方法，以經滅菌的帶芽點幼嫩莖段為外植體，經 過叢生芽的誘導、壯苗培養、生根、煉苗和移栽後獲得神農香菊再生植株，其中：
[0006] 所述帶芽點幼嫩莖段在滅菌前進行清洗，所述清洗步驟為：使用濃度為 0.2-0.8%的洗潔精溶液浸泡20-401^11，之後刷洗，再用水衝洗1-211 ;因為神農香菊的幼嫩 莖段揮髮油含量較高，在幼嫩莖段上尤其是芽點位置容易粘結過多的灰塵，且不容易清洗。 所以，在清洗的時候加入微量的洗潔精可以有效去除幼嫩莖段上粘結的灰塵，確保帶芽點 幼嫩莖段更加潔淨，為叢生芽誘導成提供基礎。
[0007] 所述壯苗培養和生根培養時均在其培養基中加入了野古草提取液和活性炭；
[0008] 所述壯苗培養步驟中使用的壯苗培養基為，在MS基本培養基的基礎上添加了活 性炭、野古草提取液、6-苄基腺嘌呤（6-BA)和α-萘乙酸（NAA);
[0009] 優選地，所述壯苗培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0-2. Omg/L，α -萘乙酸的濃度 為0-2. Omg/L，活性炭的濃度為0. 2-0. 8 %，野古草上清液的濃度為5-10% ;
[0010] 所述野古草上清液的製備方法為取lg野古草乾燥粉末加入5ml蒸餾水，4°C下靜 置20h後，將所述0. 2g/ml的提取物冷凍離心提取，得野古草上清液。
[0011] 優選地，所述壯苗培養包括以下步驟：將所述壯苗培養基裝入錐形瓶中，將所述叢 生芽誘導培養獲得的叢生芽接種到所述壯苗培養基上，在溫度25±2°C，光照時間12-16h/ 天，光照強度2000-25001ux的條件下進行培養20-60天。
[0012] 優選地，所述生根培養包括以下步驟：將所述壯苗培養步驟獲得的叢生芽分離出 單株轉接到生根培養基上，在溫度25±2°c，光照時間12-16h/天，光照強度2000-25001UX 條件下誘導生根，在5天後開始，每天進行一次聲波刺激，時間30-60min，持續10-15天，所 用聲波的頻率為1000Hz，聲強為100dB。20-30天培養發育得再生苗；所述生根培養基為添 加了野古草提取液和活性炭的1/2MS培養基或者添加了活性炭的1/4-3/4MS培養基。
[0013] 優選地，所述叢生芽誘導培養包括以下步驟：所述叢生芽的誘導步驟具體為：將 經滅菌的帶芽點幼嫩莖段剪切成帶單個芽點的短莖段接種到叢生芽誘導培養基上，在溫度 25±2°C，光照時間12-16h/天，光照強度2000-25001ux條件下培養10-15天；
[0014] 所述叢生芽誘導培養基為，在MS基本培養基的基礎上添加0-2. 0mg/L的6-苄基 腺嘌呤、0-2. 0mg/L的α -萘乙酸。
[0015] 優選地，所述煉苗步驟具體包括：經生根培養獲得的再生植株長出6-8cm時，逐漸 打開瓶蓋，使再生植株與自然空氣接觸，在20-25°C下煉苗5-10天。
[0016] 優選地，在所述煉苗步驟之後進行移栽，即將經過煉苗的再生植株移栽到沙土 和椰蓉的混合基質中栽植，得到神農香菊成活再生植株，所述沙土和椰蓉的混合比例為 1 : 0· 25-1。
[0017] 在其中一個實施例中，本發明所述神農香菊的離體培養方法具體包括以下步驟：
[0018] (1)外植體滅菌：選取新萌生幼嫩帶芽莖段為外植體；對外植體進行滅菌的方法 為：將神農香菊幼嫩莖段去除葉片，在濃度例如為每100ml含4-8滴的洗潔淨液中浸泡 例如20-40min後刷洗，再用水衝洗l-2h，然後將其置於超淨工作檯上在75%酒精中浸泡 10-30s，隨後用每100ml含2-4滴土溫-40的0. 1 % HgC12溶液滅菌15min，用無菌水清洗 4次，每次l_3min。所述洗潔淨為市售的普通無磷洗潔淨即可，例如納愛斯集團有限公司生 產的雕牌洗潔淨等。
[0019] (2)叢生芽的誘導：以滅菌處理後帶芽點的神農香菊莖段為外植體，將其置 於叢生芽誘導培養基上誘導叢生芽；在溫度25±2°C，光照時間12-16h/天，光照強度 2000-25001ux條件下培養10-15天。所述叢生芽誘導培養基是在MS基本培養基的基礎上 添加了 6-苄基腺嘌呤（6-BA)和α -萘乙酸（NAA);其中6-苄基腺嘌呤的濃度為0-2. Omg/ L，優選為2. Omg/L，α -萘乙酸的濃度為0-2. Omg/L，優選為0· 05mg/L。
[0020] (3)壯苗培養：將所述叢生芽誘導培養獲得的叢生芽接種到壯苗培養基上，在溫 度25±2°C，光照時間12-16h/天，光照強度2000-25001ux的條件下進行培養20-60天，優 選30天。並且在5-15天後開始，每天進行一次聲波刺激，時間30-60min，所用聲波的頻率 為1000Hz，聲強為100dB。其中所述壯苗培養基為：在MS基本培養基的基礎上添加了活性 炭、野古草提取液、6-苄基腺嘌呤出-BA)和α-萘乙酸（NAA)。野外調查的過程中，發現在 神農香菊生長旺盛的地方，往往伴生有野古草，經研究發現野古草對神農香菊的生長發育 起到積極的感化作用，所以，在壯苗培養基中加入野古草提取液可以促進叢生芽的生長發 育，有利於獲得健壯的叢生芽，為提商再生植株的成活率打下基礎。
[0021] 優選地，所述壯苗培養基中6-苄基腺嘌呤的濃度為0-2. 0mg/L，優選為2. Omg/ L，α -萘乙酸的濃度為0-2. 0mg/L，優選為0. 05mg/L ;活性炭的濃度為0. 2-0. 8%，優選為 0. 5%，野古草上清液的濃度為5-10%，優選為10%。
[0022] (4)生根和植株再生：將壯苗培養後的健壯叢生芽分離出單株置於生根培養基上 誘導生根，得到神農香菊完整再生植株；所述生根培養基為添加了活性炭的1/4-3/4MS培 養基或在添加了活性炭和野古草提取液的1/2MS培養基。其中，所述生根培養基例如為 1/2MS培養基中添加0. 2%的活性炭和5%的野古草提取液。
[0023] 培養條件為：溫度25±2°C，光照時間12_16h/天，光照強度2000-25001ux。5天 後不定芽基部開始生根，並且在5天後開始，每天進行一次聲波刺激，時間30-60min，持續 10-15天，所用聲波的頻率為1000Hz，聲強為100dB。經過20-30天培養發育成完整植株，生 根率100%。為提高再生植株移栽後的成活率，可對步驟（4)中經生根培養後得到的再生植 株進行煉苗，方法為：待再生苗長出6-8cm時，逐漸打開瓶蓋，使再生植株與自然空氣接觸， 在20-25°C下煉苗5-10天後即可移栽。聲波刺激可以促進神農香菊根的發育，促進其快速 生根，有利於獲得根系發達的再生植株，從而提高成活率。
[0024] (5)煉苗和移栽：將步驟⑷中經生根培養後得到的再生植株進行移栽方法為：待 苗高6-8cm、根系密集健壯時，逐漸打開培養瓶蓋，使再生植株與自然空氣接觸，在20-25°C 溫度下煉苗5-10天後即可移栽。將經過煉苗的再生植株移栽到混合的沙土和椰蓉的混合 基質中栽植，混合基質中沙土和椰蓉的比例為：1 : 0.25-1。得到神農香菊成活再生植株， 成活率達98%。
[0025] 本發明提供了珍稀資源植物神農香菊的一種體外培養方法。該方法是以帶芽嫩莖 段作為外植體，通過叢生芽誘導途徑得到再生植株。以莖段為外植體進行離體再生的優勢 在於取材方便、可提供的材料充足。本發明所述方法可高頻率地誘導出大量的神農香菊叢 生芽，經過壯苗生根後再生植株成活率高，可達100%，而且通過不定芽再生具有再生植株 變異小和遺傳穩定性較高的優點。本發明為提高神農香菊的繁殖係數、為該物種的種質保 存及其遺傳轉化奠定了良好的基礎，應用前景廣闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發明所述神農香菊的離體培養方法中高頻發生的神農香菊叢生芽；
[0027] 圖2為本發明所述神農香菊的離體培養方法中經壯苗培養的叢生芽；
[0028] 圖3為本發明所述神農香菊的離體培養方法中神農香菊生根的單株苗；
[0029] 圖4為本發明所述神農香菊的離體培養方法中神農香菊再生植株根系；
[0030] 圖5為本發明所述神農香菊的離體培養方法中神農香菊移栽成活的再生植株。

【具體實施方式】
[0031] 下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文 字能夠據以實施。
[0032] 實施例1、神農香菊的離體培養
[0033] MS 基本培養基：可參照文獻（Murashige T，Skoog F. A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,1962,15 ： 473-497)配製。
[0034] 本發明所述神農香菊的離體培養方法，包括以下步驟：
[0035] (1)莖段外植體的滅菌
[0036] 先將神農香菊幼嫩莖段去除葉片，在濃度為每100ml含4-8滴的洗潔淨液（納愛 斯集團有限公司生產的雕牌洗潔淨）中浸泡20-40min後刷洗，再用水衝洗l-2h，然後將其 置於超淨工作檯上在75%酒精中浸泡10-30s，隨後用每100ml含2-4滴土溫-40的0. 1% HgC12溶液滅菌15min，用無菌水清洗4-6次，每次l-3min。
[0037] (2)叢生芽的誘導
[0038] 叢生芽誘導培養基：在MS基本培養基的基礎上添加了 6-BA 2. 0mg/L和 ΝΑΑ0. 05mg/L。
[0039] 以步驟（1)帶芽點的幼嫩莖段為外植體，將其置於所述叢生芽誘導培養基上，例 如每個培養瓶中接種6段，每個組合接種10個培養瓶，在溫度25±2°C，光照時間12-16h/ 天，光照強度2000-25001u X下誘導叢生芽。
[0040] 如圖1所示，外植體接種後第3天，腋芽長出。接種7天後，腋芽基部有顆粒狀突 起，接種10天後，叢基部生芽萌生長出。
[0041] (3)壯苗培養
[0042] 壯苗培養基：在MS基本培養基的基礎上添加了 6-BA 2. 0mg/L和NAA 2. 0mg/L，同 時添加0. 5%濃度的活性炭粉和10%的野古草提取液。
[0043] 將步驟（2)中誘導15天後獲得的叢生芽轉接入上述含有不同濃度活性炭的培養 基上進行壯苗培養，在溫度25±2°C，光照時間12-16h/天，光照強度2000-25001ux下進行 培養，在培養30天後生長健壯（圖2)。
[0044] (4)生根和植株再生
[0045] 生根培養基：1/2MS培養基（包含的大量和微量元素為MS基本培養基全量的1/2) 的基礎上添加了 0. 2%活性炭和5%的野古草提取液。
[0046] 將步驟（3)獲得的叢生芽分離出單株轉接到生根培養基上在溫度25±2°C，光照 時間12-16h/天，光照強度2000-25001UX下誘導生根，5天後不定芽基部開始生根，並且在 5天後開始，每天進行一次聲波刺激，時間40min，持續10天，所用聲波的頻率為1000Hz，聲 強為100dB。如圖3、圖4所示，經過20-30天培養發育成完整植株，生根率100%。
[0047] (5)煉苗和移栽
[0048] 將步驟（4)中經生根培養後得到的再生植株進行移栽方法為：待苗高6-8cm、根系 密集健壯時，逐漸打開培養瓶蓋，使再生植株與自然空氣接觸，在20-25°C溫度下煉苗5-10 天后即可移栽。將經過煉苗的再生植株移栽到按等比（1/4-3/4比例均可）混合的沙土和 椰蓉的混合基質中栽植，得到神農香菊成活再生植株，成活率達98% (圖5)。
[0049] 實施例2、神農香菊的離體培養
[0050] MS 基本培養基：可參照文獻（Murashige T，Skoog F. A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,1962,15 ： 473-497)配製。
[0051] 本發明所述神農香菊的離體培養方法，包括以下步驟：
[0052] (1)莖段外植體的滅菌
[0053] 先將神農香菊幼嫩莖段去除葉片，在濃度為每100ml含4-8滴的洗潔淨液（納愛 斯集團有限公司生產的雕牌洗潔淨）中浸泡20-40min後刷洗，再用水衝洗l-2h，然後將其 置於超淨工作檯上在75%酒精中浸泡10-30s，隨後用每100ml含2-4滴土溫-40的0. 1% HgC12溶液滅菌15min，用無菌水清洗4-6次，每次l-3min。
[0054] (2)叢生芽的誘導
[0055] 叢生芽誘導培養基：在MS基本培養基的基礎上添加了 6-BA 2. 0mg/L和 ΝΑΑ0. 08mg/L。
[0056] 以步驟（1)帶芽點的幼嫩莖段為外植體，將其置於所述叢生芽誘導培養基上，例 如每個培養瓶中接種6段，每個組合接種10個培養瓶，在溫度25±2°C，光照時間12-16h/ 天，光照強度2000-25001u X下誘導叢生芽。
[0057] 如圖1所示，外植體接種後第3天，腋芽長出。接種7天後，腋芽基部有顆粒狀突 起，接種10天後，叢基部生芽萌生長出。
[0058] 叢生芽誘導培養基除在含NAA濃度為1. 0-2. 0mg/L的培養基外植體愈傷化嚴重以 夕卜，在6-BA 2. 0mg/L和NAA 0. 05mg/L時叢生芽的誘導率最高，為83. 3%，1個腋芽基部可 萌生6-8個不定芽。在含有高濃度NAA (1. 0-2. 0mg/L)的MS培養基上愈傷化嚴重，不能誘導 出叢生芽。表明在神農香菊叢生芽的誘導過程中，6-BA是必需的，NAA具有一定抑制作用， 因此將叢生芽誘導培養基定為：在MS基本培養基的基礎上添加了 6-BA 0-2. 0mg/L和NAA 0-1. 0mg/L。若誘導產生的叢生芽繼續在原培養基上培養，叢生芽進一步密集萌生，但容易 發生玻璃化現象，導致不定芽畸形發育不正常。
[0059] (3)壯苗培養
[0060] 壯苗培養基：在MS基本培養基的基礎上添加了 6-BA 2. 0mg/L和NAA 2. 0mg/L，同 時添加0. 5%濃度的活性炭粉和8%的野古草提取液。
[0061] 將步驟（2)中誘導15天後獲得的叢生芽轉接入上述含有不同濃度活性炭的培養 基上進行壯苗培養，在溫度25±2°C，光照時間12-16h/天，光照強度2000-25001ux下進行 培養，在培養30天後生長健壯（圖2)。
[0062] 研究發現，在添加0. 5%活性炭的壯苗培養基上，細弱輕度玻璃化的叢生芽在培養 30天後生長健壯，可以用於生根和植株再生。過高濃度的活性炭培養基上不定芽生長緩慢， 可能是由於過多的活性碳粉吸附植物生長調節劑和營養成分所致。
[0063] (4)生根和植株再生
[0064] 生根培養基：1/2MS培養基（包含的大量和微量元素為MS基本培養基全量的1/2) 的基礎上添加了 0. 2%活性炭和5%的野古草提取液。
[0065] 將步驟（3)獲得的叢生芽分離出單株轉接到生根培養基上在溫度25 ±2°C，光照 時間12-16h/天，光照強度2000-25001UX下誘導生根，5天後不定芽基部開始生根，並且在 5天後開始，每天進行一次聲波刺激，時間30min，持續15天，所用聲波的頻率為1000Hz，聲 強為100dB。如圖3、圖4所示，經過20-30天培養發育成完整植株，生根率100%。
[0066] (5)煉苗和移栽
[0067] 將步驟（4)中經生根培養後得到的再生植株進行移栽方法為：待苗高6-8cm、根系 密集健壯時，逐漸打開培養瓶蓋，使再生植株與自然空氣接觸，在20-25°C溫度下煉苗5-10 天后即可移栽。將經過煉苗的再生植株移栽到按等比（1/4-3/4比例均可）混合的沙土和 椰蓉的混合基質中栽植，得到神農香菊成活再生植株，成活率達98%。
[〇〇68] 儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列 運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地 實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限 於特定的細節和這裡示出與描述的圖例。
【權利要求】
1. 一種神農香菊的離體培養方法，以經滅菌的帶芽點幼嫩莖段為外植體，經過叢生芽 的誘導、壯苗培養、生根、煉苗和移栽後獲得神農香菊再生植株，其中： 所述帶芽點幼嫩莖段在滅菌前進行清洗，所述清洗步驟為：使用濃度為0. 2-0. 8%的 洗潔精溶液浸泡20-40min，之後刷洗，再用水衝洗l-2h ; 所述壯苗培養和生根培養時均在其培養基中加入了野古草提取液和活性炭； 所述壯苗培養步驟中使用的壯苗培養基為，在MS基本培養基的基礎上添加了活性炭、 野古草提取液、6-苄基腺嘌呤和α-萘乙酸。
2. 如權利要求1所述的神農香菊離體培養方法，其特徵在於，所述壯苗培養基中 6_苄基腺嘌呤的濃度為0-2. Omg/L，α -萘乙酸的濃度為0-2. Omg/L，活性炭的濃度為 0. 2-0. 8%，野古草上清液的濃度為5-10% ; 所述野古草上清液的製備方法為按照lg野古草乾燥粉末加入5ml蒸餾水的比例浸提， 4°C下靜置20h後，將所述0. 2g/ml的提取物冷凍離心提取，得野古草上清液。
3. 如權利要求2所述的神農香菊離體培養方法，其特徵在於，所述壯苗培養包括以下 步驟：將所述叢生芽誘導培養獲得的叢生芽接種到所述壯苗培養基上，在溫度25±2°C，光 照時間12-16h/天，光照強度2000-25001ux的條件下進行培養20-60天。
4. 如權利要求1所述的神農香菊離體培養方法，其特徵在於，所述生根培養包括 以下步驟：將所述壯苗培養步驟獲得的叢生芽分離出單株轉接到生根培養基上，在溫度 25±2°C，光照時間12-16h/天，光照強度2000-25001ux條件下誘導生根，在5天後開始， 每天進行一次聲波刺激，時間30-60min，持續10-15天，所用聲波的頻率為1000Hz，聲強為 100dB ;20-30天培養發育得再生植株；所述生根培養基為添加了野古草提取液和活性炭的 1/2MS培養基或者添加了活性炭的1/4-3/4MS培養基。
5. 如權利要求1所述的神農香菊離體培養方法，其特徵在於，所述叢生芽誘導培養包 括以下步驟：將經滅菌的帶芽點幼嫩莖段剪切成帶單個芽點的短莖段接種到叢生芽誘導培 養基上，在溫度25±2°C，光照時間12-16h/天，光照強度2000-25001ux條件下培養10-15 天； 所述叢生芽誘導培養基為，在MS基本培養基的基礎上添加0-2. 0mg/L的6-苄基腺嘌 呤、0-2.0mg/L的α-萘乙酸。
6. 如權利要求1所述的神農香菊離體培養方法，其特徵在於，所述煉苗步驟具體包括： 經生根培養獲得的再生植株長出6-8cm時，逐漸打開瓶蓋，使再生植株與自然空氣接觸，在 20-25 °C下煉苗5-10天。
7. 如權利要求6所述的神農香菊離體培養方法，其特徵在於，在所述煉苗步驟之後進 行移栽，即將經過煉苗的再生植株移栽到沙土和椰蓉的混合基質中栽植，得到神農香菊成 活再生植株，所述沙土和椰蓉的混合比例為1 : 0.25-1。
【文檔編號】A01H4/00GK104094845SQ201410298286
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】梁宏偉, 廖明堯, 王長蘭, 王玉宇, 楊敬元, 楊林森, 王靜 申請人:三峽大學, 湖北神農架國家級自然保護區管理局