水稻條紋病毒rna幹涉載體、構建方法及應用的製作方法

2024-02-26 10:26:15

專利名稱：水稻條紋病毒rna幹涉載體、構建方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，特別是涉及一種適合單子葉植物遺傳轉化、的水 稻條紋病毒RNA幹涉載體、構建方法及其在水稻上應用。
背景技術：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國水稻佔糧食生產和消費的40%，其 在糧食安全和國民經濟中佔有舉足輕重的作用。由水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)引起水稻條紋葉枯病是我國粳稻種植區最重要的水稻病毒病害。流行年份，一般田塊 減產20 % 30 %，嚴重田塊達到80 %以上，甚至顆粒無收。該病在江蘇、安徽、河南和山東 等地，曾於2001、2004、2005、2006、2007年連續爆發成災。2004年在江蘇、河南等病田率達 75%以上，部分病重田的病穴率達90%以上；2005年，僅江蘇省發病面積就達2800萬畝，給 當地水稻生產造成巨大損失。2006 2009年華北和東北稻區也呈現擴大趨勢，據農業部 有關部門估計2008年發病面積可達2800 3000萬畝，2009年發病面積可達與2008年持 平，2010年仍將為偏重發生年份(www. agri. gov. cn)。流行學研究結果表明該病害暴發、流行的主要原因是品種抗性的喪失和有效傳 毒介體種群數量的上升。由於抗病品種在品質上的不足，導致感病品種的大面積種植，加之 灰飛蝨傳毒的瞬時性和持久性、病毒病防治藥劑缺乏，使得防蟲治病十分困難，農藥的使用 也存在許多弊病，因此最為經濟有效的途徑是利用品種自身的抗性達到主動防治病毒病害 目的。然而傳統的育種方法由於缺乏理想的抗源，抗病基因又多與劣質基因相伴隨，獲得抗 病、高產優質的雙重特性品種的難度很大。RNA幹涉(RNA interference，RNAi)是近年來發現的一種重要基因沉默現象，它 是指通過雙鏈RNA的介導的特異性的降解對應序列的mRNA，從而特異性地抑制相應基因 的表達，是植物對外來入侵者的一種重要的防禦機制。本實驗室對RSV田間分離物外殼蛋 白(CP)的研究表明，我國北方粳稻產區所發生的RSV CP基因非常保守，同源性達96. 7 100%，有利於siRNA的識別。本發明以近年在我國北方地區嚴重發生的水稻條紋病毒 (RSV)為對象，利用植物轉基因工程技術將RSV CP基因部分片段導入水稻，通過其特異地 幹擾、降解或沉默RSV病毒基因在水稻植株內的正常複製、積累和傳播，篩選獲得抗RSV的 水稻品系，為進一步結合常規育種工作，改良現有的優質高產但不抗病的水稻品種，以便實 現利用轉基因技術獲得免疫或高抗RSV的水稻新品系的目的。

發明內容
基於上述目的，本發明提供了可用於農桿菌和基因槍遺傳轉化單子葉植物的2種 含有水稻條紋病毒(RSV)基因的RNA幹涉(RNAi)載體，這些載體分別包含致病病毒RSV的 CP基因部分核苷酸序列(RSV-HCP)。本發明還提供這些幹涉病毒基因表達載體的構建方法及應用，為植物抗病育種工 程提供了 一種新的策略和思路。
水稻條紋病毒RNA幹涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的髮夾結構，其特徵 在於以RSV-CP基因部分片段為正、反義鏈，所述RSV-CP基因部分片段序列如SEQ ID N03。所述骨架載體為pMCG161載體。所述正義鏈插入在酶切位點AscI和AvrII間，反義鏈插入在酶切位點SpeI和 SacI之間，命名為PMCG161+/-R，其結構如圖6A所示。所述骨架載體為去掉潮黴素抗性基因的PCMBIA1301載體。所述髮夾結構為幹涉載體pMCG161+/-R經BamHI、HindIII酶切得到的，命名為 PCMBIA1301+/-R，其結構如圖6B所示。pMCG161+/-R幹涉載體的構建方法，步驟如下(1)得到如序列SEQ ID N03所示的RSV-CP基因部分片段；(2)將步驟(1)的基因 部分片斷經AscI、AvrII雙酶切後，與同樣經AscI、AvrII酶切的載體pMCG161連接，得到 插入正向目的片段的重組質粒PMCG161+R ；再將步驟(1)的基因部分片斷經SpeI、SacI雙 酶切，與經SpeI、SaCI酶切的載體pMCG161+R連接，即可得到插入正反義鏈的RNA幹涉載體 PMCG161+/-R。所述步驟(1)採用如下方式以感染水稻條紋病毒RSV水稻總RNA為模板，以SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示序列為引物對，經RT-PCR擴增得到，SEQ ID NOl :5』 -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，SEQ ID N02 :5』 -AGGAGCTC CCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG-3』。PCMBIA1301+/-R幹涉載體的構建方法，步驟如下(1)用限制性內切酶Xho I酶切 PCMBIA1301載體，得到去除潮黴素標記基因的pCMBIA1301載體，即pCMBIA1301_hpt- ； (2) 將pMCG161+/-R用BamHI、HindIII酶切，得到的髮夾結構連入pCMBIA1301_hpf，得到無標 記基因的RNA幹涉載體pCMBIA1301+/-R。所述幹涉載體在轉基因植物中的應用。所述應用為將上述幹涉載體轉化有關受體植物，使之對水稻條紋病毒產生抗性。所述幹涉載體為PMCG161+/-R，所述轉化的方法為基因槍法。所述幹涉載體為PCMBIA1301+/-R，所述轉化的方法為農桿菌介導法。所述農桿菌為根瘤農桿菌菌株EHA105。所述受體植物為禾本科植物。所述禾本科植物為水稻。所述水稻品種為愛知旭(Oryzasativa cv. Aichiasahi)或皖粳97 (Wanjing 97)。本發明採用感染RSV病毒水稻總RNA為模板，根據非常保守的RSV-CP基因設計了 引物SEQ ID NOl和SEQ ID N02，RT-PCR擴增得到RSV-CP基因部分片段即RSV-HCP，將其 作為正義鏈和反義鏈插入骨架載體中得到本發明的幹涉載體。將本發明的幹涉載體轉入受 體植物中，將使RSV病毒發生沉默而不表達，從而使該受體植物產生RSV抗性。RNA幹涉載體pMCG161+/-R，適合於基因槍轉化單子葉植物，可獲得抗RSV的轉基 因後代，該載體攜帶有氯黴素抗性基因和除草劑篩選標記基因。採用的骨架載體是雙向表 達載體PMCG161 JfRSV-HCP的正義鏈插入在酶切位點AscI和AvrII間，將負義鏈插入在酶 切位點SpeI和SacI之間，通過載體上的intro (rice ffaxy-a intron 1)形成髮夾結構，這 樣可用於基因槍轉化單子葉植物。
本發明將用限制性內切酶Xho I酶切pCMBIA1301載體，得到去除潮黴素標記 基因的 PCMBIA1301 載體，即 pCMBIA1301_hpt、然後將 pMCG161+/-R 幹涉載體用 BamHI、 HindIII酶切，得到的髮夾結構連入pCMBIA1301 -hpt_，得到無標記基因的RNA幹涉載體 PCMBIA1301+/-R。由於該幹涉載體不僅適合於超毒力菌株，且不含有抗生素基因，有利於將 來轉基因植物的安全釋放。最終構建的RSV無標記基因RNA幹涉載體pCMBIA1301+/-R不攜帶抗生素或除草 劑抗性基因，適合農桿菌介導的單子葉植物遺傳轉化，可獲得抗RSV的轉基因後代；與攜帶 潮黴素和卡那黴素抗性的抗性基因的PCMBIA1301的空白載體經農桿菌EHA105介導進行單 子葉植物的遺傳轉化對比，這樣即可方便抗性愈傷組織的篩選，又可通過後代分離，方便得 到無標記基因的轉基因再生植株，減少轉基因植物帶來的生物安全性隱患。根瘤農桿菌介導的植物遺傳轉化方法是目前應用最為廣泛的轉化方法之一，已成 功的應用於單、雙子葉植物的轉基因研究中。本發明最終構建的幹涉載體PCMBIA1301+/-R 適合超毒力菌株EHA105等農桿菌介導的植物遺傳轉化。利用根瘤農桿菌EHA105將其導入 水稻，所得到的轉基因植株可以使入侵的致病病毒發生RNA沉默現象，使病毒不能繁殖或 積累，從而使植物具備對病毒的抗病性。本發明利用根癌農桿菌介導的轉化的方法進行水稻的遺傳轉化，藉助水稻細胞 RdRp的轉錄作用，產生RSV部分CP基因，再由DicerIII的作用產生SiRNA，當水稻受RSV侵 染時，就可產生SiRNA，從而達到利用RNA幹擾介導對RSV抗性，最終篩選出免疫或高抗RSV 的轉基因水稻植株。本發明已得到以水稻模式品種愛知旭為受體的水稻TO代再生植株，轉化RSV單價 載體PCMBIA1301+/-R的植株是173株，在RSV重發區河南鄭州經田間抗病性篩選。其中15 株未表現症狀(0級)，41株表現輕微症狀(I級)，78株表現中等症狀(II級)，39株嚴重症 狀(III)。經PCR檢測，未表現症狀的15株中12株擴增到目的基因，表現輕微症狀的41株 中有17株有陽性條帶，同時受體愛知旭發病嚴重，全部為II或III級，發病株率為100%， 這說明轉基因水稻植株較受體有明顯的抗病性。本發明為植物抗病基因工程提供了一種幹擾病毒基因表達載體及其構建方法與 應用，為轉基因技術及RNA幹擾在生物抗性育種中的應用提供了新的思路。將該載體轉入 水稻中，成功獲得了抗病毒植株，實現了利用RNA幹擾原理獲得抗RSV水稻新材料的預期目 標，為RNA幹擾介導的植物抗病育種及基因工程提供了成功的實例，彌補了 RNA幹擾介導的 RSV抗性在本領域研究中的空缺。利用本發明的幹擾載體轉化所得的抗性生物體可以是任何微生物、植物或其組 織、細胞，以及由此所獲得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及該類植物後代的種子、雜 交和轉育後代。本發明轉化單子葉植物的RNA幹涉載體的構建方法，包括如下步驟1)RSV特異性核苷酸序列的獲得以感染水稻條紋病毒(RSV)水稻總RNA為模板，以SEQ ID NO. 1 (上遊引物)和 SEQ ID NO. 2 (下遊引物)為引物對，經RT-PCR擴增RSV-HCP,得到PCR產物I，目的片段約 為250bp。回收PCR產物，與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH 5α (購自北京全式金公 司)得到陽性質粒PMD18-T-HCP，進行序列驗證，如SEQ ID Ν03所示。測序正確的目的片段即可用於RNA幹涉載體的構建。所述SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列如下SpeI AscISEQ ID NOl :5』 -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，SacI AvrIISEQ ID N02 :5』 -AGGAGCTC CCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG-3』2)病毒RNA幹涉載體(中間載體)的構建將上述PCR產物經Asc I.Avr II雙酶切後，與同樣經Asc I.Avr II酶切的載體 PMCG161連接，得到插入正向目的片段的重組質粒-pMCG161+R。同樣將上述PCR產物經Spe I、SacI雙酶切，與經Spe I.Sac I酶切的載體pMCG161+R連接，即可得到插入正、反義鏈的 RNA幹涉載體pMCG161+/-R，經PCR擴增檢測、核苷酸序列分析，目的片段序列正確的幹涉載 體可用於基因槍轉化單子葉植物，獲得單抗RSV的轉基因植株。這些幹涉載體攜帶有氯黴 素抗性基因和除草劑篩選標記基因。由於pMCG161載體帶有氯黴素抗性基因，而農桿菌EHA105抗氯黴素，因此上述 構建的適合基因槍轉化水稻的幹涉載體不能直接用於農桿菌介導的水稻遺傳轉化。而 PCAMBIA1301載體是農桿菌法轉化水稻的常用載體，具有潮黴素抗性和卡那黴素抗性。3)無標記基因載體pCMBIA1301_hpt_的獲得用限制性內切酶Xho I酶切pCMBIA1301載體，經電泳檢測、回收、純化大片段後， 再經T4DNA連接酶16°C連接過夜，即可得到去除潮黴素標記基因的PCMBIA1301載體，即 pCMBIA1301-hpt_。4)無標記載體基因病毒RNA幹涉載體的構建將中間載體pMCG161+/-R 和 pCMBIA1301_hpt_ 用 BamHI、HindIII 酶切，回 收大片段，在T4DNA連接酶作用下(16°C連接過夜)，將中間載體上的髮夾結構連入 pCMBIA1301-hpt",得到無標記基因的RNA幹涉載體pCMBIA1301+/-R。經PCR檢測、序列分 析正確的幹涉載體即可用於農桿菌介導的單子葉植物遺傳轉化，獲得不含有標記基因的單 抗RSV的轉基因再生植株。


圖1. RSV的部分外殼蛋白基因部分片段(HCP)的RT-PCR擴增產物；泳道1. DL2000, 2.健康水稻植株，3-5. RSV分離物圖2.連入病毒正義鏈重組質粒PMCG161+R的PCR鑑定結果圖3.連入正、負義鏈重組質粒PMCG161+/-R的鑑定結果圖4.無標記基因載體pCMBIA1301_hpt_的PCR檢測結果泳道1. DL2000，2.空白對照，3-15. pCMBIA1301_hpt-圖5.重組質粒pCMBIA1301+/-R的PCR鑑定結果泳道l.DL2000，2.空白對照，3.空白質粒pCMBIA1301，4_ll.重組質粒圖6A. pMCG161+/-R幹涉載體圖譜圖 6B. pCMBIA1301+/-R 幹涉載體圖譜圖7. RSV-HCP重組農桿菌的PCR鑑定結果泳道1. DL2000，2.空白對照，3. DH5 α ,4-10.重組質粒
圖8.水稻成熟胚愈傷組織的誘導培養圖9.水稻成熟胚愈傷組織的繼代培養圖10.愈傷組織與農桿菌的共培養圖11.抗性愈傷組織的篩選圖12.抗性愈傷組織的分化圖13分化小苗的壯苗培養圖14. TO轉基因水稻幼苗圖15. TO代轉基因再生植株的PCR鑑定泳道1. DL2000, 2.健康水稻植株，3-12.轉基因TO代植株圖16T0代轉基因愛知旭植株和對照在大田的抗病性表現A.轉基因植株，B.非轉基因植株
具體實施例方式實驗中所用的pMD18-T購自大連寶生物公司(Takara公司)，感受態細胞DH 5 α 購自北京全式金公司。實驗中使用的載體PMCG161保存在中國農業科學院植物保護研究所植物病毒實 驗室(可向公眾免費發放)，是專門適用於禾本科植物轉化的RNA幹擾載體，它含有來源於 水稻的Ricewaxy-a intron 1，位於5442bp_6576bp，在它的上遊含有AscI和AvrII兩個酶 切位點，用來連接目的基因的正向片段，在它的下遊含有SpeI和SacI位點，可用來連接目 的基因的反向片段，最終獲得雙鏈髮夾結構。載體pCMBIA1301是農桿菌介導法轉化水稻的常用載體(該載體保存在中國農業 科學院植物保護研究所病毒組實驗室內，可向公眾免費發放)，具有潮黴素抗性和卡那黴素 抗性。經本實驗室改造的pCMBIA1301_hpt_也可向公眾發放，通過單酶切位點BamHI和 HindIII可以將中間載體pMCG161+/-R上的目的基因的髮夾結構插入其中，獲得無標記基 因，且適合農桿菌介導的單子葉植物遺傳的RNA幹涉載體。實施例1、適合農桿菌介導轉化的水稻條紋病毒RNA幹擾載體的構建步驟1、設計RSV全長CP基因的特異性引物根據已報導的RSV CP基因序列(魏太雲，2003)設計了下述引物RSV CPl :5』 -AGGTTCAGTCTAGTCATCTGCAC-3，RSV CP2 :5』 -AGTAGAATGGGTACCAACAAGCCA-3』以採集自江蘇南京的感染水稻條紋葉枯病水稻標樣(葉片)總RNA為模板，以 RSVCPl ((上遊引物))和RSV CP2 (下遊引物)為引物對，經RT-PCR擴增分別得到約IOOObp 的特異性條帶，回收PCR產物、並與pMD18-T載體連接，得到重組質粒pMD18-T-CP，經PCR、 EcoR I酶切鑑定，以及轉化大腸桿菌DH5 α得到陽性克隆，序列分析結果表明，濟寧RSV 分離物的CP基因全長969bp，與已報導的我國幾個分離物(GeneBank登錄號DQ299167、 DQ299168、AJ781027 和 AJ781028)及日本 T 分離物(GenBank 登錄號為 NC-003776)CP 基因 核苷酸序列一致性約在96. 8% 98. 9%，說明本發明所得到的RSV CP基因序列正確。步驟2、設計RSV CP基因部分片段的RNA幹涉引物
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根據pMCG161載體上存在多克隆位點分析，利用AscI和AvrII可以將目的基因的 正向片段連接到載體；而利用Spe I和Sac I可以將CP基因部分片段的反向片段連接到載 體。因此設計了下述幹涉引物SpeI AscISEQ ID NO 1 :5』 -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，SacI AvrIISEQ ID N02 :5』 AGGAGCTC CCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG-3』步驟3、RSV特異性核苷酸序列的獲得以採集自江蘇南京的感染水稻條紋葉枯病水稻標樣(葉片)總RNA為模板，以 SEQ IDN0. 1 (上遊引物)/SEQ ID NO. 2 (下遊引物)為引物對，經RT-PCR擴增分別得到 約250bp的特異性條帶(見圖1)，回收PCR產物、並與pMDIS-T載體連接，得到重組質粒 PMD18-T-HCP，經轉化大腸桿菌DH 5α得到陽性克隆，序列分析結果表明，南京RSV分離物 的HCP為251bp (序列見附件I)，其為RSV CP基因的部分核苷酸序列。PCR 反應條件:94°C 4min, (94°C Imin，58°C Imin，72°C lmin) 30 個循環，72°C延伸 IOmin0 PCR產物在1. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。步驟4、RSV-HCP正反向片段與載體pMCG161的連接轉化將上述PCR產物和載體pMCG161分別經Asc I、Avr II雙酶切後，65°C處理20min， 使內切酶失活，在T4DNALigaSe作用下連接，將正向目的片段插入載體pMCG161，轉化大腸 桿菌DH 5 α，經PCR鑑定(圖2)、序列分析正確的重組質粒就是含有RSV-HSP的正向片段 的重組質粒，命名為PMCG161+R。同樣將PCR產物I經Spe I、Sac I雙酶切，與經Spe I、Sac I酶切的載體 PMCG161+R在T4DNA Ligase作用下連接，即可得到插入RSV-HCP正反向片段的RNA幹涉載 體PMCG161+/-R，PCR檢測結果見圖3，載體圖譜見圖6Α。該幹涉載體可用於基因槍轉化單 子葉植物，獲得抗RSV的轉基因植株，也可以用做構建無標記RNA幹涉載體的中間載體。該 幹涉載體攜帶有氯黴素抗性基因和除草劑篩選標記基因。步驟5、無標記基因載體pCMBIA1301_hpt_的獲得用限制性內切酶Xho I酶切PCMBIA1301載體，經大片段柱回收、純化後，再 經T4 DNA連接酶16°C連接過夜，即可得到去除潮黴素標記基因的PCMBIA1301載體，即 pCMBIA1301-hpt_。通過PCR檢測潮黴素標記基因的載體擴增的目的片段為189bp，含有掉 潮黴素標記基因的載體擴增的目的片段約為1200bp (圖4)。步驟6、將幹涉載體pMCG161+/-R經BamHI、HindIII酶切後，回收得到約7. 5Kb的 目的片段，在T4DNALigaSe作用下(16°C連接過夜)，將其連入pCMBIA1301-hpt_載體，經 PCR檢測(圖5)、序列分析正確的載體即為無標記基因的RSV-HCP的RNA幹涉載體，命名為 PCMBIA1301+/-R(其圖譜見圖6B)，該載體可用於農桿菌介導的單子葉植物遺傳轉化，分別 獲得不含有標記基因的抗RSV的轉基因再生植株。至此本發明得到了適合單子葉轉化的2種RNA幹涉載體，其中一種適合基因槍的 遺傳轉化的中間載體，另一種為適合農桿菌介導法轉化的最終載體。所構建的2種幹涉載 體中，正向片段和反向片段間有約為IlOObp的水稻內含子片段，有利於維持髮夾結構的形 成。最終構建的1種RNA幹涉載體不含有抗除草劑基因，減少了將來轉基因植物存在生物安全性的隱患。實施例2、病毒RNA幹涉載體電擊轉化根癌農桿菌EHA105由於重組質粒(pCMBIA1301+/-R)向農桿菌EHA105進行熱擊轉化的效率很低，本 發明採取了電擊轉化的方法，獲得了含有目的基因的重組農桿菌。具體步驟如下步驟1、將1 μ g質粒(PCMBIA1301+/-R)與150 μ 1農桿菌ΕΗΑ105感受態混勻，加 入到滅菌後的電擊杯中，於2. 5KV電壓下進行電擊轉化。步驟2、然後加800μ 1液體培養基衝洗電擊杯並轉入EP管，28°C，220rpm搖培2h。步驟3、再取100 200 μ 1培養液塗YM (Kana 50 μ g/ml ；利福平50 μ g/ml)平板， 28°C培養約18小時。步驟4、經挑取單菌落於5ml YM液體培養基(Kana 50 μ g/ml ；利福平50 μ g/ml)， 28°C，220rpm，搖培 16_24h 即可。步驟5、重組農桿菌的PCR鑑定菌落PCR鑑定結果(見圖7)表明，陽性轉化子和載體質粒為模板的陽性對照分別 擴增到約250bp左右的條帶；以未轉化的空的EHA105菌液為模板的陰性對照未得到目的片段。實施例3、RSV-HCP幹擾載體的應用。應用上述含有RSV目的片段髮夾結構的重組農桿菌轉化有關受體植物_愛知旭水 稻品種，使之產生對水稻病毒病的抗性(圖8-14)。本發明已得到以水稻模式品種愛知旭為受體的水稻TO代再生植株，轉化RSV載體 PCMBIA1301+/-R 的植株是 173 棵(圖 16)。實施例4、轉基因植株(TO代)的PCR鑑定本發明以SEQ ID NOl/SEQ ID N02為引物對，對以愛知旭為受體的轉RSV-HCP幹 涉載體的再生水稻植株TO代173株進行PCR檢測，結果表明未表現症狀的15株中有12 株擴增到目的基因，表現輕微症狀的41株中有17株有擴增到約250bp的目的條帶，陽性檢 出率為16.8% (圖15)，說明目的基因整合進了水稻的基因組。實施例5、轉基因植株對水稻條紋病毒的抗性測定本發明將轉基因苗移栽到病毒病的重發區的條件，通過自然發病進行了抗病性篩 選，移栽30-35天的調查結果表明轉化載體pCMBIA1301+/-R的植株173棵中，15株未表現 症狀(0級)，41株表現輕微症狀(I級)，78株表現中等症狀(II級)，39株嚴重症狀(III)。 但受體愛知旭發病嚴重，全部為II或III級，發病株率為100%，這說明轉基因水稻植株較 受體有明顯的抗病性(圖16)。雖然本發明只採用了 PCMBIA1301+/-R轉化了水稻，但本領域的普通技術人員根 據常規知識可以得知，採用基因槍法同樣可以將PMCG161+/-R轉化其它受體植株，得到相 同的效果。
權利要求
水稻條紋病毒RNA幹涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的髮夾結構，其特徵在於以RSV CP基因部分片段為正、反義鏈，所述RSV CP基因部分片段序列如SEQ ID NO3。
2.根據權利要求1所述的水稻條紋病毒RNA幹涉載體，所述骨架載體為PMCG161載體。
3.根據權利要求2所述的水稻條紋病毒RNA幹涉載體，所述正義鏈插入在酶切位點 AscI和AvrII間，反義鏈插入在酶切位點SpeI和SacI之間。
4.根據權利要求1所述的水稻條紋病毒RNA幹涉載體，所述骨架載體為去掉潮黴素抗 性基因的PCMBIA1301載體。
5.根據權利要求4所述的水稻條紋病毒RNA幹涉載體，所述髮夾結構由權利要求3所 述的水稻條紋病毒RNA幹涉載體經BamHI、HindIII酶切得到。
6.根據權利要求3所述的水稻條紋病毒RNA幹涉載體的構建方法，步驟如下(1)得到如序列SEQID N03所示的RSV-CP基因部分片段；(2)將步驟(1)的基因部分片段經AscI、Avr II雙酶切後，與同樣經Asc I、Avr II 酶切的載體PMCG161連接，得到插入正向目的片段的重組質粒pMCG161+R;再將步驟(1)的 基因部分片段經Spe I.Sac I雙酶切，與經Spe I、SacI酶切的載體pMCG161+R連接，即可 得到插入正、反義鏈的RNA幹涉載體pMCG161+/-R。
7.根據權利要求6所述的構建方法，所述步驟(1)採用如下方式以感染水稻條紋病 毒RSV水稻總RNA為模板，以SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示序列為引物對，經RT-PCR擴 增得到，SEQ ID NO 1 :5』 -AGACTAGTGGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，SEQ ID N02 :5』 -AGGAGCTCCCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG-3，。
8.根據權利要求5所述的水稻條紋病毒RNA幹涉載體的構建方法，步驟如下(1)用 限制性內切酶Xho I酶切pCMBIA1301載體，得到去除潮黴素標記基因的pCMBIA1301載 體，即pCMBIA1301-hpt_ ； (2)將權利要求3所述的水稻條紋病毒RNA幹涉載體，用BamH I、 Hind III酶切，得到的髮夾結構連入pCMBIA1301-hpt_，得到無標記基因的RNA幹涉載體 PCMBIA1301+/-R。
9.權利要求1-5任一水稻條紋病毒RNA幹涉載體，所述幹涉載體在轉基因植物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，為將權利要求1-5任一水稻條紋病毒RNA幹涉載體轉 化有關受體植物，使之對水稻條紋病毒產生抗性。
11.根據權利要求10所述的應用，所述幹涉載體為權利要求3所述的水稻條紋病毒 RNA幹涉載體，所述轉化的方法為基因槍法。
12.根據權利要求10所述的應用，所述幹涉載體為權利要求5所述的水稻條紋病毒 RNA幹涉載體，所述轉化的方法為農桿菌介導法。
13.根據權利要求12所述的應用，所述農桿菌為根瘤農桿菌菌株EHA105。
14.根據權利要求10所述的應用，所述受體植物為禾本科植物。
15.根據權利要求14所述的應用所述禾本科植物為水稻。
16.根據權利要求15所述的應用所述水稻品種為愛知旭或皖粳97。
全文摘要
本發明涉及「水稻條紋病毒RNA幹涉載體、構建方法及應用」，屬於生物技術領域。本發明將如SEQ ID NO 3所示的序列作為正、反義鏈建立了水稻條紋病毒RNA幹涉載體pMCG161+/-R和pCMBIA1301+/-R。本發明為植物抗病基因工程提供了一種幹擾病毒基因表達載體及其構建方法與應用，為轉基因技術及RNA幹擾在生物抗性育種中的應用提供了新的思路。將該載體轉入水稻中，成功獲得了抗病毒植株，實現了利用RNA幹擾原理獲得抗RSV水稻新材料的預期目標，為RNA幹擾介導的植物抗性育種及基因工程提供了成功的實例，彌補了RNA幹擾介導的RSV抗性在本領域研究中的空缺。
文檔編號C12N15/66GK101955964SQ20101027606
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月7日 優先權日2010年9月7日
發明者劉豔, 吳蓓蕾, 李紅偉, 李莉, 王錫鋒 申請人:中國農業科學院植物保護研究所