一種siRNA輸送載體及其應用的製作方法
2024-02-26 23:54:15
專利名稱：一種siRNA輸送載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種SiRNA輸送載體及其在製備癌症的基因治療藥物中的應用。
背景技術：
RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是近年來發現的在生物界普遍存在的一種古老的生物學現象，是生物進化的產物。具體是指由雙鏈RNA (double strand RNA, dsRNA)指導的，在特定酶參與下，以外源或內源mRNA為降解目標，在轉錄後水平上使特異性靶基因發生的沉默現象，即不表達。目前研究表明，RNAi廣泛存在於從真菌到高等植物、從無脊椎動物到哺乳動物的大多數真核生物中，原核生物暫未發現。RNAi不僅參與了細胞正常的生長、發育、衰老和凋亡的調控，還可使外源基因導入時或病毒入侵後基因不被表達，從而成為生物體的一種有效的特異性自我防禦機制。RNA幹擾能特異而有效的阻斷靶基因的表達外源性或內源性dsRNA，在細胞內導致與其序列同源的分子發生特異性降解，從而幹擾相應基因的表達。dsRNA引起RNA幹擾的過程為核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的siRNA，大小約21-2;3bp。siRNA具有一些特徵性結構即siRNA的序列與所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA兩條單鏈末端為5'端磷酸和3'端羥基。此外，每條單鏈的3'端均有2-3個突出的非配對的鹼基，這種結構形式對siRNA進入蛋白複合體是必須的。siRNA是RNAi賴以發生的重要中間效應分子。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義鏈再與體內一些酶結合形成RNA誘導的沉默複合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。攜帶反義鏈的的 RISC 與 mRNA 的互補序列特異性結合併切割mRNA。被切割後斷裂的mRNA隨即降解，從而誘發宿主細胞內特定 mRNA的降解反應。RNAi具有普遍、高效、特異、操作簡單等突出優點，目前該技術已被廣泛用於探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。胃癌的發生是一個多步驟多階段的過程，其特徵是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。還有凋亡相關基因的異常表達、部分自分泌生長因子和受體的過量表達也與細胞癌變有密切關係。研究發現，多個分子標誌物與胃癌轉移潛能相關，其中研究較為深入的包括CD44異構體6 (CD44 variant isoform 6，CD44v6)。CD44由一個包含20個外顯子的基因編碼，其中10個外顯子是組成型外顯子，另外10個外顯子可選擇性拼接而被稱為變異外顯子(variant exon, vl-vl0)。僅含有組成型外顯子稱為CD44標準體(CD44 standard form，CD44s)，而含有變異外顯子則為 CD44 異構體(CD44 variant isoform，CD44v)。CD44s 廣泛存在於在正常組織和癌組織中，而CD44v主要出現在機體的病理過程，特別是腫瘤的發生發展過程中。CD44v胞內區域與下遊因子的選擇性相互作用在協調細胞內信號通路起著重要作用，如Mio/Ras、酪氨酸激酶途徑等，並與腫瘤細胞生長、遷移和侵襲作用密切相關。CD44v6是目前研究較為廣泛的異構體，被認為是上皮起源惡性腫瘤，包括肝細胞癌，乳腺癌，結直腸癌和胃癌發生轉移的分子標誌物，尤其是胃癌發生轉移相對特異的分子標誌物，製備抗CD44v6單鏈抗體用於進展期胃癌的生物治療，可以封閉性結合胃癌組織表達的
3CD44v6,阻斷其與細胞外間質或基底膜的正常連接及其所促進的腫瘤細胞浸潤轉移，延緩腫瘤進展；破壞CD44v6蛋白在腫瘤細胞表面形成的糖蛋白偽裝，有利於免疫系統對腫瘤細胞的識別和殺滅，抑制腫瘤的淋巴轉移。採用RNAi技術可特異地抑制相關基因的表達，使這些基因呈現沉默或休眠狀態.從而達到腫瘤治療的目的。與傳統的基因治療的方法相比，RNAi能夠實現同一基因家族的多個基因同時敲除，且抑制效果互不幹擾，因為其特有的優勢成為基因治療的新策略。siRNA給藥載體的研究和開發一直是困擾各國科學家的關鍵問題。人們一直在研究合適的載體材料能有效地將siRNA藥物分子輸送到靶細胞和部位，並在一段合理時間維持其功效。目前所採用的載體體系大多是陽離子脂質體或水溶性的陽離子聚合物，將這些載體分子與siRNA溶液互混得到二者的複合物，從而實現傳遞siRNA的目的，這類方法的不足就是不容易放大規模並且重複性較差。另外，基於高分子的納米顆粒已經廣泛用於從小分子到生物活性DNA分子的傳遞的研究，取得了不菲成績，其中很多成果已經用於臨床或臨床試驗。高分子納米顆粒的傳遞體系生物相容性好，具有靶向傳遞的潛能，具有更好的穩定性，能有效保護生物活性分子對生理環境的耐受性，並增強細胞對被傳遞分子的吸收。特別值得指出的是高分子自組裝的納米粒具有EI3R效應(Enhanced permeability and retention)，可促進藥物在腫瘤組織的富集，並能有效地被腫瘤部位細胞吸收，進入細胞質和各種細胞器，因此高分子納米粒是極具潛能的siRNA傳遞系統的候選者。而具有良好生物相容性的可降解高分子載體，特別是具有快速去質子化能力的可降解陽離子型高分子載體能有效結合和保護siRNA分子，又能使siRNA在細胞質中迅速釋放，實現阻斷基因表達的目的，這將使這類載體在siRNA給藥中具有更好的優勢和應用前景。
發明內容
有鑑於此，本發明的所解決的技術問題在於提供一種siRNA輸送載體，具有粒徑小、表面電位合適的理化性質，擁有良好siRNA複合能力、低細胞毒性和高轉染率，是一個安全、高效、具有siRNA輸送功能的納米載體。一方面，本發明提供了一種siRNA輸送載體，其活性成分為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯形成的納米顆粒。優選地，所述聚乙二醇-聚乙烯亞胺為單甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亞胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通過配體交換包裹超順磁性氧化鐵納米粒子。其中，超順磁性氧化鐵納米粒子控制在40_60kD之間，優選控制在50_60kD之間， 最優為55KD ；聚乙二醇-聚乙烯亞胺控制在40-60kD之間，優選控制在40_50kD之間，更優控制在42-48kD之間，最優為45KD。例如在本發明的實施例1中，即是選擇2kD的單甲基醚聚乙二醇與25kD枝化聚乙烯亞胺以10 1的摩爾比合成聚乙二醇-聚乙烯亞胺；而後再與55kD的超順磁性氧化鐵納米粒子以偶聯形成的本發明的siRNA輸送載體，通過對膠粒理化性質的測試，超順磁性氧化鐵納米粒子佔膠粒質量的55%。而且結合本發明實施例中的實驗結果表明，採用上述分子量範圍內或者本發明實施例中所用的成分，能夠使本發明的 siRNA載體與待輸送的siRNA有效結合，提高siRNA的輸送效率，對RNA幹擾效果有積極的影響。優選地，所述納米顆粒的平均粒徑為60_80nm，表面zeta電位為30_40mV。本發明實施例中納米顆粒的平均粒徑優選為67. 3士2. Onm，表面zeta電位優選為34. 38士 1. 66mV。從分子結構上分析，本發明提供的siRNA輸送載體含有由超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯形成的納米顆粒。其中，聚乙烯亞胺(polyethyleneimine， PEI)是一種廣泛採用的高分子納米載體，是一種水溶性的高分子聚合物，具有一級、二級和三級胺，胺基基團所帶的陽性電荷和核酸的磷酸基團帶的陰性電荷中和，產生強大的核酸親和力，形成穩定的PEI/核酸複合物。此外，PEI突出的優勢在於結構靈活，易調整其分子量，可以通過引入側鏈和特異靶向性基團來修飾多聚物骨架，進而調整和改善載體的性能，其體積比脂質體小，易於通過血管內皮間隙。然而，PEI和PEI/核酸複合物有較大的細胞毒性，而本發明的siRNA輸送載體中，通過聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾，構成PEG-g-PEI能夠降低細胞毒性且保證PEI的基因轉染效率。需要說明的是，本發明siRNA輸送載體用到的PEG是一種常用藥用輔料，具有良好的水溶性，其分子量當控制在200-35，OOODa之間。而超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPI ON)是一禾中高效的磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)造影劑，本發明的siRNA輸送載體通過將SPION與PEG-g-PEI偶聯形成 PEG-g-PEI-SPI0N (PPS)，同時具備基因輸送和MRI成像功能，通過MRI這一非侵入性成像技術能夠及早地發現腫瘤並更準確地觀察、分析治療效果。本發明的siRNA輸送載體具有良好的生物相容性和可降解性，其在水溶液中自組裝形成納米顆粒，具有合適的理化性質，良好的穩定性，製備方法簡單，可重複性高，同時擁有良好的siRNA複合能力，低細胞毒性和高轉染率，作為載體能保護siRNA免於降解，又能結合納米顆粒本身的尺度效應，是一種安全、高效、優良的siRNA輸送載體。另一方面，本發明還提供了一種真核細胞轉染液，所述轉染液包括siRNA和上述方案中揭示的siRNA輸送載體，所述siRNA被吸附於siRNA輸送載體形成複合物。其中，其中，複合物的N/P比值計算公式為
PPS (Mg) X45%
N/P 比值=4.2 X -^TT----
siRNA (μ )優選地，所述複合物的Ν/Ρ比值控制在5-20之間。在合適的Ν/Ρ比值情況下，納米顆粒能夠與siRNA完全結合形成穩定的負載siRNA分子的納米顆粒。另外，siRNA輸送載體與siRNA形成複合物後，整個複合物的平均粒徑表面zeta電位會隨N/P比值變化而發生變化。本發明中複合物的平均粒徑控制在SO-IOOnm之間。而表面zeta電位隨N/P比值的變化差異範圍很大，而且在N/P比值較小時，表面zeta電位隨 N/P比值的變化非常明顯。另一方面，本發明還提供了一種向細胞輸送siRNA的方法，該方法包括將siRNA與如權利要求1-4中任意一項所述的siRNA輸送載體製備成複合物，而後根據複合物粒徑、表面電位、siRNA複合能力、細胞毒性和轉染率確定合適的N/P比值，再用具有合適的N/P比值的複合物向細胞中轉染siRNA。優選地，SiRNA為siCD44v6，所述siCD44v6具有如下序列sense strand 5' -GAACAGUG⑶UUGGCAACA dTdT-3『 ，antisense strand 3' -dTdT CUU⑶CACCAAACC⑶UGU-5『 ，
所述輸送載體與si⑶44v6形成複合物，將複合物的N/P比值控制在5_15之間，向胃癌細胞轉染si⑶44v6。其中，所述胃癌細胞優選為SGC-7901細胞。在本發明的具體實施例中採用PEG-g-PEI-SPION(PPS)輸送針對CD44v6基因的 siCD44v6，並和Lipofectamine比較沉默CD44v6在SGC-7901細胞的表達，證明了納米顆粒能夠將siRNA運輸到細胞內並發揮沉默基因表達的作用。本發明利用針對Luciferase 蛋白的siRNA進一步定量分析檢驗了納米穎粒輸送siRNA的能力，PEG-g-PEI-SPION(PPS) 納米顆粒轉染siRNA與Lipofectamine轉染siRNA後，比較⑶44v6基因的沉默效率，採用 PEG-g-PEI-SPION(PPS)納米顆粒轉染siRNA使CD44v6基因具有更高的沉默效率，而且該結果得到T^festern blot試驗進一步驗證。將上述向細胞輸送siRNA的方法運用到癌症的治療中，能夠降低癌細胞遷移和侵襲能力。在本發明的實施例中，用PEG-g-PEI-SPION (PPS)輸送針對CD44v6基因的 si⑶44v6，通過遷移和侵襲試驗觀察沉默⑶44v6對SGC-7901細胞遷移和侵襲能力的影響， 實驗結構表明CD44v6與對SGC-7901細胞遷移和侵襲能力密切相關，而且PPS/siCD44v6複合物能夠有效地抑制SGC-7901細胞的遷移和侵襲能力。另外，本發明還公開所述的siRNA輸送載體和真核細胞轉染液在製備癌症基因治療藥物中的應用，尤其是在製備胃癌基因治療藥物中的應用。本發明通過細胞毒性實驗證明本發明的siRNA輸送載體具有良好的生物相容性，同時具有很好的穩定性和方便製備等特點，在siRNA輸送和基於RNA幹擾的疾病治療中具有良好的應用前景。
圖1是PEG-g-PEI-SPION/siRNA複合物凝膠阻滯電泳圖。其中1 裸siRNA ；2-6 N/P 比值=1，2，3，4，5 和 10。圖2是PEG-g-PEI-SPION/siRNA細胞毒性試驗結果圖。採用MTT法測定N/P = 1. 25，5，10和20PEG-g-PEI-SPI0N/siRNA複合物對SGC-7901細胞的毒性作用，繪製成細胞
存活率曲線。圖 3 是圖 10PEG-g-PEI-SPI0N 轉染率實驗結果圖。PEG-g-PE I-SPI ON/ s i NC-Cy 3 按 N/P = 3，5和10轉染SGC-7901細胞，並以lipofectamine/siNC_Cy3為對照組，流式細胞儀檢測轉染率。圖 4 是 PEG-g-PEI-SPION/siRNA 複合物細胞內分布圖。PEG-g-PEI-SPION/ siNC-Cy3複合物轉染SGC-7901細胞後，螢光顯微鏡下拍照，可見紅色螢光出現在細胞內。 普魯士藍染色後可見細胞胞漿出現藍色顆粒。圖5A是CD44v6沉默效應實驗結果圖一。siCD44v6分別通過PEG-g-PEI-SPION和 Iipofectamine轉染至SGC-7901細胞，通過qRT-PCR反應其基因沉默效應的實驗結果圖。圖5B是CD44v6沉默效應實驗結果圖二。siCD44v6分別通過PEG-g-PEI-SPION和 Iipofectamine轉染至SGC-7901細胞。通過^festern blot反應其基因沉默效應的實驗結果圖。圖6A是遷移實驗結果示意圖一。圖6B是遷移實驗結果示意圖二。圖6C是侵襲實驗結果示意圖一。
圖6D是侵襲實驗結果示意圖二。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下面實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實施手冊中所述的條件。本發明的以下實施方式中，通過研究SiRNA輸送載體 PEG-g-PEI-SPION(polyethylene glycol-grafted polyethylenimine and superparamagnetic iron oxide nanoparticles, PEG-g-PEI-SPION,簡禾爾 PPS)作為 siRNA 輸送載體的理化性質，確定合適N/P比值。並以PPS向胃癌細胞輸送靶向⑶44v6基因的 siRNA(sira44v6)為例，通過檢測si⑶44v6所介導的基因沉默和生物學效應，確定本發明的siRNA輸送載體PPS的作用和效果，以及其在製備基因治療藥物尤其是癌症治療藥物中的應用。下列實施例中，採用的生物材料及其來源為1、細胞株人胃腺癌細胞株SGC-7901購買自上海生物化學與細胞研究所。人胃正常上皮細胞株GES-I購買於北京腫瘤研究所。人惡性黑色素瘤細胞株A375由上海腫瘤研究所惠贈。2、主要試劑高糖DMEM培養基胎牛血清青、鏈黴素胰蛋白酶 PBS緩衝液 PEG-g-PEI-SPION
Lipofectamine 2000 siCD44v6、siNC、siNC-Cy3
亞鐵氰化鉀
CD44v6、β-actin 引物
6 χ DNA上樣緩衝液
膠體金溶液
MTT
DMSO
TRIZOL
GIBCO公司 GIBCO公司 GIBCO公司 GIBCO公司 GIBCO公司
中山大學化學與工程學院合成
Invitrogen 公司
廣州銳博公司設計合成廣州化學製藥廠寶生物工程(大連)有限公司合成
廣州威佳公司中山二院中心實驗室 Sigma公司廣州威佳公司 Invitrogen 公司焦碳酸ニ乙酯(DEPC )廣州威佳公司；
異丙醇廣州化學製藥廠
氯仿廣州化學製藥廠
PrimeScript RT試劑盒寶生物工程(大連)有限公司
SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司
RIPA裂解液上海碧雲天公司
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BCA-IOO蛋白定量試劑盒上海申能博彩公司
予員染t田 markerFermentas 公ロJ
ECL化學發光液晶美生物工程公司
小鼠抗人CD44v6單克隆抗體Bender公司
小鼠抗人(3 -actin單克隆抗體Sigma公司
HRP標記山羊抗小鼠抗體Jackson公司
Cultrex Basement Membrane Extract R&D 公司
(BME)
結晶紫上海國藥集團化學試劑公司3、序列(l)siCD44v6 序列sense strand 5' -GAACAGUG⑶UUGGCAACA dTdT-3『 ，antisense strand 3' -dTdT CUU⑶CACCAAACC⑶UGU-5『 ，(2)CD44v6 引物序列forward primer 5' -GCA CAA TCC AGG CAA CTC C_3' ，reverse primer 5' -GCT GTC CCT GTT GTC GAA TG-3' ,(3) β-actin 引物序列forward primer 5' -TGG CAC CCA GCA CAA TGAA-3' ,reverse primer 5' -CTAAGTCAT AGTCCGCCT AGAAGC A~3' 實施例1、PPS納米顆粒的製備1、聚乙二醇接枝聚乙烯亞胺(mPEG-g-PEI)的合成。稱取4. Og單甲基醚聚乙二醇(mPEG-0H，2kD)於乾燥兩口瓶中60°C真空乾燥8h， 冷卻後Ar保護下加入30mL已乾燥的四氫呋喃(THF)，充分溶解。稱取N，N，-羧基二咪唑 (⑶I) 3. 2g置於另一乾燥兩口瓶中，Ar保護下將溶有mPEG-OH的THF溶液緩慢滴加到兩口瓶中，室溫下繼續攪拌反應12h。加入200 μ L水使過量的⑶I失活，反應進行0.證，用大量無水乙醚沉澱2次，過濾後乾燥得白色粉末狀固體。再稱取支化聚乙烯亞胺(hy-PEI，25kD) 1. Ig和上述白色粉末0. 8g共溶於20mL CHCl3,室溫下繼續攪拌反應Mh。而後通過再生纖維透析除去CHCl3,部分溶質在常壓下揮發，將濃縮後的溶液用大量無水乙醚沉澱3次，收集沉澱物乾燥得白色粉末狀固體，產率為80%。對產物進行核磁共振分析(H-NMR)，其結果為A-NMR in CDCl3 :2. 5-2. 9ppm(m, -CH2CH2NH-)，3. 4ppm(s, CH3-OCH2CH2-)，3. 65ppm(s, -OCH2CH2-)， 4. 2ppm(t, -OCH2CH2-O(C = 0)) 0與理論值相符，從而表明Pi7G成功接枝於PEI分子鏈中。2、PPS 的製備。將300mg mPEG-g-PEI溶解於3ml氯仿中，而後使15mg超順磁性氧化鐵納米粒子 (SPION, 55kD)均勻分散於該溶液中，室溫下繼續攪拌過夜。而後加入大量正己烷沉澱，離心收集沉澱物，用正己烷洗滌2次，而後進行真空乾燥除去有機溶劑。將上述得到的產物通過超聲波均勻溶解於雙蒸水，並通過200nm超濾膜除去大的凝聚顆粒。需要說明的是，實施例1僅僅是本發明中製備PPS的一種實現方式，其中採用的單甲基醚聚乙二醇(mPEG-OH，2kD)和二支化聚乙烯業胺(hy-PEI，25kD)均購自Sigma公司， 而超順磁性氧化鐵納米粒子(SPI0N，55kD)由中山大學化學與工程學院合成提供，PPS也是根據實施例1中方案委託中山大學化學與工程學院合成，通過對膠粒理化性質的測試，超順磁性氧化鐵納米粒子佔膠粒質量的55 %。當然，在本發明的其他實施例中，對於PPS的製備也會根據需要，對其用料和方法上做出調整，以實現解決本發明的技術問題為準。為此， 本發明的技術方案中，超順磁性氧化鐵納米粒子控制在40-60kD之間，優選控制在50-60kD 之間，最優為^KD ；聚乙二醇-聚乙烯亞胺控制在40-60kD之間，優選控制在40-50kD之間， 更優控制在42-48kD之間，最優為45KD。而PPS納米顆粒的平均粒徑則應控制在60_80nm 之間，表面zeta電位為30-40mV。採用上述分子量範圍內或者本發明實施例中所用的成分， 能夠使本發明的siRNA載體與待輸送的siRNA有效結合，提高siRNA的輸送效率，對RNA幹擾效果有積極的影響。實施例2、PPS/siRNA複合物的製備及其理化性質的測定1、PPS溶於滅菌去離子水，按照不同的N/P比值，將一定量的siRNA溶液與PPS溶液在去離子水或PBS中輕輕混勻，室溫下靜置孵育10-15分鐘，即得到不同N/P值的PPS/ siRNA複合物。其中，PPS/siRNA N/P比值計算公式
PPS (Mg) X45% siRNA (μ )2、粒徑和電位的測定按Ν/Ρ比值5，10，15,20形成PPS/siRNA複合物，各複合物所含siRNA量設定為 10 μ g，用去離子水稀釋至500 μ 1，用kta-Plus粒度分析儀測定複合物的粒徑和電位。每個樣本測定5次，所得數值表示為均數士標準差。測定結果表明，PPS的平均粒徑是67. 3 士 2. Onm，表面zeta電位為34. 38 士 1. 66mV。 當其與siRNA複合形成PPS/siRNA複合物後，粒徑和電位隨N/P比值的增加而變化，詳見表 1。N/P = 5和10時，複合物粒徑分別為98. 5 士 2. 2nm和93. 8 士0. 6nm，隨著N/P比值增加粒徑縮小，當N/P = 20時複合物粒徑為88. 4士 2. 6nm。此外，複合物的zeta電位隨著N/P 比值增加而增大，N/P = 5和10時，zeta電位分別為4. 18士0. 18mV和15. 10士0. 64mV，而 N/P = 20 時，zeta 電位增加至 18. 22士 1. 20mV。
表1不同N/P比值下PPS/siRNA複合物的粒徑和電位
權利要求
1.一種SiRNA輸送載體，其中，所述輸送載體的活性成分為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯形成的納米顆粒。
2.根據權利要求1所述的siRNA輸送載體，其中，所述聚乙二醇-聚乙烯亞胺為單甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亞胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通過配體交換包裹超順磁性氧化鐵納米粒子。
3.根據權利要求1所述的siRNA輸送載體，其中，所述超順磁性氧化鐵納米粒子的分子量控制在40-60kD之間，聚乙二醇-聚乙烯亞胺的分子量控制在40-60kD之間。
4.根據權利要求1所述的siRNA輸送載體，其中，所述納米顆粒的平均粒徑為 60-80nm，表面 zeta 電位為 30_40mV。
5.一種真核細胞轉染液，其中，所述轉染液包括siRNA和如權利要求1-4中任意一項所述的siRNA輸送載體，所述siRNA被吸附於siRNA輸送載體形成複合物。
6.根據權利要求1所述的真核細胞轉染液，其中，所述複合物的N/P比值控制在5-20 之間。
7.一種向細胞輸送siRNA的方法，其中，包括將siRNA與如權利要求1_4中任意一項所述的siRNA輸送載體製備成複合物，而後根據複合物粒徑、表面電位、siRNA複合能力、 細胞毒性和轉染率確定合適的N/P比值，再用具有合適的N/P比值的複合物向細胞中轉染 SiRNA0
8.根據權利要求4所述的向細胞輸送siRNA的方法，其中，siRNA為si⑶44v6，所述 siCD44v6具有如下序列sense strand 5' -GAACAGUG⑶UUGGCAACA dTdT-3『 ，antisense strand 3' -dTdT CUU⑶CACCAAACC⑶UGU-5『 ，所述輸送載體與si⑶44v6形成複合物，將複合物的N/P比值控制在5-15之間，向胃癌細胞轉染siCD44v6。
9.如權利要求1-4中任意一項所述的siRNA輸送載體在製備癌症基因治療藥物中的應用。
10.如權利要求5或6中所述的真核細胞轉染液在在製備癌症基因治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種siRNA輸送載體，所述輸送載體的活性成分為超順磁性氧化鐵納米粒子與聚乙二醇-聚乙烯亞胺偶聯形成的納米顆粒。另外，本發明還公開了一種真核細胞轉染液，包含由siRNA和所述siRNA輸送載體組成的複合物。本發明的siRNA輸送載體具有粒徑小、表面電位合適的理化性質，擁有良好siRNA複合能力、低細胞毒性和高轉染率，是一個安全、高效、具有siRNA輸送功能的納米載體，在siRNA輸送和基於RNA幹擾的疾病治療中具有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102329810SQ201110240290
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月19日 優先權日2011年8月19日
發明者陳茵婷, 黃開紅 申請人:陳茵婷, 黃開紅