一種增加龜裂鏈黴菌的土黴素產量的方法
2024-01-21 21:56:15
專利名稱：一種增加龜裂鏈黴菌的土黴素產量的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種增加龜裂鏈黴菌的土黴素產量的方法。
背景技術：
微生物可對其產生抗性的抗生素現在已涵蓋了我們所已知的絕大多數種類自然的或者合成的化合物。抗生素產生菌都含有能抵禦自身產生的抗生素的抗性元件，這些元件大多位於抗生素生物合成基因簇，屬於調控元件。環境中抗生素的存在使微生物在不生產最初抗生素的情況下也能從相近種屬中獲得或自主進化得到高特異性的抗性元件。因此，對於抗性基因的研究一直是人們的興趣所在，尤其是抗生素產生菌的自我抗性機制。
要想對抗生素的自我抗性機制有詳細深入的了解，先要清楚不同的抗生素在細胞內的作用位點。抗生素的作用機理大致有以下幾種1)，對細胞壁的形成有抑制作用，如青黴素，頭孢菌素，磷黴素等；2)，影響細胞膜的功能，如多肽類抗生素；3)，抑制蛋白質合成，如紅黴素，鏈黴素等；4)，幹擾核酸代謝，如絲裂黴素，灰黃黴素等。對於作用於不同位置的抗生素，細胞採取了不同的抵禦方式。如前所述，抗生素產生菌自我保護機制可以細化到許多種類，大多數生產菌不是單ー採用ー種機制，而是幾種機制共同起作用。龜裂鏈黴菌就是採用抗生素作用靶點的修飾和藥物溢流兩種方式來保護自身，免受土黴素(OTC)侵害，後者同時也是降低終產物抑制的有效手段。然而，為了提高土黴素的產量，本領域還有必要進ー步研究保護龜裂鏈黴菌自身，提高土黴素產量的方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種增加龜裂鏈黴菌的土黴素產量的方法。在本發明的第一方面，提供一種增加龜裂鏈黴菌的土黴素產量的方法，所述方法包括在龜裂鏈黴菌中增加土黴素抗性基因otrA或otrB的表達。在另ー優選例中，在龜裂鏈黴菌中増加土黴素抗性基因otrB的表達。在另ー優選例中，在龜裂鏈黴菌中增加ー個拷貝的土黴素抗性基因otrA或otrB。在另ー優選例中，所述方法包括(I)提供表達載體，所述表達載體中包含土黴素抗性基因otrA或otrB的序列；(2)將表達載體轉化龜裂鏈黴菌，選擇基因組中整合有外源的土黴素抗性基因otrA或otrB序列的重組龜裂鏈黴菌。在另ー優選例中，所述的表達載體中，土黴素抗性基因otrA或otrB的序列的5』端，包括強啟動子ermE。在另ー優選例中，所述的表達載體是pSET152載體。在另ー優選例中，步驟(2)中，將表達載體轉化去甲基化菌株；從轉化的菌株中提取去甲基化的表達載體轉化龜裂鏈黴菌。在本發明的另一方面，提供一種重組的龜裂鏈黴菌，其基因組中整合有外源的土黴素抗性基因otrA或otrB的序列。在另ー優選例中，所述的重組龜裂鏈黴菌是通過前面所述的方法製備獲得。在本發明的另一方面，提供一種生產土黴素的方法，所述方法包括培養所述的重組的龜裂鏈黴菌，從而生產土黴素。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖I、重組質粒 pSET152_otrB。圖2、pSET152-otrB 酶切鑑定圖譜。Lane I :分子量標記 DL15000 ；Lane 2 =NdeI消化的 pSET152-otrB ；Lane 3 XbaI&NdeI 消化的 pSET152_otrB。圖3、電擊的轉化子篩選平板。圖 4、ET12567/pSET152-otrA、ET12567/pSET152-otrB 轉化子 PCR 鑑定。Lanel-7 otrA基因轉入的重組菌株；Lane 8-9 :陽性對照(PCR模板為空載pSET152質粒，帶有apr)；Lane 10-16 :otrB基因轉入的重組菌株。Lane 17 :分子量標記Marker III。圖5、重組菌株整合方式PCR鑑定圖。A為整合otrA之後的重組菌株染色體示意圖。B和C分別表示陽性重組菌株的PCR結果。圖6、平板實驗篩選重組菌株。A為otrA基因增強重組菌株(SRI-A) ；B為otrB基因增強重組菌株(SRI-B)。圖7、20株otrA和otrB增強重組菌株發酵結果。
具體實施例方式本發明人經過深入的研究，找到了一種通過在龜裂鏈黴菌中増加土黴素抗性基因otrA或otrB的表達，保護龜裂鏈黴菌自身，提高土黴素產量的方法。所述方法可提供土黴
素產量50%以上。所述的「龜裂鏈黴菌(Streptomyces rimosus) 」是ー種產土黴素的鏈黴菌,其可以從土壌中分離獲得。其形態為孢子絲螺旋形2 3圈，緊密，偶有松敞螺旋。孢子柱形，
0.8X1.6 1X1.7 微米。所述的「土黴素」化學名稱為6-甲基-4-ニ甲氨基)-3，5，6，10，12，12a-六羥基-1,11- ニ氧代-1,4,4a,5, 5a,6,11,12a -八氫 ~2~ 並四苯甲酸胺。分子式C22H24N2O9。其為四環素類抗生素，是廣譜抑菌劑。所述的「啟動子」是指ー種核酸序列，其通常存在於目的基因編碼序列的上遊(5，端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。如本文所用，「外源的」或「異源的」是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關係。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對於該目的基因來說是外源的。特定序列對於其所插入的細胞或生物體來說是「外源的」。
如本文所用，「 otrA基因」或「otrB基因」是指ー類編碼膜蛋白的基因、或在嚴格條件下與所述基因序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表達對龜裂鏈黴菌的土黴素產量具有顯著的促進作用。該定義中還包含在嚴格條件下與「otrA基因」或「otrB基因」雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子。如本文所用，術語「嚴格條件」是指⑴在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2 XSSC,0. 1% SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲醯胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優選是95%以上時才發生雜交。NCBI已公開了 「otrA基因」或「otrB基因」的序列，例如「otrA基因」的序列參見GenBank登錄號X53401. I所示；「otrB基因」的序列參見GenBank登錄號AF061335. I所示。本發明的「otrA基因」或「otrB基因」的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。為了增加龜裂鏈黴菌的土黴素產量，本發明人作了廣泛地研究，找到了適合於進行改良的基因，並構建了相應的構建物。因此，本發明提供了ー種構建物，所述構建物包括「otrA基因」或「otrB基因」的表達盒。所述的表達盒具備基因表達所需的所有元件(包括啟動子、編碼DNA以及終止子等)，從而可完整地表達出相應的蛋白。通常，所述的構建物位於表達載體上。因此，本發明還包括ー種載體，它含有所述的構建物。所述的表達載體通常還含有複製起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建本發明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的ニ氫葉酸還原酶、新黴素抗性。優選的，本發明的表達載體上的選擇性標記是安普黴素(apr)抗性基因。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。包含上述的適當多核苷酸序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主。在本發明的方法中，所述的宿主是龜裂鏈黴菌。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行，例如磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。作為ー種優選的方式，可用電轉化的方法進行。在本發明的實施例中，土黴素00TC兩個抗性基因otrA和otrB分別被克隆到鏈黴菌特異性整合質粒PSET152上，酶切鑑定後電擊轉化SRI感受態細胞，使其發生特異性整、合。後以重組菌株基因組為模板，設計兩組引物驗證重組質粒整合方式。最後得到了龜裂鏈黴菌基因組上otrA或otrB基因增強的重組菌株。本發明的主要優點在幹本發明找到並驗證了導致抗生素生物合成終止的原因，解決了土黴素產物對於龜裂鏈黴菌的反饋抑制，提高了抗生素產生菌自身抗性，從地提高抗生素產量。下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例I、pSET152-otrA/pSET152-otrB 構建與去甲基化根據龜裂鏈黴菌Streptomyces rimosus M4018(購自 Pfize 公司)中 otrA、otrB基因序列設計引物，並在正向引物序列引入NdeI酶切位點，在反向引物序列引入XbaI酶切位點，具體引物為otrA 正向5' CGCCATATGATGAACAAGCTGAATCTGGG 3' (SEQ ID NO 2)；otrA 反向5' GGAAGCTTTCTAGATCACACGCGCTTGAGC 3' (SEQ ID NO : 3)。otrB 正向5' CGCCATATGGTGTCATCCGCAAATCCG 3' (SEQ ID NO 4)；otrB 反向5' CCAAGCTTGCTCTAGATCAGGCGTCCGACGC 3' (SEQ IDNO : 5)。以I U L Streptomyces rimosusM4018 菌總 DNA 為模板進行 DNA 擴增反應。PCR 反應的總體系為25iiL，反應條件為95°C預變性7min後開始循環，即94°C lmin，58°C 30s，72°C 2min，進行30個循環，最後進行延伸，即72°C延伸7min。otrA、otrB基因PCR產物分別用凝膠回收試劑盒回收，再將回收的PCR產物分別連接到PMD19T載體(Promega)上。16°C連接6h後轉化大腸桿菌(E. coli) ToplO感受態細胞，將細胞塗布在含 100 u g/mL Amp, 24 u g/mL IPTG，及 40 y g/mLX-gal 的 LB 平板上 37°C過夜培養。挑選陽性克隆進行DNA測序分析。將菌落於試管中擴培，以鹼裂解法提取質粒，用NdeI和XbaI雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收帶NdeI和XbaI酶切位點的otrA、otrB基因。用NdeI和XbaI雙酶切載體pSET152 (鏈黴菌整合質粒，獲自UniversityofStrathclyde, Glasgow, UK),然後分別與獲得的帶NdeI和XbaI酶切位點的otrA或otrB基因進行連接反應。16°C過夜連接後，把連接產物分別轉化到大腸桿菌(E. Coli)ToplO感受態細胞中，並塗布在含50 ii g/mL apr (Apramycin)的LB平板上過夜培養。挑取陽性克隆，擴培後提取質粒進行酶切鑑定。鑑定正確後，將重組質粒轉化去甲基化大腸桿菌ET12567 (獲自 University of Strathclyde, Glasgow, UK),並塗布在含 50 U g/mL apr 的LB平板上過夜培養。經鑑定正確後保存於_20°C。獲得的重組質粒pSET152-otrB的示意圖如圖I ;pSET152_otrA的圖譜類似於圖1，其中的otrB基因被otrA基因取代。由於在otr基因上遊引入了 NdeI酶切位點，下遊引入了 XbaI酶切位點，因此將平板上長出的菌落進行擴培後，提取質粒用NdeI和XbaI進行雙酶切鑑定，pSET152-otrB酶切分析圖譜見圖2。實施例2、龜裂鏈黴菌エ業菌電轉化將鑑定正確的大腸桿菌ET12567/pSET152-otrA 或 ET12567/pSET152_otrB 擴培，提取去甲基化的質粒，電轉龜裂鏈黴菌エ業菌(購自山西大同同星抗生素有限公司)(SRI)感受態細胞，培 養於含500 u g/mL apr的TSA培養基(按照重量含TSB 3% ；AgarI. 5% )上，培養3-7天。挑取轉化子，提取基因組DNA，以其為模板進行PCR鑑定，經鑑定正確後保存於-20°C。電轉之後，30°C培養5-7天。轉化有ET12567/pSET152-otrB的菌落生長狀況如圖3。由於龜裂鏈黴菌エ業菌基因組中沒有Apramycin抗性基因，而陽性轉化子則因重組質粒特異性整合到染色體上而獲得了此抗性基因。因此，在NCBI上查找到Apramycin抗性基因序列，設計引物(引物序列 F :5，-TGCAATACGAATGGCGAAAAG-3』 (SEQ ID NO 6)和 R 5』 -TCGGCCCAGITGACCCAGGG-3』 (SEQID NO :7))，以重組菌的總 DNA 為模板進行 PCR 擴增。PCR產物電泳圖如圖4。Apramycin抗性基因大小為750bp。實施例3、重組菌整合方式鑑定圖5A所示為整合之後的重組菌株染色體示意圖。如果重組質粒與基因組進行了正確的位點特異性重組，按照此圖，設計attB-F&apr-R和otrA-F&attB-R兩對鑑定引物對其整合方式進行分子鑑定，理論片段大小分別為2077bp和4600bp。圖5B和C分別表示陽性重組菌株的PCR結果。引物序列為attB-F:5』 GTTCACCAACAGCTGGAGGC 3』 (SEQ ID NO :8)；apr-R:5』 -TCGGCCCAGTTGACCCAGGG-3』 (SEQ ID NO :9)。otrA-F :5' CGCCATATGATGAACAAGCTGAATCTGGG 3' (SEQ ID NO :10);attB-R:5，CGTCATGCCCGCAGTGACC 3，(SEQ ID NO :11)。如圖5所示，表示重組菌株確實是按照本發明人預期的方式發生位點特異性重組的。pSET152是鏈黴菌整合質粒，質粒上帶有紅黴素抗性基因啟動子ermE，其序列如下(SEQ ID NO 1)gaattcggtaccagcccgacccgagcacgcgccggcacgcctggtcgatgtcggaccggagttcgaggtacgcggcttgcaggtccaggaaggggacgtccatgcgagtgtccgttcgagtggcggcttgcgcccgatgctagtcgcggttgateggcgatcgcaggtgcacgcggtcgatcttgacggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatgctgttgtgggcacaatcgtgccggttggtaggatctgcagccaagctctggaccgcccccgactcctgaccgccggccatccgtgaccaccgctcagcacgaaggagaacagaccgtggcagccgccgccaagatcgccatgtccagtgtggcgcccagtcaccggcaggggggcagcacccgcgccct
gctgacgccgtcgtcggtgggtgcgacctccggagagctcggtacccggggatcctctaga啟動子ermE是能在鏈黴菌中組成型表達且比較強的啟動子。pSET不含鏈黴菌複製起始位點，屬於鏈黴菌自殺型載體，若不能整合到染色體上，將因不能在鏈黴菌中複製而丟失。PSET152與基因組的位點特異性重組是依靠來自鏈黴菌噬菌體的のC31整合酶發揮作用的。鏈黴菌溫敏型噬菌體のC31的整合酶基因是絲氨酸重組酶家族中的ー員，這種酶能準確地識別細菌附著位點(attB)和噬菌體附著位點(attP)，進而介導整合。attB和attP最小活性序列長度分別為34和39bp。經過位點特異性整合生成2個雜合位點attL與attR，attL與attR沒有顯著的DNA重複，不能作為整合酶重組的底物，反應是單向不可逆的。のC31-int催化作用具有自主作用的特點，不需要外界的化學能源、蛋白質輔助因子或者特殊的DNA拓撲結構。實施例4、土黴素(OTC)生產實例將去甲基化重組質粒(pSET152-otrA或pSET152-otrB)電轉化龜裂鏈黴菌エ業菌感受態細胞以後，培養在含有500 u g/mL Apramycin抗生素的TSA平板上，待長出菌落後， 再生長兩天，用扁平竹籤將菌落表面的灰白色孢子輕輕刮下，均勻規律地點至另ー塊已劃分好區域的TSA平板上。otrA基因增強重組菌株(SRI-A)共挑出85株，otrB基因增強重組菌株(SRI-B)共挑出120株。如圖6所示為部分平板背面示意圖。土黴素屬於四環素類抗生素，此類抗生素產生菌在生長的穩定期，次級代謝產物的合成常常伴有其他較深顏色色素的產生，所以觀察平板背面菌落的顔色，可以在一定程度上表明菌體抗生素合成的情況。依據這樣的原則，挑選背面顏色較深的SRI-A和SRI-B各10株，以未轉化的龜裂鏈黴菌エ業菌為對照(SRI)進行發酵試驗，每株菌平行做3瓶以減小試驗誤差。發酵試驗的過程500mL搖瓶發酵，裝液量I % (v/v)，接種量I %，30°C，260rpm培養8天，培養基為常規エ業配方(購自山西大同同星抗生素有限公司)。發酵結束後測定發酵液中土黴素的終濃度，各重組菌株的試驗結果見圖7。從圖中各菌株土黴素產量比較可以看出，所挑選的10株otrA增強重組菌株OTC產量與原始菌株相比均無明顯變化；而otrB基因增強重組菌株有80% 土黴素產量均較原始菌株有顯著的提高，且B-80菌株OTC產量較原始菌株提高了 73. 7%。從這ー結果可以看出，otrA基因的增強大體上對龜裂鏈黴菌エ業菌土黴素的產量沒有明顯影響，而otrB基因的增強卻能在一定程度上提高土黴素產量。結論與總結在細胞代謝網絡中，有很多對細胞生長或者對次級代謝產物產生具有正向調節作用的因子。本發明人在對這些細胞進行基因改造吋，總是試圖增強這些調節因子的表達，使其更利於產物的合成。通常採用的方法包括在基因上遊加入強啟動子，增加這些調節因子的應答元件的供應量，以及最常用的特異性重組等。本發明利用帶有ermE強啟動子的大腸桿菌-鏈黴菌穿梭質粒PSET152，構建帶有土黴素抗性基因的重組質粒，再將其導入SRI基因組中，利用質粒上的attP位點與基因組上的attB位點發生位點特異性重組，使SRI基因組中的土黴素抗性基因増加一個拷貝，且這個拷貝是在強啟動子的調控之下的。我們知道，細胞不能無限制的合成次級代謝產物，抗生素合成的中止不是由於其產生菌細胞體失去活力，而是以下三種可能的原因使其終止1)抗生素生物合成途徑中一個或更多的酶發生了不可逆衰退；2)胞內積累的抗生素產生了較強的反饋抑制作用；3)抗生素生物合成所需前體的耗竭。如果能克服其中導致抗生素生物合成終止的原因，那麼可以預測細胞將源源不斷的合成所需要的抗生素，這對於實際生產應用是相當有利的。而本發明所做的研究正是試圖解決產物的反饋抑制，提高抗生素產生菌自身抗性，從而提高抗
生素產量。細胞對抗生素具有與生俱來的抗性，這ー特性不僅限於抗生素產生菌，許多細菌和真菌也會在長期進化過程中形成對某些抗生素的抗性，這就形成了所說的耐藥性。抗生素普遍存在於環境中(尤其是土壤環境中)，對細菌的生存造成了壓力。在長期的進化過程中，抗生素耐藥基因在細菌中已經普遍存在。在非抗生素產生菌中，抗生素耐藥基因的表達主要是為了應對環境的抗生素壓力，而抗生素產生菌(如鏈黴菌)除了受到環境中的抗生素壓カ外，還首當其衝地受到自身所產生的抗生素的壓力，因而其抗生素耐藥基因的表達與調控機制就比非抗生素產生菌複雜，抗生素耐藥基因參與了抗生素的合成調控，以確保抗生素耐藥性的及時表達，從而免受自身抗生素的破壞。 在細菌中，至少存在以下幾種抗生素耐藥機制(I)合成鈍化抗生素的酶，如弗氏鏈黴菌的氨基糖苷耐藥性主要通過產生催化抗生素共價修飾的酶；(2)改變細菌細胞膜結構，如膜蛋白的缺失或變異、內膜滲透性的改變等；(3)通過主動排出機制降低細胞內的抗生素積累，如抗生鏈黴菌(S. an tibioticus)oleC基因所控制的竹桃黴素主動外排；(4)改變核糖體祀位，如從卡那黴素產生菌卡那黴素鏈黴菌(S. kana2my ceti2cus)中分離得到的一種誘導性卡那黴素耐藥基因通過修飾核糖體，調節蛋白質合成，可以賦予淺青紫鏈黴菌、淡紫灰鏈黴菌(S. Iavend u Iae)和微小鏈黴菌卡那黴素耐藥性；(5)改變靶酶，如青黴素結合蛋白；(6)過量合成靶酶；(7)存在抗生素抑制的旁路。有研究表明，抗生素合成基因與耐藥基因具有協調表達的效應。主要表現在1)抗生素耐藥基因一般早於抗生素合成而表達，耐藥基因可能具有雙重功能，首先它能夠使抗生素產生菌免於自身抗生素的破壞；其次，它又是激活抗生素合成基因的調節環路中的ー個重要成分，這確保了耐藥性的建立早於抗生素的合成；2)細胞大多具有誘導耐藥性；3)抗生素合成基因與耐藥基因的協調表達。ー些鏈黴菌具有2種或更多的抗生素耐藥機制，至少有I種耐藥基因與抗生素合成基因緊密連鎖。抗生素高產菌株的篩選也伴隨著耐藥水平的増加，反之亦然。所以研究抗生素耐藥基因對於實際生活和生產具有十分重要的意義I)，有助於闡明抗生素合成調控的途徑；2)，用作載體選擇標記；3)減少基因汙染；4)先分離耐藥基因，再分離合成基因簇，已經成為ー個經典的克隆策略；5)篩選高耐藥菌株以分離抗生素高產菌株；6)應用於藥物設計。土黴素抗性基因保護SRI不被自身產生的OTC所損傷。但是這種保護有一定的限度。當胞內OTC達到一定濃度時,otrB蛋白的相對不足會導致OTC不能及時被運送到胞夕卜，從而造成胞內OTC的過量積累，同時未被otrA蛋白修飾過的核糖體便會成為多餘OTC攻擊的目標，這樣便對自身造成了損傷。當本發明人將SRI中抗性基因的拷貝數和表達增強以後，額外的保護蛋白就能彌補這些不足。另外，由於OTC是一系列複雜生物反應合成的產物，合成過程中酶的酶活會受到終產物OTC的反饋抑制。也即當OTC生產到一定量時，會將產物已充足的信息反饋給細胞代謝調節因子，這些因子會進ー步降低產物合成的酶活，這樣不僅可以防止過量產物可能對菌體造成的損害，又能節約細胞內的資源，使底物都得到充分利用。由於otrB編碼的膜蛋白可將OTC運送至胞外，將此基因過量表達後，便能將更多的OTC運送至胞外，使胞內OTC —直維持在較低水平，可有效解除或降低反饋抑制。鏈黴菌一般都對自身產生的抗生素具有耐受性，然而對不同種類鏈黴菌所產生的抗生素可能敏感。抗生素生物合成基因簇中包含抗生素耐藥基因，這些耐藥基因所表達的耐藥機制對該基因簇所編碼合成的抗生素具有很強的選擇性。耐藥水平與抗生素合成水平呈正相關，抗生素產生能力的提高應該是抗生素合成調控基因的超量表達。這說明表達抗生素耐藥性的酶是抗生素生物合成途徑的限速酶。綜上，本發明以增強抗生素產生菌自身抗性為主線，結合龜裂鏈黴菌エ業菌株高生產性能，分別將SRI中兩個抗性基因增強，得到了 OTC高產菌株。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每ー篇文獻被単獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範 圍。
權利要求
1.一種增加龜裂鏈黴菌的土黴素產量的方法，其特徵在於，所述方法包括在龜裂鏈黴菌中増加土黴素抗性基因OtrA或OtrB的表達。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，在龜裂鏈黴菌中増加土黴素抗性基因OtrB的表達。
3.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，在龜裂鏈黴菌中増加一個拷貝的土黴素抗性基因otrA或otrB。
4.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述方法包括 (1)提供表達載體，所述表達載體中包含土黴素抗性基因otrA或otrB的序列； (2)將表達載體轉化龜裂鏈黴菌，選擇基因組中整合有外源的土黴素抗性基因otrA或otrB序列的重組龜裂鏈黴菌。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的表達載體中，土黴素抗性基因otrA或otrB的序列的5』端,包括強啟動子ermE。
6.如權利要求5所述的方法,其特徵在於，所述的表達載體是pSET152載體。
7.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，將表達載體轉化去甲基化菌株；從轉化的菌株中提取去甲基化的表達載體轉化龜裂鏈黴菌。
8.—種重組的龜裂鏈黴菌，其特徵在於，其基因組中整合有外源的土黴素抗性基因otrA或otrB的序列。
9.如權利要求8所述的龜裂鏈黴菌，其特徵在於，其是通過權利要求1-7任一所述的方法製備獲得。
10.一種生產土黴素的方法，其特徵在於，所述方法包括 培養權利要求8或9所述的重組的龜裂鏈黴菌，從而生產土黴素。
全文摘要
本發明涉及一種增加龜裂鏈黴菌的土黴素產量的方法。揭示了一種通過在龜裂鏈黴菌中增加土黴素otrA基因或otrB基因的表達，保護龜裂鏈黴菌自身，提高土黴素產量的方法。所述方法獲得的龜裂鏈黴菌的土黴素產量顯著提高。
文檔編號C12N15/63GK102757975SQ20111010732
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者儲炬, 姚高峰, 莊英萍, 張嗣良, 鄭子靜, 郭美錦, 錢江潮 申請人:華東理工大學