染色體特異分子標記及其應用的製作方法

2024-01-20 18:52:15

染色體特異分子標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於作物分子生物學與遺傳育種領域，具體涉及希爾斯山羊草1Ss染色體的特異分子標記的建立與應用，鹼基序列見序列表，擴增圖譜見附圖。使用建立的希爾斯山羊草1Ss染色體特異分子標記對雜交群體的鑑定結果與基因組原位雜交鑑定結果一致性為100%，因而，建立的分子標記可以對小麥背景中是否含有希爾斯山羊草1Ss染色體進行有效檢測。本發明獲得的特異分子標記不僅可用於小麥-希爾斯山羊草雜交群體的篩選、鑑定，還可以應用於輔助選育籽粒微量元素含量高及高品質的小麥新品系/品種，提高篩選效率，縮短育種時間，具有積極的產業化價值。
【專利說明】希爾斯山羊草1 Ss染色體特異分子標記及其應用
[0001]

【技術領域】 本發明屬於作物分子生物學與遺傳育種領域，具體涉及希爾斯山羊草ISs染色體特異 分子標記的建立，還涉及所述特異分子標記在跟蹤檢測小麥背景中希爾斯山羊草染色體方 面的應用。
[0002]

【背景技術】 全球有超過30億的人口處在體內缺Fe和Zn元素的"隱性飢餓"狀態下，有超過2. 5 億兒童不同程度的缺乏Fe和Zn元素（Underwood等，1998)。礦質元素特別是微量元素缺 乏和蛋白攝入量不足將增加社會醫療保健的開支，嚴重阻礙社會經濟的發展。我國小麥籽 粒礦質元素尤其是Fe和Zn元素含量還不能滿足人們的基本需求(朱展才和吳兆蘇，1991 ; 張勇等，2007)，因此，需要改良我國小麥礦質元素含量來改善人們的營養狀況。通過往土壤 裡施用含微量元素的肥料和選擇礦質含量高的小麥基因型作為親本進行育種工作，都是 可以提高小麥籽粒Fe和Zn元素含量的有效途徑。但是，在土壤偏鹼性的情況下，施用微量 元素肥料也於事無補。施用微量元素肥料將增加投入成本並且施用過量還會對土壤造成汙 染。因此，選擇礦質元素含量高的小麥親本或培育含有微量元素高效吸收基因的小麥品種 是最為有效和經濟的手段。小麥遠緣物種部分染色體上攜帶有控制礦質元素吸收和轉運的 基因，可以利用染色體工程的方法將小麥遠緣物種中攜帶高效吸收和轉運微量元素尤其是 Fe和Zn元素的染色體或染色體片段導入小麥，達到有效提高小麥籽粒Fe和Zn元素含量的 目的。
[0003] 山羊草屬（Genus JegiTrOAS)包含23個物種，均是小麥的遠緣物種。該屬物種的基 本基因組包括C、D、U、S、S^S'S'S'M.N和T。5個S型染色體（Sj1Jjsh和S b)和小 麥的B染色體都具有一定同源性。希爾斯山羊草Ga 染色體和擬斯卑爾脫 山羊草的S染色體都有可能是小麥B染色體的供體，這表明相比於其他 染色體，這二者可能與小麥B染色體發生重組更為容易，因此，值得在小麥育種中應用。目 前，擬斯卑爾脫山羊草的抗病和抗逆基因已經被應用於小麥抗性育種工作（Cherukuri等， 2005 ;Seyfarth等，1999 ;Helguera等，2000 ;Jia等，1996)。然而，對於希爾斯山羊草的利 用還有待於進一步加強。
[0004] 希爾斯山羊草，2n=14，基因組SsSs,高抗小麥葉銹病和白粉病（Buloichik等， 2008)、高抗小麥杆銹病（Liu等，2011)以及禾穀類二叉姆（Holubec和Havlickova, 1994)、 對乾旱和鹽脅迫也有較好的抗性（Nevo和Chen, 2010)。因此，該種質中的優異基因值得 進一步向小麥轉移。Friebe等（1995)鑑定了一整套中國春-希爾斯山羊草附加系，為定 位優異基因在染色體上的位置提供了研究材料。以這套附加係為工具，Garg等（2009)和 Wang等（2011)將顯者提商小麥品質、顯者提商小麥杆粒鐵和鋒兀素的基因分別都定位在 了希爾斯山羊草ISs染色體上；Buloichik等（2008)將抗小麥白粉病基因定位在2S S染色 體上；Liu等（2011)將抗小麥杆銹病基因定位在3SS染色體上。
[0005] 小麥-外源物種附加系中除了含有小麥育種需要的優異基因外，還含有一些控 制不利農藝性狀的基因，因此，需要利用染色體工程方法將其誘導後才能應用於小麥育 種工作。到目前為止，中國春-希爾斯山羊草3$附加系已經被成功改造並應用於小麥 抗軒鎊病育種工作中（Liu WX，Jin Y，Rouse M，Friebe B，Gill BS，and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet，2011，122:1537-1545.)。希爾斯山羊草ISs染色體的導入小麥不僅可 以提高籽粒鐵鋅含量，還可以提高小麥品質，但是IS s附加系尚未被利用染色體工程方法誘 導。基於此，我們開展了 ISs附加系的誘導工作。誘導群體的篩選與鑑定需要分子標記的 輔助進行，因此，希爾斯山羊草ISs染色體特異標記的建立對該工作的順利開展起著重要作 用。在希爾斯山羊草染色體分子標記建立方面，Liu等（Liu WX，Jin Y，Rouse M，Friebe Bj Gill BSj and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet，2011，122:1537-1545.)建立了希爾斯 山羊草3SS染色體的EST-STS標記，用這些標記鑑定了小麥-希爾斯山羊草易位系並定位 了來自希爾斯山羊草上的抗小麥軒銹病基因。Sun等（Sun X，Hu SL，Liu X，Qian WQ， Hao STj Zhang AM, Wang DW. Characterization of the HMW glutenin subunits from Aegilops searsii and identification of a novel variant HMW glutenin subunit. Theor Appl Genet，2006，113:631-641.)和 Garg 等（Garg M，Tanaka H，Ishikawa N， Takata K， Yanaka M， Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry, 2009， 86:26-321.)均建立了希爾斯山羊草ISs的種子蛋白標記。待測小麥材料若種植後收穫種 子再進行種子蛋白檢測，耗時太長而操作繁瑣。然而，能用於快速、簡便、實用且不依據待測 小麥整個生育期(材料發芽即可提取其DNA進行檢測)的小麥背景中希爾斯山羊草IS s染色 體(或染色體片段)的PCR標記檢測方法未見報導，因此，希爾斯山羊草ISs染色體PCR標記 的建立，將對其誘導群體的篩選鑑定以及高鐵鋅含量及高品質小麥品種選育都有很重要的 實際意義。
[0006]


【發明內容】
為了解決以上現有技術中沒有希爾斯山羊草ISs染色體的PCR標記的問題，本發明提 供了一種能夠快捷、有效、簡便地鑑定待測樣本中是否含有希爾斯山羊草ISs染色體的特異 分子標記。因此，本發明的目的是建立希爾斯山羊草IS s染色體特異分子標記，提供一種檢 測小麥背景中希爾斯山羊草染色質的新方法。
[0007] 本發明還提供了所述希爾斯山羊草ISs染色體特異分子標記在雜交種質篩選與鑑 定中的應用。
[0008] 本發明是通過以下措施得到的： 本發明所提供的檢測小麥背景中希爾斯山羊草ISs染色體的方法，是以待測希爾斯山 羊草、小麥-希爾斯山羊草ISs附加系及小麥對照基因組總DNA (表1)為模板，對EST-STS (expressed sequence tag-sequence tagged sites)、 EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeat)、SSR (simple sequence repeat)、COS (conserved orthologous set)和 PLUG (PCR-based landmark unique gene)引物進行篩選，篩選出能 在小麥-希爾斯山羊草ISs附加系中擴增出特異DNA條帶的引物，引物篩選的統計結果見 表2。進而，用篩選出的引物對小麥-希爾斯山羊草1SS-7SS附加系、端體附加系及小麥對照 (表1)進行PCR擴增，獲得小麥-希爾斯山羊草ISs附加系和相應端體附加系（ISsS或IS sL 端體附加系)中的能擴增出而小麥中不能擴增出的特異DNA條帶，獲得的這些特異DNA條帶 則來自希爾斯山羊草ISs染色體。其檢測特異擴增產物長度分別如表3所示。
[0009] EST-STS、COS和PLUG引物擴增特徵在於15 μ L PCR反應體系為：25 ng/ μ L的 模板 DNA 1 μ L，5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 IOX PCRbuffer 1.5 μ?，10μΜ的上、下遊引物各lyL，用無菌雙蒸餾水補充反應體系 至 15μ L ; PCR反應擴增程序為：94 °C預變性3 min，隨後35個循環：94°C變性45 S，57°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最後 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0010] EST-SSR引物擴增特徵在於15 μ L PCR反應體系為：25 ng/μ L的模板DNA 1 μ L， 5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1. 5μ L，10μ M的上、下遊引物各1 μ L，用無菌雙蒸餾水補充反應體系至15μ L ; PCR反應擴增程序為：94 °C預變性3 min，隨後35個循環：94°C變性45 S，52°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最後 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0011] SSR引物擴增特徵在於15 μ L PCR反應體系為：25 ng/μ L的模板DNA 1 μ L， 5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1. 5μ L，10μ M的上、下遊引物各1 μ L，用無菌雙蒸餾水補充反應體系至15μ L ; PCR反應擴增程序為：94 °C預變性3 min，隨後35個循環：94°C變性45S，55°C退火 45S，72°C延伸 2 min，最後 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0012] EST-SSR，SSR和COS引物擴增產物用8 %的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，電泳緩 衝液為1XTBE。取15μ?擴增產物，加入3yL指示劑(含0· 1%溴酚藍和0· 1%二甲苯青)， 混勻，上樣量3 μ L，180V恆定電壓電泳約55min。經硝酸銀染色30 min後觀察照相。PLUG 和EST-STS引物的擴增產物進行2%的瓊脂凝膠上電泳，電泳緩衝液為1XTAE。擴增產物 IOuL在150V恆壓下電泳約25min，然後用lug/mL的溴化乙錠溶液進行染色30min，最後在 ⑶S-Gel Dol 2000紫外凝膠成像系統下掃描照像。
[0013] 依據上述方法步驟，獲得一種希爾斯山羊草ISs染色體特異分子標記，一一列舉如 下： 短臂引物對鹼基序列如下： MAG2137-EST-SSR ： F :5' -GAGTTCGATGACATGGCTGA-3'，（見序列表中序列 1) R: :5' -CCGATAACAAAGTGCGTGAA-3' ；（見序列表中序列 2) 長臂引物對鹼基序列如下： Xgwml35-SSR ： F :5' -TGTCAACATCGTTTTGAAAAGG-3'，（見序列表中序列 3) R :5' -ACACTGTCAACCTGGCAATG-3' ；（見序列表中序列 4) BG606586-EST-STS ： F :5' -GGAGAAGCAAGACCACTTCG-3'，（見序列表中序列 5) R :5' -ATGTCGAATTCCAGCACCTC-3' ；（見序列表中序列 6) BF604958-EST-STS ： F :5' -GCAAAAGAAGAAGGGGAAGG-3'，（見序列表中序列 7) R :5' -GGTCATGTTGGTGATGTTGG-3' ；（見序列表中序列 8) BF474878-EST-STS ： F :5' -CATGTATCTGGTGGTGAGCTTT-3'，（見序列表中序列 9) R:5' -GTTCACCTGTGCTTGCATTC-3' ；（見序列表中序列 10) 希爾斯山羊草ISs染色體特異分子標記為上述5對引物中的一對以上的組合或者短臂 引物對與一對以上的長臂引物對的組合。
[0014] 所述的希爾斯山羊草ISs染色體特異分子標記的應用是使用所述的希爾斯山羊草 ISs染色體特異分子標記對待測樣品進行PCR擴增，對小麥背景中是否含有希爾斯山羊草 ISs染色體進行檢測或輔助檢測。
[0015] 檢測或輔助檢測步驟如下： (1) 以待測的可能含有希爾斯山羊草ISs染色體（或染色體片段）的小麥背景系的基 因組總DNA為模板，希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草ISs附加係為陽性對照，以中國春 小麥和其他4個不同小麥品種/品係為陰性對照，用權利要求1所述的希爾斯山羊草IS s染 色體特異分子標記分別對模板和對照進行PCR擴增，擴增結果使用2%瓊脂糖凝膠或8%聚 丙烯醯胺凝膠(交聯度為2. 5%)電泳進行檢測； (2) 如果待測模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中含有與陽性對照相同的特異DNA條帶而陰 性對照無該帶，則說明待測小麥背景系的基因組中含有希爾斯山羊草IS s染色體；如果待測 模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中不含有與對照相同的特異多態性DNA條帶，則說明待測小麥 背景系的基因組中不含有希爾斯山羊草IS s染色體。
[0016] 本發明的有益效果： 1、 本發明建立了希爾斯山羊草ISs染色體的新標記，提供了使用新標記檢測小麥背景 中希爾斯山羊草IS s染色體的新方法。因為希爾斯山羊草ISs染色體能顯著提高小麥籽粒 中微量元素 Fe和Zn含量，並且ISs的導入小麥可以顯著提高小麥加工品質，因此，本發明 獲得的特異分子標記可用於雜交群體的篩選、鑑定與輔助選育籽粒微量元素（Fe和Zn)含 量商及商品質的小麥新品系/品種； 2、 所篩選出的特異性分子標記，對小麥背景中是否含有希爾斯山羊草ISs染色體進行 檢測或輔助檢測，特異性強，檢測準確率高，提高篩選效率，縮短育種時間，具有積極的產業 化價值。
[0017]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1.引物MAG2137擴增產物在8%非變性聚丙烯醯胺凝膠(交聯度為2. 5%)中的電泳 結果，箭頭所示為多態性帶，其中A圖為引物MAG2137對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山 羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴增結果，B圖為引物 MAG2137對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SSB加系和中國春的擴增結果，C圖為引物MAG2137 對中國春-希爾斯山羊草IS s附加系、中國春-希爾斯山羊草ISs短臂和ISs長臂端體附加 系以及中國春的擴增結果； 圖2.引物Xgwml35擴增產物在8%非變性聚丙烯醯胺凝膠(交聯度為2. 5%)中的電泳 結果，箭頭所示為多態性帶，其中A圖為引物Xgwml35對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山 羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴增結果，B圖為引物 Xgwml35對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SS附加系和中國春的擴增結果，C圖為引物Xgwml35 對中國春-希爾斯山羊草IS s附加系、中國春-希爾斯山羊草ISs短臂和ISs長臂端體附加 系以及中國春的擴增結果； 圖3.引物BG606586擴增產物經限制性內切酶#沙1酶切後在2%的瓊脂糖凝膠中的電 泳結果，箭頭所示為多態性帶，其中A圖為引物BG606586對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯 山羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴增結果，B圖為引物 BG606586對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SS附加系和中國春的擴增結果，C為引物BG606586 對中國春-希爾斯山羊草IS s附加系、中國春-希爾斯山羊草短臂和ISs長臂端體附加系的 擴增結果； 圖4.引物BF604958擴增產物經限制性內切酶#沙1酶切後在2%的瓊脂糖中的電泳 結果，箭頭所示為多態性帶，其中A圖為引物BF604958對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯 山羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴增結果，B圖為引 物BF604958對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加系和中國春的擴增結果，C圖為引物 BF604958對中國春-希爾斯山羊草ISs附加系、中國春-希爾斯山羊草ISs短臂和IS s長 臂端體附加系以及中國春的擴增結果； 圖5.引物BF474878擴增產物經限制性內切酶你 el II酶切後在2%的瓊脂糖中的電 泳結果，箭頭所示為多態性帶，其中A圖為引物BF474878對希爾斯山羊草、中國春-希爾 斯山羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴增結果，B圖為 引物BF474878對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加系和中國春的擴增結果，C圖為引物 BF474878對中國春-希爾斯山羊草ISs附加系、中國春-希爾斯山羊草ISs短臂和IS s長 臂端體附加系以及中國春的擴增結果； 圖6為引物MAG2137對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2群 體的擴增產物在8%非變性聚丙烯醯胺凝膠中的電泳圖； 圖7為引物Xgwml35對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2群 體的擴增產物在8%非變性聚丙烯醯胺凝膠中的電泳圖； 圖8為引物BG606586對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2群 體的擴增產物經限制性內切酶酶切後在2%的瓊脂糖中的電泳圖； 圖9為引物BF604958對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2群 體的擴增產物經限制性內切酶酶切後在2%的瓊脂糖中的電泳圖； 圖10為引物BF474878對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2 群體的擴增產物經限制性內切酶酶切後在2%的瓊脂糖中的電泳圖； 圖11為基因組原位雜交鑑定分子標記鑑定出的部分中國春IB缺體和中國春-希爾 斯山羊草ISs附加系的部分雜交F2分離群體的雜交圖譜，其中，圖AD分別為雜交後代植株 AS-17、AS-96、AS-189和AS-342的基因組原位雜交結果。

【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明。
[0019] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0020] 下述實施例中，如無特殊說明，所用PCR體系方法與
【發明內容】
部分的描述的PCR體 系及方法相同，所有引物合成均由成都瑞信生物公司完成。所用TA編號的實驗材料(表1) 全部由美國堪薩斯州立大學小麥基因組學與遺傳資源中心Gill BS教授惠贈，公眾可從美 國堪薩斯州立大學小麥基因組學與遺傳資源中心（http://www. k-state. edu/wgrc/)有償 獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0021] 下述實施例中的綿陽11小麥（MYll)和中國春（CS) (Liu C，Yang ZJ，Li GR， Zeng ZX, Zhang Y, Zhou JP, Liu ZH, Ren ZL. 2008. Isolation of a new repetitive DNA sequence from Secale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat background. 159(1-2): 249-258·);綿陽 15 (MY15) (Zhou JP, Zhang HY, Yang ZJ, Li GR, Hu LJ, Lei MP, Liu C, Zhang Y, Zhang Y, Ren ZL. 2012. Characterization of a new T2DS. 2DL-?R translocation triticale ZH-I with multiple resistances to diseases. Genet Resour Crop Evol, 59(6):1161-1168. ) 1? 電子科技大學生命科學與技術學院楊足君教授提供，公眾可從山東省農業科學院作物所獲 得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。ASl-AS384為 中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草IS s附加系雜交F2群體。
[0022] 表1供試材料

【權利要求】
1. 一種希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標記，其特徵在於 短臂引物對鹼基序列如下： MAG2137-EST-SSR ： F :5, -GAGTTCGATGACATGGCTGA-3，， R: :5' -CCGATAACAAAGTGCGTGAA-3' ； 長臂引物對為下述引物對中的一對以上： Xg碰135-SSR : F :5' -TGTCAACATCGTTTTGAAAAGG-3'， R:5, -ACACTGTCAACCTGGCAATG-3,； BG606586-EST-STS ： F :5, -GGAGAAGCAAGACCACTTCG-3，， R:5' -ATGTCGAATTCCAGCACCTC-3' ； BF604958-EST-STS ： F :5, -GCAAAAGAAGAAGGGGAAGG-3，， R:5' -GGTCATGTTGGTGATGTTGG-3' ； BF474878-EST-STS ： F :5' -CATGTATCTGGTGGTGAGCTTT-3'， R:5' -GTTCACCTGTGCTTGCATTC-3' ； 希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標記為上述5對引物中的一對以上的組合或者短臂 引物對與一對以上的長臂引物對的組合。
2. -種權利要求1所述的希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標記的應用，其特徵在於 使用權利要求1所述的希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標記進行PCR擴增，對小麥背景 中是否含有希爾斯山羊草1SS染色體進行檢測或輔助檢測。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於檢測或輔助檢測步驟如下： (1) 以待測的可能含有希爾斯山羊草1^染色體或染色體片段的小麥背景系的基因組 總DNA為模板，用權利要求1所述的希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標記分別對模板和 對照進行PCR擴增，擴增結果使用凝膠電泳進行檢測； (2) 如果待測模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中含有與陽性對照相同的特異DNA條帶而陰 性對照無該帶，則說明待測小麥背景系的基因組中含有希爾斯山羊草1^染色體；如果待測 模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中不含有與對照相同的特異多態性DNA條帶，則說明待測小麥 背景系的基因組中不含有希爾斯山羊草1SS染色體。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於步驟（1)中使用希爾斯山羊草、中國春-希 爾斯山羊草1SS附加係為陽性對照，以中國春小麥和/或其他不同小麥品種/品係為陰性 對照。
5. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於BG606586-EST-STS、BF604958-EST-STS和 BF474878-EST-STS引物對擴增特徵在於15 ii L PCR反應體系為：25 ng/ ii L的模板DNA 1 u L, 5 U/uL Taq DNA polymerase 0? 15 ii L，200 ii M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1.5 iiL, 10iiM的上、下遊引物各1 iiL,用無菌雙蒸饋水補充反應體系至15iiL; PCR反應擴增程序為：94 °C預變性3 min，隨後35個循環：94°C變性45 S，57°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最後 72°C延伸 10 min，4°C保存。
6. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於MAG2137-EST-SSR引物對擴增特徵在 於 15 iiL PCR 反應體系為：25 ng/iiL 的模板 DNA liiL，5 U/iiL Taq DNA polymerase 0.15iiL，200 iiM 的 dNTPs，含 Mg2+的 10X PCRbuffer 1.5iiL，10iiM 的上、下遊引物各 1 U L，用無菌雙蒸餾水補充反應體系至15 y L ; PCR反應擴增程序為：94 °C預變性3 min，隨後35個循環：94°C變性45 S，52°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最後 72°C延伸 10 min，4°C保存。
7. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於Xgwml35-SSR引物對擴增特徵在於15 yL PCR 反應體系為：25 ng/uL 的模板 DNA In L，5 U/uL Taq DNA polymerase 0.15 uL， 200 iiM 的 dNTPs，含 Mg2+的 10X PCRbuffer 1.5iiL，10iiM 的上、下遊引物各 liiL，用無 菌雙蒸餾水補充反應體系至15 y L ; PCR反應擴增程序為：94 °C預變性3 min，隨後35個循環：94°C變性45S，55°C退火 45S，72°C延伸 2 min，最後 72°C延伸 10 min，4°C保存。
8. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於步驟（1)中使用2%瓊脂糖凝膠或8%的交 聯度為2. 5%的聚丙烯醯胺凝膠電泳進行檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104371996SQ201410666237
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月20日 優先權日:2014年11月20日
【發明者】劉成, 宮文英, 劉建軍, 李根英, 宋健民, 李豪聖, 劉愛峰, 曹新有, 程敦公, 王燦國, 趙振東 申請人:山東省農業科學院作物研究所