植物乳桿菌、植物乳桿菌菌粉及其作為泡菜發酵劑的應用的製作方法
2023-08-12 11:10:36 4
本發明涉及食品領域，且特別涉及一種植物乳桿菌、植物乳桿菌菌粉及其作為泡菜發酵劑的應用。
背景技術：
：泡菜是深受中國人民喜愛的一種醃製食品，味道鮮美，爽口可人。從古至今，不管是逢年過節，還是在日常的飲食當中，泡菜始終是餐桌上的一道美味食品。泡菜不僅能夠提高人們的食慾，還能在發酵的過程中產生對人體有益的乳酸菌，抑制腸道中腐敗菌的生長，促進人體的消化作用。但在泡菜的醃製過程中，會產生對人體健康不利的亞硝酸鹽。亞硝酸鹽來主要來自於蔬菜中含量較高的硝酸鹽，蔬菜吸收氮肥或土壤中的氮素，積累無毒的硝酸鹽，但在醃製過程中硝酸鹽被一些亞硝酸鹽還原細菌轉變成亞硝酸鹽，從而產生毒性。從張小紅等2006年發表的文章《食品中亞硝酸鹽對人體的危害及防治》，我們得知亞硝酸鹽是強氧化劑，進入血液後與血紅蛋白結合，使氧合血紅蛋白變為高鐵血紅蛋白，從而失去攜氧能力，導致組織缺氧。此外，亞硝酸鹽在自然界中極易與胺合成N-亞硝胺，亞硝胺是一種致癌物質。因此在泡菜的醃製過程中產生的亞硝酸鹽不利於人們的健康，存在食品安全問題。所以，找到一種有效降低泡菜中亞硝酸鹽含量的方法至關重要。在國家標準《GB2762-2012》中明確規定，蔬菜及其製品、醃漬蔬菜中亞硝酸鹽的含量限量為20mg/kg。目前，也有關於降低泡菜中亞硝酸鹽含量的報導。中國專利CN102018154A接種乳酸菌降低了泡菜中亞硝酸鹽含量，但在泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量相對較高；中國專利ZL96119451.0無鹽發酵工業化生產醃漬蔬菜及其製備方法經熱燙對蔬菜的營養有所破壞，且僅適用於有發酵池的工業生產。因此，在人們物質生活質量逐漸提高，對食品安全問題越來越重視的背景下，發明一種簡單、快速、安全的泡菜發酵劑，同時能有效降低泡菜中亞硝酸鹽含量的方法有著重要的意義。技術實現要素：本發明的第一目的在於提供一種植物乳桿菌，該乳桿菌活性較高且生長較快，能迅速地發酵生產泡菜，同時抑制亞硝酸鹽還原菌的生長和繁殖。本發明的第二目的在於提供一種植物乳桿菌菌粉，該植物乳桿菌菌粉活菌含量高，保存穩定，適用於家庭和工業生產泡菜，同時顯著降低泡菜中亞硝酸鹽的含量。本發明的第三目的在於提供上述植物乳桿菌菌粉作為泡菜發酵劑在快速發酵泡菜、降低泡菜亞硝酸鹽中的應用。本發明解決其技術問題是採用以下技術方案來實現的：本發明提出一種植物乳桿菌，其生物保藏編號為：CGMCCNo.13755，該植物乳桿菌於2017年3月15日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所。本發明還提出一種植物乳桿菌菌粉，其由上述植物乳桿菌與保護劑按重量比1:50-80混合後，經冷凍乾燥而得。其中，保護劑包括重量比為1-3:2-3:1.5-2.5:2-3的山梨醇、十二烷基磺酸鈉、八硫酸蔗糖和脫脂乳粉。本發明還提出一種植物乳桿菌菌粉作為泡菜發酵劑的應用。本發明較佳實施例中植物乳桿菌菌粉的有益效果是：在植物乳桿菌菌粉製備過程中加入保護劑，可改變植物乳桿菌冷凍時的物理、化學環境，防止水分升華對細胞的損害，並且通過保護劑中保護性溶質所含有的氫鍵和離子鍵對水和細胞產生親和力來穩定細胞成分的構型，減輕或防止冷凍或復水對菌絲體的損害，使菌種儘可能保持其原有的生物活性。保護劑中含有重量比為1-3:2-3:1.5-2.5:2-3的山梨醇、十二烷基磺酸鈉、八硫酸蔗糖和脫脂乳粉，不僅使保護劑的成本較為低廉，且通過該四種物質按上述配比協同作用，使保護劑對植物乳桿菌的保護效果最佳。因此，本發明較佳實施例中的植物乳桿菌菌粉活菌含量高，可用於快速發酵生產泡菜，同時顯著降低泡菜中亞硝酸鹽的含量，且保存穩定。其所含的活性成分植物乳桿菌具有較好地抑制亞硝酸鹽產生作用，將該植物乳桿菌菌粉作為泡菜發酵劑用於泡菜生產中，可顯著降低泡菜中亞硝酸鹽含量，縮短泡菜發酵的成熟時間，改善泡菜色澤和風味，同時提高泡菜的食品安全性。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對範圍的限定，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發明實施例提供的植物乳桿菌的生物保藏信息及存活證明；圖2為本發明試驗例提供的泡菜的實物圖。具體實施方式為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。下面對本發明實施例的植物乳桿菌、植物乳桿菌菌粉及其應用進行具體說明。本發明實施例提供的用於泡菜發酵和降低亞硝酸鹽的植物乳桿菌菌粉，以植物乳桿菌和保護劑混合後，再經冷凍乾燥而得。其中，植物乳桿菌分離於自然發酵的泡菜汁。經鑑定，本發明實施例中的菌種的確屬於植物乳桿菌屬，且其分類命名為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，並於2017年3月15日在位於北京朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.13755。本實施例所用的植物乳桿菌的生物保藏信息以及存活證明請參見圖1。該植物乳桿菌具體篩選過程如下：為了提高篩選效率，篩選例如可以包括初篩和復篩。其中初篩通常是從大量的菌落中隨機挑取部分菌落進行試驗並通過檢測得到一些較優菌株，刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產形狀類似的菌株儘量保留下來，使優良菌種不至於漏網，該篩選類型主要以量為主，精確性為次；復篩則是將初篩得到的較優菌株再進行多次試驗，驗證其效價和傳代穩定性，從而從中得到一兩個或少數幾個最優的菌株，該篩選類型主要以質為主。初篩例如可以利用MRS瓊脂培養基對自然發酵的泡菜汁中的乳酸菌進行篩選。具體地，將上述泡菜汁進行梯度稀釋，然後分別塗布於含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養皿中，並於32-38℃的條件下培養36-54h。其中，碳酸鈣的加入量優選為MRS瓊脂培養基重量的1-3％，加入碳酸鈣後的MRS培養基能使乳酸菌菌落周圍形成透明圈(也即溶鈣圈)，便於與其餘菌種進行區分。待培養基表面長出菌落，挑取培養皿中帶有明顯透明圈的單菌落。更優地，根據菌種的生長圈和透明圈大小，挑取3-5株透明圈直徑和菌落直徑之比較大的單菌落作為初篩菌。其中，MRS瓊脂培養基例如可以包括質量比為8-12:3-7:3-5:1.5-2.5:18-22:4-6:1.5-2.5:0.1-0.3:0.03-0.07:12-18的蛋白腖、牛肉粉、酵母粉、檸檬酸三銨、葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳和瓊脂粉，以及體積比為7-9:80-120的吐溫和水。將MRS瓊脂培養基的pH優選控制在6-6.4範圍內，以利於菌株生長繁殖。配製新的MRS瓊脂培養基，例如可採用劃線接種方式接種上述初篩菌進行分離純化，得到純化的初篩菌。然後，將初篩所得的初篩菌分別配製成初篩菌菌懸液，並添加於含有亞硝酸鹽的MRS瓊脂培養基中，以不含菌懸液的上述含亞硝酸鹽的MRS瓊脂培養基為空白對照，測定培養基中亞硝酸鹽的含量，選取單位細胞使亞硝酸鹽含量降低最多的菌株作為復篩菌也即本實施例中的植物乳桿菌，保存備用。經測定，本發明實施例所篩選出的植物乳桿菌的活菌的數量為2.8-3.2×109cfu/mL。作為可選地，本實施例中植物乳桿菌與保護劑可按重量比1:50-80混合。其中，保護劑例如可以包括重量比為1-3:2-3:1.5-2.5:2-3的山梨醇、十二烷基磺酸鈉、八硫酸蔗糖和脫脂乳粉。加入保護劑的目的是為了防止菌種在冷凍乾燥過程中由於外界環境溫度較低而喪失活性，導致活菌數大大下降。其保護機制為：保護劑可改變植物乳桿菌冷凍時的物理、化學環境，防止水分升華對細胞的損害，並且通過保護劑中保護性溶質所含有的氫鍵和離子鍵對水和細胞產生親和力來穩定細胞成分的構型，減輕或防止冷凍或復水對菌絲體的損害，使菌種儘可能保持其原有的生物活性。其中，山梨醇作為多羥基化合物，具有比甘露醇更穩定的特點，將其作為保護劑成分之一，可較現有技術中採用的甘露醇作為保護劑的方案成本更低，且效果相當。十二烷基磺酸鈉為表面活性劑，可在冷凍乾燥過程中對菌體所含的蛋白質進行適當保護。八硫酸蔗糖作為糖類物質，是蛋白質的非特異性穩定劑，在凍幹的各個階段均能對蛋白質物質起到一定的保護作用。按上述比例將山梨醇、十二烷基磺酸鈉、八硫酸蔗糖和脫脂乳粉共同作為保護劑的成分，可通過各物質之間的協同作用，對植物乳酸菌起到最佳的保護效果。為了使保護劑能與植物乳桿菌混合充分及均勻，可在混合前，將上述甘露醇、山梨醇、葡萄糖和脫脂乳粉進行加熱溶解，冷卻後再與植物乳桿菌混合。經保護劑保護後的植物乳桿菌菌粉中植物乳桿菌的死亡率較低，存活率為85-92％，活菌數為2.5-3×109cfu/mL。值得說明的是，本實施例中的乳桿菌菌粉還可由混合後的植物乳桿菌與保護劑經噴霧乾燥或其它乾燥方式而得。上述植物乳桿菌菌粉例如可作為泡菜發酵劑用於生產泡菜。具體地，選取待泡製的蔬菜，例如豇豆、蘿蔔、大白菜和捲心菜等，洗淨後除去蔬菜表面的水分，然後裝入泡菜容器中。配置含有植物乳桿菌菌粉的泡菜鹽水，並將其加入至泡菜容器中，也即將蔬菜浸泡於泡菜鹽水中。該泡菜鹽水中所含的食用鹽與水的比例可以是1g:10-20mL。因傳統泡菜中的亞硝酸鹽主要是由於蔬菜本身具有較高的硝酸鹽，在其醃製過程中，硝酸鹽被亞硝酸鹽還原菌轉化成有毒的亞硝酸鹽，從而產生毒性。為了使植物乳桿菌能夠有效抑制亞硝酸鹽還原菌的生長和繁殖，進而降低泡菜亞硝酸鹽的含量，本實施例中優選按重量比0.07-0.28:100將植物乳桿菌菌粉加入至泡菜鹽水中。為了縮短泡製時間，可以將上述蔬菜進行切分處理，以增大其與泡菜鹽水的接觸面積，更易入味。此外，發酵時，泡菜容器中泡菜鹽水的添加量優選控制在將蔬菜完全淹沒，以避免泡製效果不均勻。因植物乳桿菌為厭氧或兼性厭氧菌，故本實施例中的泡菜泡製過程優選於密閉條件下發酵，發酵溫度例如可控制在15-30℃。泡製過程中，分別對不同泡製時間的泡菜所含的亞硝酸鹽含量進行測定，結果顯示整個泡製過程中亞硝酸鹽的含量均不超過0.253mg/kg，遠遠低於國家標準《GB2714-2003》中規定的亞硝酸鹽含量(20mg/kg)。值得說明的是，本實施例中保護劑的種類和各成分的配比、泡製過程中的發酵時間及溫度均不限於上述描述內容，相關人員可根據實際情況進行適當調整。以下結合實施例對本發明的特徵和性能作進一步的詳細描述。實施例1配製8個pH為6的MRS瓊脂培養基，每個MRS瓊脂培養基含有8g蛋白腖、3g牛肉粉、3g酵母粉、1.5g檸檬酸三銨、18g葡萄糖、4g乙酸鈉、1.5g磷酸氫二鉀、0.1g硫酸鎂、0.03g硫酸錳、12g瓊脂粉以及7mL吐溫和80mL水，按MRS瓊脂培養基重量的1％向MRS瓊脂培養基中加入碳酸鈣。將自然發酵的泡菜汁進行5個梯度的對半稀釋，然後將稀釋後的5個濃度的泡菜汁分別塗布於5個含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養基中，於32℃的條件下培養54h。待培養基表面長出菌落，挑取3株透明圈直徑和菌落直徑之比較大的菌落為初篩菌，然後將上述3株初篩菌分別劃線接種於剩餘的3個含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養基中進行分離純化，得到純化後的初篩菌。按照上述方法另配製4個MRS瓊脂培養基，並向其中3個培養基分別加入等量的亞硝酸鹽。然後將純化後的初篩菌分別配置成相同濃度的菌懸液，並分別添加於上述含有亞硝酸鹽的3個MRS瓊脂培養基中。以不含菌懸液的MRS瓊脂培養基為空白對照，測定各培養基中亞硝酸鹽的含量，選取單位細胞使亞硝酸鹽含量降低最多的菌株作為植物乳桿菌。該植物乳桿菌的活菌數量為2.8×109cfu/mL。將植物乳桿菌與保護劑按重量比為1:50混合，然後經冷凍乾燥後得到植物乳桿菌菌粉。其中，保護劑含有重量比為1:2:1.5:2的山梨醇、二烷基磺酸鈉、八硫酸蔗糖和脫脂乳粉。該植物乳桿菌菌粉中植物乳桿菌的存活率為85％，活菌數為2.5×109cfu/mL。實施例2配製10個pH為6.4的MRS瓊脂培養基，每個MRS瓊脂培養基含有12g蛋白腖、7g牛肉粉、5g酵母粉、2.5g檸檬酸三銨、22g葡萄糖、6g乙酸鈉、2.5g磷酸氫二鉀、0.3g硫酸鎂、0.07g硫酸錳、18g瓊脂粉以及9mL吐溫和120mL水，按MRS瓊脂培養基重量的3％向MRS瓊脂培養基中加入碳酸鈣。將自然發酵的泡菜汁進行5個梯度的對半稀釋，然後將稀釋後的5個濃度的泡菜汁分別塗布於5個含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養基中，於38℃的條件下培養36h。待培養基表面長出菌落，挑取5株透明圈直徑和菌落直徑之比較大的菌落為初篩菌，然後將上述5株初篩菌分別劃線接種於剩餘的5個含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養基中進行分離純化，得到純化後的初篩菌。按照上述方法另配製6個MRS瓊脂培養基，並向其中5個培養基分別加入等量的亞硝酸鹽。然後將純化後的初篩菌分別配置成相同濃度的菌懸液，並分別添加於上述含有亞硝酸鹽的5個MRS瓊脂培養基中。以不含菌懸液的MRS瓊脂培養基為空白對照，測定各培養基中亞硝酸鹽的含量，選取單位細胞使亞硝酸鹽含量降低最多的菌株作為植物乳桿菌。該植物乳桿菌的活菌數量為3.2×109cfu/mL。將保護劑進行加熱溶解，冷卻後與植物乳桿菌按重量比為80:1混合，然後經噴霧乾燥後得到植物乳桿菌菌粉。其中，保護劑含有重量比為3:3:2.5:3的山梨醇、二烷基磺酸鈉、八硫酸蔗糖和脫脂乳粉。該植物乳桿菌菌粉中植物乳桿菌的存活率為92％，活菌數為3×109cfu/mL。實施例3配製12個pH為6.2的MRS瓊脂培養基，每個MRS瓊脂培養基含有10g蛋白腖、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g檸檬酸三銨、20g葡萄糖、5g乙酸鈉、2g磷酸氫二鉀、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳、15g瓊脂粉以及8mL吐溫和100mL水，按MRS瓊脂培養基重量的2％向MRS瓊脂培養基中加入碳酸鈣。將自然發酵的泡菜汁進行8個梯度的對半稀釋，然後將稀釋後的8個濃度的泡菜汁分別塗布於8個含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養基中，於38℃的條件下培養36h。待培養基表面長出菌落，挑取4株透明圈直徑和菌落直徑之比較大的菌落為初篩菌，然後將上述4株初篩菌分別劃線接種於剩餘的4個含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養基中進行分離純化，得到純化後的初篩菌。按照上述方法另配製5個MRS瓊脂培養基，並向其中4個培養基分別加入等量的亞硝酸鹽。然後將純化後的初篩菌分別配置成相同濃度的菌懸液，並分別添加於上述含有亞硝酸鹽的4個MRS瓊脂培養基中。以不含菌懸液的MRS瓊脂培養基為空白對照，測定各培養基中亞硝酸鹽的含量，選取單位細胞使亞硝酸鹽含量降低最多的菌株作為植物乳桿菌。該植物乳桿菌的活菌數量為3×109cfu/mL。將保護劑進行加熱溶解，冷卻後與植物乳桿菌按重量比為65:1混合，然後經噴霧乾燥後得到植物乳桿菌菌粉。其中，保護劑含有重量比為2:2.5:2:2.5的山梨醇、二烷基磺酸鈉、八硫酸蔗糖和脫脂乳粉。該植物乳桿菌菌粉中植物乳桿菌的存活率為88％，活菌數為2.7×109cfu/mL。實施例4將洗淨並除去表面水分的豇豆加入至泡菜容器中。按1g:10mL將食用鹽和水配製成泡菜鹽水，並按重量比0.07:100將實施例1所得到的植物乳桿菌菌粉加入至上述泡菜鹽水中。向泡菜容器中加入含有植物乳桿菌菌粉的泡菜鹽水至其將豇豆完全淹沒。然後於15℃的密閉條件下發酵10天。實施例5將洗淨並除去表面水分的大白菜切塊後加入至泡菜容器中。按1g:20mL將食用鹽和水配製成泡菜鹽水，並按重量比0.28:100將實施例2所得到的植物乳桿菌菌粉加入至上述泡菜鹽水中。向泡菜容器中加入含有植物乳桿菌菌粉的泡菜鹽水至其將大白菜完全淹沒。然後於30℃的密閉條件下發酵10天。實施例6將洗淨並除去表面水分的捲心菜切碎後加入至泡菜容器中。按1g:15mL將食用鹽和水配製成泡菜鹽水，並按重量比0.175:100將實施例3所得到的植物乳桿菌菌粉加入至上述泡菜鹽水中。向泡菜容器中加入含有植物乳桿菌菌粉的泡菜鹽水至其將捲心菜完全淹沒。然後於22.5℃的密閉條件下發酵10天。實施例7將洗淨並除去表面水分的蘿蔔切塊後加入至泡菜容器中。按1g:18mL將食用鹽和水配製成泡菜鹽水，並按重量比0.2:100將實施例3所得到的植物乳桿菌菌粉加入至上述泡菜鹽水中。向泡菜容器中加入含有植物乳桿菌菌粉的泡菜鹽水至其將蘿蔔完全淹沒。然後於25℃的密閉條件下發酵10天。試驗例重複實施上述實施例4-7，並以實施例4-7中植物乳桿菌菌粉在泡菜中的應用作為試驗組1-4，分別設置未添加植物乳桿菌菌粉的對照組1-4。上述對照組的其餘泡製條件均分別與試驗組1-4相同。分別於泡製發酵過程中的第2天、第4天、第6天、第8天和第10天稱取等量試驗組和對照組中的泡菜，採用分光光度法按照《GB5009.33-2010》中《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》的標準測定泡菜中亞硝酸鹽的含量；另外，在泡製發酵過程的第1天、第2天、第4天、第6天、第8天和第10天分別提取等量試驗組和對照組的泡菜液，用pH計測定泡菜液的pH，其結果如表1和表2所示。表1亞硝酸鹽含量(mg/kg)第2天第4天第6天第8天第10天試驗組10.270.520.090.120.11對照組135.7343.833.259.462.2試驗組20.130.210.060.070.05對照組233.1539.4131.5210.072.66試驗組30.150.120.030.170.11對照組334.5540.6130.759.112.49試驗組40.220.310.060.110.10對照組431.7238.6430.449.852.27由表1可以看出，同樣發酵條件下，發酵第2天、第4天、第6天、第8天和第10天中試驗組1-4的亞硝酸鹽含量遠遠低於其對應的對照組1-4，同時所有發酵過程中的亞硝酸鹽含量也遠遠低於國家標準20mg/kg，說明通過在泡菜泡製過程中添加本發明實施例中的植物乳桿菌菌粉，可顯著降低泡菜的亞硝酸鹽含量。表2泡菜發酵過程中pH值的變化由表2可以看出，同樣發酵條件下，發酵第1天、第2天、第4天、第6天、第8天和第10天中試驗組1-4較與其分別對應的對照組1-4中泡菜液的pH值明顯更低，說明通過在泡菜泡製過程中添加本發明實施例中的植物乳桿菌菌粉，在第二天即可使泡菜液的pH值降低到3左右。且通過泡菜液的pH變化趨勢可以看出，達到同樣值的pH，試驗組所需的發酵時間要顯著短於對照組所需的發酵時間，因此，通過在泡菜泡製過程中添加本發明實施例中的植物乳桿菌菌粉，可明顯縮短泡菜的發酵成熟時間。此外，請參照圖2，圖中第一瓶為未添加本發明實施例中的植物乳桿菌菌粉所得的泡菜，第二瓶到第四瓶為添加了本發明實施例中的植物乳桿菌菌粉所得的泡菜，由圖可以看出，在泡菜泡製過程中添加本發明實施例中的植物乳桿菌菌粉較未添加本發明實施例中的植物乳桿菌菌粉所得的泡菜色澤更新鮮亮澤，並且由於減少了雜菌的汙染，風味也更加鮮香爽脆。綜上所述，本發明實施例的植物乳桿菌菌粉活菌含量高，能快速發酵生產泡菜，同時顯著降低泡菜中亞硝酸鹽的含量，且保存穩定。植物乳桿菌菌粉中的活性成分植物乳桿菌活性較高且生長較快，從而迅速地抑制了亞硝酸鹽還原菌的生長和繁殖，顯著降低泡菜中亞硝酸鹽含量。將上述植物乳桿菌菌粉作為泡菜發酵劑應用於泡菜生產中，可顯著降低泡菜中亞硝酸鹽含量，縮短泡菜發酵的成熟時間，改善泡菜色澤和風味，同時提高泡菜的食品安全性。以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述並非旨在限制要求保護的本發明的範圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。當前第1頁1 2 3