定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1a1基因分型的測序引物對及其試劑盒的製作方法
2024-01-26 03:36:15
專利名稱：定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1a1基因分型的測序引物對及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及體外核酸檢測領域，尤其涉及一種在臨床樣本中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測序引物對及其試劑盒。
背景技術：
尿苷二憐酸葡萄糖醒酸基轉移酶(uridinediphosphoglucuronateglucucronosy I transferase, UGT)是生物體內進行第II相生物轉化時最重要的酶之一，屬於糖基轉移酶超家族。UGT共有2個亞家族，UGTlA和UGT2家族。UGTlAl是一種對許多內源性和外源性物質進行解毒，加強其排洩的重要酶類，UGTlAl基因的遺傳多態性對減輕藥物的毒副作用有重要的臨床意義。目前發現的多態性主要包括(TA) η重複序列啟動子(UGT1A1*28)的多態性和UGT1A1*6基因序列的多態性。在中國人中，UGT1A1*28隻發現兩種類型(TA)6和(TA)7，可組合成TA6/6、TA6/7和TA7/7三種等位基因。相對於TA6/6表·型患者，TA7/7表型患者的UGTlAl酶活性降低約50%。UGT1A1*6基因突變主要發生在第一號外顯子第211核苷酸上G突變成A，導致其編碼的甘氨酸變為精氨酸(G71R)。UGTlAl基因表達減少會增加人體對某些藥物的敏感性，可能發生未預期的毒性。伊立替康(Irinotecan，CPT-11)，是DNA拓撲異構酶I抑制劑，可誘導單鏈DNA損傷，從而阻斷DNA複製叉，阻止DNA鏈的重新組裝，引起DNA雙鏈的斷裂，造成細胞死亡。主要治療成人晚期轉移性大腸癌，對小細胞和非小細胞肺癌、宮頸癌和卵巢癌亦有療效。伊立替康為前體藥物，在體內經過羧酸酯酶轉化為活性代謝物。羧酸酯酶將伊立替康分子10位的哌啶側鏈裂解，產生7-乙基-10-羥基喜樹鹼(SN-38)，其活性較伊立替康強100到1000倍。SN-38經肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-GT，主要由UGTlAl、UGT1A7和UGT1A9代謝)葡萄糖醛酸化滅活，生成葡萄糖醛酸化SN-38 (SN-38G),從而保護健康細胞免受伊立替康毒性的影響。但UGTlAl酶的UGT1A1*28的形式不能催化SN-38，結果聚集在體內的SN-38引發腹瀉或嗜中性白血球減少症等其他毒性，UGT1A1*28的突變使UGTlAl的轉錄活性下降三分之二，UGT1A1*6的突變導致酶活性降為野生型的49%，因此，2005年，美國FDA要求在伊立替康藥品標籤上加入警示,建議患者在使用伊立替康前先檢查是否帶有UGT1A1*28 突變。目前醫院用於UGTlAl基因分型檢測的「金標準」是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對於含〈10%突變細胞的腫瘤組織以及外周血，常規PCR+直接測序法幾乎無能為力。相比於直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基於聚合原理的DNA測序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術。它是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中並釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，並由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然後加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達到測定DNA序列的目的目前市場上還沒有利用焦磷酸技術進行UGTlAl的基因多態性檢測的產品。
發明內容
本發明的目的是提供一種特異性高、準確性好、能夠定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測序引物對及其試劑盒。為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測序引物對，所述引物對為如下引物
UGT1A1*6 正向擴增引物5' -CAGCAGAGGGGACATGAAAT-3' (SEQ IDN0. I)；UGT 1A1*6 反向擴增引物5' -CTTTGGAATGGCACAGGGTAC-3' (SEQ IDN0. 2)UGT1A1*6 測序引物5' -CTTCAAGGTGTAAAATGC-3' (SEQ ID NO. 3)UGT1A1*28 正向擴增引物5' -TGAAAGTGAACTCCCTGCTACC-3' (SEQID NO. 4)UGT1A1*28 反向擴增引物5' -TCCACTGGGATCAACAGTATCTT-3' (SEQID NO. 5)UGT1A1*28 測序引物5' -CGCCCTCTCCTACTTA-3' (SEQ ID NO. 6)其中，UGT1A1*6正向擴增引物(SEQ ID NO. I)和 UGT1A1*28 (SEQ IDN0.4)正向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶IAl基因分型的測序試劑盒，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ ID NO. 5所示反向擴增引物的PCR反應液2，SEQ ID NO. I和SEQ IDN0. 4所示的正向擴增引物，SEQ IDNO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5，端進行生物素標記。進一步地，所述試劑盒中還包括質控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對照品的超純水；質控序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用於檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。進一步地，所述試劑盒還包括UGT1A1*6陽性對照品1，UGT1A1*6陽性對照品2，UGT1A1*6陽性對照品3 ;UGT1A1*28陽性對照品1，UGTIAl氺28陽性對照品2，UGTIAl氺28陽性對照品3 ；所述UGT1A1*6陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的UGT1A1*6野生純合子質粒；所述UGT1A1*6陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的UGT1A1*6突變純合子質粒；UGT1A1*6陽性對照品3為由所述UGT1A1*6突變純合子質粒和所述UGT1A1*6野生純合子質粒組成的UGT1A1*6質粒混合物；所述UGT1A1*28陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的UGT1A1*28野生純合子質粒；UGT1A1*28陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的UGT1A1*28突變純合子質粒；UGT1A1*28陽性對照品3為由所述UGT1A1*28突變純合子質粒和所述UGT1A1*28野生純合子質粒組成的UGT1A1*28質粒混合物；其中，質粒載體為pMD18-T質粒；所述UGT1A1*6質粒混合物中UGT1A1*6突變純合子質粒和所述UGT1A1*6野生純合子質粒的數量比為I: I ;所述UGT1A1*28質粒混合物中UGT1A1*28突變純合子質粒和所述UGT1A1*28野生純合子質粒的數量比為1:1。所述的PCR反應液I和PCR反應液2中其他組分為常規的IOx PCR Buffer、dNTP和H2O,各組分按常規體積比配置(IOx PCR Buffer、dNTP、H2O和反應液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、螢光素酶和雙 磷酸酶組成的酶混合物，由5』-磷醯硫酸和螢光素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。與現有技術相比，本發明的有益效果為I)本發明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒定性準確，具有靈敏性高、特異性強的優點，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機反應，直接給出檢測位點頻率分析，結果直觀。2)本發明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒靈敏度和特異性高；3)本發明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒檢測速度快；4)本發明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒步驟簡單；5)本發明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。6)本發明的試劑盒中設置了空白對照和陽性對照，能更好的確保檢測結果的準確性。由於設計了靈敏度高，特異性好的引物，並且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒能夠對UGTlAl基因分型進行快速檢測。本發明的試劑盒可實時監測反應進程，反應時間短，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，高通量，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用於突變分析。
圖I為臨床樣本UGT1A1*6野生型的焦磷酸測序圖；圖2為臨床樣本UGT1A1*6突變雜合型的焦磷酸測序圖；圖3為臨床樣本UGT1A1*6突變純合型的焦磷酸測序圖；圖4為臨床樣本UGT1A1*28野生型的焦磷酸測序圖。圖5為臨床樣本UGT1A1*28突變雜合子型的焦磷酸測序圖。圖6為臨床樣本UGT1A1*28突變純合子型的焦磷酸測序圖。圖7為臨床質控品control oligo的焦磷酸測序結果圖；圖8為臨床空白對照的焦憐酸測序結果圖；圖9為多組設計引物的凝膠電泳圖；圖中①、②表明非特異性條帶，③表明特異性和片段大小均比較合適，④表明目的帶片段大小不對。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
實施例I :試劑盒的製備I.引物的設計與合成研究表明目前針對UGTlAl基因多態性主要是UGT1A1*6和UGT1A1*28兩種基因多態性，UGT1A1*6基因突變主要發生在第一號外顯子第211核苷酸上G突變成A，導致其編碼的甘氨酸變為精氨酸(G71R)，UGT1A1*28的多態性是(TA)n重複序列啟動子，使用PyroMarkAssay Design2. O軟體，根據這兩個突變位點(表I)設計並確定了 PCR擴增引物和焦磷酸測序引物(表2)，試劑盒中最主要的影響試劑盒的準確性的就是引物，包括擴增引物和測序引物，在設計的初期，我們設計了多組引物進行比較(見圖9);其中擴增引物和測序引物先經過PAGE純化，再經HPLC純化，其中UGT1A1*6正向擴增引物(SEQ ID NO. I)和UGT1A1*28(SEQ ID NO. 4)正向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。表I.突變位點與類型
權利要求
1.一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶IAl基因分型的測序引物對，其特徵在於，所述引物對為SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 4所示引物的5』端進行生物素標記。
2.一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶IAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQID NO. 5所示反向擴增引物的PCR反應液2，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 6 所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 5 PJf示引物的5』端進行生物素標記。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括SEQID NO. 7所示的質控品和空白對照品。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述空白對照品為水。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括UGT1A1*6陽性對照品I,UGTlAl氺6陽性對照品2,UGTlAl氺6陽性對照品3 ;UGT1A1*28陽性對照品1，UGT1A1*28陽性對照品2，UGT1A1*28陽性對照品3 ； 所述UGT1A1*6陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的UGT1A1*6野生純合子質粒；所述UGT1A1*6陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的UGT1A1*6突變純合子質粒；UGT1A1*6陽性對照品3為由所述UGT1A1*6突變純合子質粒和所述UGT1A1*6野生純合子質粒組成的UGT1A1*6質粒混合物； 所述UGT1A1*28陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的UGT1A1*28野生純合子質粒；UGT1A1*28陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的UGT1A1*28突變純合子質粒；UGT1A1*28陽性對照品3為由所述UGT1A1*28突變純合子質粒和所述UGT1A1*28野生純合子質粒組成的UGT1A1*28質粒混合物； 其中，質粒載體為PMD18-T質粒。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述UGT1A1*6質粒混合物中UGT1A1*6突變純合子質粒和所述UGT1A1*6野生純合子質粒的數量比為1:1。
7.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述UGT1A1*28質粒混合物中UGT1A1*28突變純合子質粒和所述UGT1A1*28野生純合子質粒的數量比為1:1。
全文摘要
本發明提供一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A1基因分型的測序引物對及其試劑盒，屬於體外核酸檢測領域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反應液、PCR擴增引物、焦磷酸測序引物、以及陽性對照品；本發明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用於突變分析。
文檔編號C12Q1/68GK102899406SQ20121034797
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者周姍 申請人:長沙三濟生物科技有限公司