預測hcv治療中的早期病毒學應答的製作方法

2023-04-28 14:53:06

專利名稱：預測hcv治療中的早期病毒學應答的製作方法
預測HCV治療中的早期病毒學應答本發明涉及預測C型肝炎病毒(HCV)感染患者對藥物治療的應答的有用的方法。
背景技術：
慢性C型肝炎的標準護理是PEG幹擾素加利巴韋林(ribavirin)的組合1。在用標準護理治療後，整體的持續的病毒學應答(SVR)率是約50% 2_4，儘管難以預測單個患者是否將實現SVR。實現SVR的可能性隨許多患者和病毒因子而改變。例如，較年輕的患者、高加索人和亞洲患者，以及沒有晩期肝纖維樣變性的個體更易於在治療後清除HCV感染5-8。類似地，感染2型或3型基因型，而非I型基因型HCV的患者，以及血清中具有低基線HCV RNA水平的患者具有最佳的治癒機會2_4』6』8。目前，僅在開始治療後才可能更精確地預測SVR。不論HCV基因型，在治療4或1 2周後清除了 HCV RNA的個體比具有持續性病毒血症的患者有更好的實現SVR的機會9。快速的病毒學應答(RVR，在第4周無法檢測到HCV RNA)是SVR的有力預示；相反，不能實現早期的病毒學應答(EVR，在第12周HCV RNA下降大於2倍對數log)是無應答的有力預示，不依賴於預處理的特徵'預期地區分標準護理的潛在應答者和無應答者的能力對慢性C型肝炎患者的護理具有巨大影響。可以基於患者應答標準護理的可能性來個性化治療決策。例如，具有用現有的護理標準實現SVR的最低可能性的患者可以推遲治療，直到可獲得直接作用的抗病毒劑。相反，具有實現SVR的高可能性的患者可優選用已知的治療方案立即開始療法。除宿主和病毒因子外，宿主的遺傳多祥性也影響對標準護理治療的應答n。基因組範圍的關聯性研究的現有證據提示在IL_28b基因的啟動子區域中的單核苷酸多態性(SNP)強烈影響用PEG幹擾素加利巴韋林治療的患者中的SVR的可能性12_14。本分析的目標是探索在多個患者同齡組中與早期病毒學應答(EVR)和SVR均相關的SNP，所述患者包括首次接受治療的個體，以及對先前的PEG幹擾素a-2b(12KD)加利巴韋林的療程的無應答者，所述無應答者接受過PEG幹擾素a-2a(40KD)單ー療法、或用PEG幹擾素a-2a(40KD)或常規幹擾素加利巴韋林的組合療法。發明概述本發明基於這樣的發現，即在rsl2979860位置處的SNP基因型和用基於幹擾素的方案來治療的患者中的EVR和SVR之間的強烈相關性。在一個實施方案中，本發明提供了預測感染了 HCV的人類對象對基於幹擾素的治療的早期病毒學應答的方法，所述方法包括提供來自所述人類對象的樣品，鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象在rsl2979860處存在至少ー個C等位基因表示相對於在rsl2979860處存在兩個T等位基因的對象的更高的早期病毒學應答的可能性。在另ー個實施方案中，本發明提供了預測感染了 HCV的人類對象對基於幹擾素的治療的早期病毒學應答的方法，所述方法包括提供來自所述人類對象的樣品，鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象在rsl2979860處存在兩個T等位基因表示相對於在rsl2979860處存在至少ー個C等位基因的對象的更高的無早期病毒學應答的可能性。在另ー個實施方案中，本發明提供了選擇在感染了 HCV的人類對象中實現持續的病毒學應答的基於幹擾素的治療的持續時間的方法，其中所述基於幹擾素的治療選自PEG幹擾素ct-2a與利巴,林、PEG幹擾素a-2a與直接作用的抗病毒劑、PEG幹擾素a-2a與利巴韋林和直接作用的抗病毒劑，或利巴韋林與直接作用的抗病毒劑(與內源性幹擾素)，所述方法包括提供來自所述人類對象的樣品，鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象在rsl2979860處存在至少ー個C等位基因表示相對於在rsl2979860處存在兩個T等位基因的對象，基於幹擾素的治療在更短的持續時間內實現持續的病毒學應答。在另ー個實施方案中，本發明提供了預測感染了 HCV的人類對象對於使用PEG幹擾素a _2a、利巴韋林與直接作用的抗病毒劑的治療的應答的方法，所述方法包括提供來自所述人類對象的樣品，鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象在rsl2979860處存在至少ー個C等位基因表示相對於在rsl2979860處存在兩個T等位 基因的對象，所述對象實現對所述治療的早期病毒學應答或持續的病毒學應答的更高的可能性。在另ー個實施方案中，本發明提供了預測感染了 HCV的人類對象對於使用PEG幹擾素a -2A、利巴韋林與直接作用的抗病毒劑的治療的應答的方法，所述方法包括提供來自所述人類對象的樣品，鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象在rsl2979860處存在兩個T等位基因表示相對於在rsl2979860處存在至少ー個C等位基因的對象，所述對象無法實現對所述治療的早期病毒學應答或持續的病毒學應答的更高的可能性。
附圖
簡介圖I :在整體I型基因型群體中，通過染色體針對rsl2979860調整後的(a)SVR(b)EVR)和(c)SVR的基因組範圍的關聯性結果。圖2 : (a) SVR和(b)EVR)的測試統計值分布的分位值-分位值圖。灰色圓圈表示預期的P值，藍色圓圈表示觀察到的P值。圖3 :在高加索人I型基因型群體的IL-28區域中的顯著SNP (p < 10_5)的連鎖不平衡。發明詳述定義為了便於理解本發明，下文定義了多個術語。本文中定義的術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義。術語如単數形式「a」、「an」和「 the」並不意在僅表示單數實體，也包括具體實例可用於示例的一般類型。本文中的術語是用於描述本發明的具體實施方案，但是除非概括在權利要求中，否則它們的使用不限定本發明。術語對使用幹擾素的治療的「應答」是對施用活性劑的理想應答。病毒學終點包括「早期病毒學應答」(EVR)，定義為從基線至第12周血清HCV RNA下降彡2-log (由CobasAmplicor HCV Monitor Test，v2. 0，定量限制為 600IU/mL);完全 EVR(cEVR)，定義為在血清中無法檢測到HCV RNA(由Cobas Amplicor HCV Test，2. 0版，定量限制為50IU/mL)；或和「持續的病毒學應答」(SVR)，定義為24周的未治療隨訪期結束時，無法檢測到HCVRNA( < 50IU/mL)。 術語「樣品」或「生物學樣品」指從個體分離的組織或液體樣品，包括但不限於組織活體檢查、血漿、血清、全血、脊髄液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外切片、淚液、唾液、乳汁、血細胞、腫瘤、器官。還包括體外細胞培養物成分的樣品(包括但不限於從培養基中的細胞生長獲得的條件培養基、推定感染病毒的細胞、重組細胞和細胞組分)。術語「幹擾素」和「幹擾素-a 」在本文中可互換的使用，指抑制病毒複製和細胞増殖，並調節免疫應答的高度同源的物種特異性蛋白質家族。典型的合適幹擾素包括但不限於重組幹擾素a-2b (例如可獲得自Schering Corporation, Kenilworth, N. J.的Intron A幹擾素)、重組幹擾素a-2a (例如可獲得自Hoffmann-La Roche, Nutley,N.J.的Roferon -A幹擾素)、重組幹擾素a-2C (例如可獲得自Boehringer IngelheimPharmaceutical, Inc. , Ridgefield, Conn.的Berofor ct 2 幹擾素)、幹擾素 a-nl,純 化的天然a幹擾素的摻合物(例如可獲得自Sumitomo, Japan的Slimiferon 或可獲得自 Glaxo-Wellcome Ltd. , London, Great Britain 的 Wellferon 幹擾素 a-nl (INS))、或者共有a幹擾素(例如在美國專利號4，897，471和4，695，623中描述的那些(特別地其實施例7、8或9),或可獲得自Amgen, Inc. , Newbury Park, Calif.的特定產品)、或者幹擾素a-n3，由幹擾素Sciences生產的天然a幹擾素的混合物，可以商標名Alferon獲得自 Purdue Frederick Co. , Norwalk, Conn.。使用幹擾素 a-2a 或 a-2b 是優選的。幹擾素可包括下文定義的PEG化的幹擾素。術語「PEG化幹擾素」、「PEG化幹擾素a 」和「PEG幹擾素」在本文中可互換的使用，意指幹擾素a (優選幹擾素a-2a和a _2b)的聚こニ醇修飾的綴合物。典型的合適PEG化幹擾素a包括但不限於Peffasvs 和Peg-Intron 0術語「利巴韋林」指化合物1-((2R，3R，4S，5R)_3，4-ニ羥-5-羥甲基-四氫-呋喃-2-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸醯胺，其是合成的、非幹擾素誘導型的、廣譜抗病毒核苷類似物，可以名稱Virazole 和Copegus 茯得。「直接作用的抗病毒劑」產生不依賴於免疫功能的特定抗病毒效應。用於HCV的直接作用的抗病毒劑的實例包括但不限於蛋白酶抑制劑、聚合酶抑制劑、NS5A抑制劑、IRES抑制劑和解旋酶抑制劑。目前為慢性C型肝炎患者推薦的第一線治療是在攜帯I型或4型基因型病毒的患者中，用PEG化幹擾素a與利巴韋林組合達48周，而在攜帯2型或3型基因型病毒的患者中達24周。發現在一個或多個幹擾素a療程後復發的患者中，以及之前未受治療的患者中，用利巴韋林的組合治療比幹擾素a単一療法更有效。然而，利巴韋林表現出顯著的副作用，包括致畸性和致癌性。此外,利巴韋林導致溶血性貧血,需要在約10-20%的患者中降低劑量或中斷利巴韋林療法，這可能與利巴韋林三磷酸在紅細胞中的積累有夫。因此，為了降低治療成本和負面事件的發生，將治療調整為較短的持續時間同時不損害療效是理想的。對於I型基因型患者，使用PEG化幹擾素a和利巴韋林的縮短的「治療持續時間」可以是例如24周。對於I型基因型患者，使用PEG化幹擾素a和利巴韋林與直接作用的抗病毒劑組合的縮短的治療持續時間可短至8周、12周或16周。在本文中，術語「等位基因」和「等位變體」指基因的備選形式，包括內含子、外顯子、內含子/外顯子接點和與基因或其部分相關的3'和/或5'非翻譯區。一般而言，等位基因佔據了同源染色體上的相同基因座或位置。當對象具有基因的兩個相同的等位基因時，稱所述對象對於所述基因或等位基因是純合的。當對象具有基因的兩個不同的等位基因時，稱所述對象對於所述基因是雜合的。特定基因的等位基因可以在單個核苷酸或若干個核苷酸處彼此不同，並且可以包括核苷酸的替換、缺失和插入。在本文中，術語「多態性」指共存ー個以上的核酸形式，包括外顯子和內含子，或其部分(例如，等位變體)。具有至少2個不同形式的基因部分(S卩，兩種不同的核苷酸序列)被稱為基因的多態性區域。多態性區域可以是單個核苷酸，即「單核苷酸多態性」或「SNP」，所述單個核苷酸在不同等位基因中是不同的。多態性區域還可以是若干個核苷酸長。多種用於檢測多態性的方法是已知的並可與本發明聯合使用。一般而言，包括直接(例如原位雜交)或間接(鑑定次級分子的改變，例如蛋白質序列或蛋白質結合)地鑑定下層(underlying)核酸序列中的ー個或多個突變。檢測多態性的ー種普遍已知的方法是使用探針進行等位基因特異性雜交，所述探 針與突變或多態性位點重疊，並具有突變或多態性區域周圍的約5、10、20、25或30個核苷酸。為了在試劑盒中使用，向使用者提供例如若干個能夠與等位基因變體(如單核苷酸多態性)特異性雜交的探針，或者所述探針甚至附著在固相支持物(例如珠或晶片)上。單核苷酸多態性「rsl2979860」指通過其在SNP資料庫(dbSNP, www.ncbi.nlm.nih. gov/SNP/)中的登錄號鑑定的SNP，它位於人的19號染色體的IL28b基因的啟動子區域中。對來自兩個大型多國研究的數據進行此分析的結果(描述在實施例章節中)驗證並拓展了由Ge等人首次報導12的IL28b區域中的SNP和用PEG幹擾素加利巴韋林治療後的SVR之間的顯著關聯。在本分析中，最佳SNP(rsl297980)與EVR(p = 5. OXl(T2e)和SVR(p=I. 4X IO-21)均關聯。本研究的獨有優點在於包括了下文所述的患者，以及具有良好譜系的大型亞組的無應答者的本質，所述患者不僅在用PEG幹擾素a-2a(40KD)加利巴韋林治療後實現了 SVR，還在用PEG幹擾素a -2a(40KD)單ー療法和常規幹擾素加利巴韋林的組合的治療後實現了 SVR。本研究允許產生若干個獨特的提示。首先，我們提示了 rsl2979860的作用最可能是對EVR而非SVR產生的。與EVR而非SVR的關聯性是在之前的對治療無應答者中，和在用PEG幹擾素a-2a(40KD)單ー療法或用常規幹擾素加利巴韋林來治療的患者中觀察到的。我們將此解釋為意味著該SNP發揮作用的機制與血清HCV RNA水平中的快速第一期下降相關，而不與較慢第二期下降或肝細胞轉化相關。HCV RNA的第一期下降是經過充分描述的現象，其在基於幹擾素的療法起始後不久發生，提示為是特別的患者對幹擾素的敏感性的標誌19。之後，該研究中使用的特別的晶片允許我們對除rsl2979860外的一系列SNP的顯著性等級進行排序，所有的SNP都是在之前的研究中鑑定的12_14』2°』21。雖然在IL28b區域中鑑定了若干高度顯著的標誌物，在針對rsl297980調整後它們卻無一與SVR顯著相關。在針對rsl2979860調整後，僅ー個SNP(rs8099917)與EVR統計顯著相關；然而，在針對多重比較調整後，上述關聯性也不被視為是顯著的。此外，通過針對rsl2979860調整，我們能夠開始探索潛在的基因-基因相互作用，所述相互作用可以影響實現病毒學應答的可能性。如前所述，在此方法之後，在初歩分析中在IL28b區域中鑑定的的其他高度顯著的SNP無ー保留；然而，掲示了位於4號染色體上的一系列之前未報導過的SNP。在包括上述研究在內的多個回顧性研究中獲得的一致結果12_14』2°_23允許我們自信地認為在IL28b的啟動子區域中的SNP與使用基於幹擾素的療法的治療結果高度相關。已經提示在該區域中多個啟動子之一中的變化改變了幹擾素入的肝細胞表達。幹擾素入是III型幹擾素，觸發與I型幹擾素(包括幹擾素a )的Jak/Stat途徑重疊的信號傳遞途徑24_26。我們假設在具有「允許的(permissive)」 SNP的患者中，HCV感染誘導局部生產幹擾素，包括III型幹擾素(例如IL28)。這導致在肝臟中幹擾素誘導的基因表達。該假設與之前的報導一致，即對基於幹擾素的療法的無應答者在療法開始前，其肝臟中具有增加的幹擾素刺激型基因(ISG)的肝表達，並且處於明顯的「預活化」狀態27。尚未能清楚解釋在內源性ISG誘導水平和隨後對幹擾素療法的應答之間的明顯矛盾的關係。ー些研究人員推測與蛋白激酶PKR相似的ISG誘導對軸的某些下遊效應可能通過磷酸化真核起始因子2 a (eIF2a)抑制內源性蛋白質生產，並導致對外源性幹擾素的進ー步刺激不應的 (refractory)的肝細胞不能進ー步減弱蛋白質生產28。HCV RNA通過內部的核糖體進入位點被翻譯，且部分地不依賴於eIF2a。因此，儘管是「預活化的」狀態，可以不減弱地繼續HCVRNA的複製和其他病毒粒子的裝配28。該假設解釋了為何在我們的分析中，較之更可治療的基因型，弱應答的GWAS基因型與更低的病毒負載相關，儘管之前的分析提示増加的基線病毒負載是差的治療結果的標誌6。幹擾素的內源性生產部分地損害了病毒複製，但同時也損害了這些患者中的宿主細胞蛋白質合成。可能存在這樣的閾值，在所述閾值之上，宿主細胞不能進ー步減少蛋白質生產或増加ISG的刺激。因此，外源性幹擾素不能增強宿主應答。然而，與此相矛盾的是，施用外源性PEG化幹擾素可以「拯救」對內源性幹擾素較不敏感的患者。遺傳多態性可能在ISG表達中發揮作用。這致使我們推測最終可能能夠選擇性地靶向幹擾素途徑，以生產導致根除HCV的更有利的ISG譜。更具有挑戰性地是解釋4號染色體中的SNP與SVR而不與EVR相關的可能機制。最簡單的解釋可能需要該區域中的基因涉及僅與SVR相關的現象，例如肝細胞轉化。該機制還可能涉及額外的宿主-宿主或宿主-病毒基因相互作用，藉此兩個基因座都產生其效應，並需要進ー步的仔細評估。在IL28b區域中發現的幹擾素治療易感性基因座對使用現有的護理標準(SOC)的療法(即，PEG幹擾素加利巴韋林)具有啟示作用。在不久的將來，可以設想在ー些患者中，在療法開始前確定IL28b基因型，並且將所述患者不僅通過HCV基因型分類(如目前推薦的1)，而且通過人的基因型分類。與目前的治療規範相反，初始治療方案將基於病毒的和人的基因型。需要在預期的試驗中論述利巴韋林在上下文中的推定的作用。該發現還對正在進行的用於HCV療法的直接作用的抗病毒劑研發項目具有啟示作用。直接作用的抗病毒劑產生不依賴於免疫功能的特定抗病毒效應，但認為至少ー些研發中的藥物類型可受益於累加的(如果不是協同的)先天性免疫調節效應。實際上，基於幹擾素的療法很可能將保留治療的骨架，因為需要阻止出現抗性HCV. 29HCV RNA編碼可以抑制I型幹擾素的誘導的蛋白質。例如，HCV的NS3-4A蛋白酶通過幹擾幹擾素調控因子-3 (IRF-3)的磷酸化作用，阻斷dsRNA-誘導的幹擾素生產3°。因此，NS3-4A蛋白酶是雙治療靶，抑制其可以阻斷病毒複製和恢復IRF-3對HCV RNA複製的控制。當與第二種小分子或標準護理組合施用時具有強抗病毒效應的蛋白酶抑制劑(例如特拉匹韋(Telaprevir))還抑制HCV籍以損害宿主幹擾素應答的蛋白酶的功能。重要的是觀察當在具有幹擾素不應的和幹擾素敏感的IL28b表現型的患者中組合直接作用的抗病毒劑與PEG幹擾素加利巴韋林時，治療結果是否相似。幹擾素不應的患者對三重療法(直接作用的抗病毒劑加PEG幹擾素加利巴韋林)的應答可能與其僅接受使用直接作用的抗病毒劑的單ー療法相似。如果情況如上所述，則在用藥物(例如特拉匹韋)治療的過程中，具有幹擾素不應的IL28b表現型的患者對抗性突變的選擇更易感31。這些可能性提示了這樣的情形，其中具有幹擾素易感的SNP(rsl2979860)的患者可能受益於使用PEG幹擾素和利巴韋林的縮短的治療，而具有幹擾素不應的基因型的患者可能是延長的治療持續時間和/或更密集的治療方案的候選對象。備選地，對於具有幹擾素不應的基因型的患者而言，直接作用的抗病毒劑的不含幹擾素的組合方案可為更恰當的。我們獨特的數據集突出了 rsl2979860SNP與EVR而非SVR的關聯，所述數據集包括對先前對使用PEG化幹擾素標準護理的無應答者的患者的PEG幹擾素a -2a加利巴韋林 療法的註冊試驗。換言之，該SNP定義了患者對幹擾素的應答，而不是對療法的最終應答，並由於他們實現EVR的可能性因此幫助鑑定可能或不太可能經歷SVR的患者。它不太可能獨立於EVR來預測SVR。這對於一起使用直接作用的抗病毒劑與幹擾素具有巨大的啟示作用。利用幹擾素應答的基線遺傳預示允許調整直接作用的抗病毒療法，以及幹擾素的標準護理。被定義為幹擾素應答性低下的患者(即，在rsl2979860中2個T等位基因)可以是下文所述的小分子治療劑的差的候選對象，所述小分子治療劑依賴於內源性或外源性幹擾素介導的途徑的累積或協同效應——特別地如果其是作為除SOC外的單種活性劑提供的。應關心的是由於有效的單ー療法的結果，這些患者具有增加的出現藥物抗性突變的風險。相反，具有幹擾素應答表現型(即，在rsl2979860中2個C等位基因)的患者是對只使用SOC或與小分子的組合的療法的較短療程的優秀候選對象。幹擾素應答性的遺傳素質(predisposition)所允許的其他考慮是「協調」直接作用的抗病毒劑的組合。預測具有可接受的內源性幹擾素應答的患者可以是靶向病毒功能的藥物(例如，對內源性幹擾素應答也具有抑制性作用的蛋白酶抑制劑)的優秀候選對象，以及減少病毒PAMP (病原體相關分子模式)量的藥物(例如，聚合酶抑制劑)的較差的候選對象，因其可損害患者通過患者的內源性幹擾素應答來促進自身治癒的能力。類似地，較之單獨的直接作用的抗病毒劑，或三重療法(S0C與ー種DAA)，預測具有低下的幹擾素應答的患者可為以「四重」療法作為第一線療法(2種直接作用的抗病毒劑，加入到PEG幹擾素和利巴韋林)的候選對象。
實施例Tffe患者樣品收集和病毒學終點分析2次大型的多國隨機性III期試驗中招募的患有慢性C型肝炎患者亞群的樣品3』15。在ー個研究中，首次接受幹擾素的患者隨機接受為其48周的僅使用PEG幹擾素a-2a (40KD),或與利巴韋林組合,或常規幹擾素a-2b加利巴韋林的治療3。僅前12周療程中對PEG幹擾素a-2b(12KD)加利巴韋林的無應答者有資格進行第二個試驗，其中，使患者隨機接受為期48或72周的、使用PEG幹擾素a-2a(40KD)的標準或誘導劑量方案的治療15(全部患者接受標準劑量的利巴韋林)。研究設計、入選和排除標準以及這些試驗的初步結果公開在別處3』15。從同意參與遺傳分析的患者收集的血液樣品儲藏在羅氏臨床樣品儲藏庫(RocheClinical Sample repository)中。在羅氏臨床樣品儲藏庫中提取DNA,並歸ー化為50ng/U L0 使用 Y 染色體特異性 TaqMan 測定(Applied Biosystems,Foster City, CA)首先對樣品進行質量檢查，評估DNA量和性別與符合臨床數據。病毒學終點包括定義為從基線至第12周血清中無法檢測到HCV RNA(由CobasAmplicor HCV Test, 2. 0 版，檢測限制 50IU/mL)或血清 HCVRNA 下降彡 2-log (由 CobasAmplicor HCV Monitor Test，2. 0版，定量限制600IU/mL)的早期病毒學應答(EVR)和定義 為在24周的未治療隨訪期結束時，無法檢測到HCV RNA ( < 50IU/mL)的持續的病毒學應答(SVR)。在SVR的GWAS分析中，應答者組由來自首次接受幹擾素的研究群體的具有SVR的全部I型基因型患者組成。無應答者由I)來自由PEG化幹擾素治療再次攻擊的研究群體的全部I型基因型非SVR患者，和2)來自用PEG化幹擾素和利巴韋林治療的首次接受幹擾素的研究群體的I型基因型的非SVR患者組成。因此，來自由PEG化幹擾素再次攻擊的研究群體的群體的全部應答者被排除在本分析之外。在EVR的GWAS分析中，EVR組由來自首次接受幹擾素的研究群體的具有EVR的全部I型基因型患者組成。非EVR組由I)來自用PEG化幹擾素再次攻擊的患者群體的全部患者，和2)來自首次接受治療的研究群體的用PEG化幹擾素+利巴韋林治療的I型基因型非EVR患者組成。分別在每個試驗中，在非I型基因型的患者中的自報導的高加索人的IL28B區域SNP中進行額外的探索性研究。(參見結果章節的細節)。基因分型數據分析使用HumanOmni IQuad (V I. 0)晶片和 iScan 掃描儀，在 Illumina Infinilim HDAssay Super上對樣品的1，016，423個標誌物進行基因分型。實施初始質量控制以由於重複樣品間的不一致的定型(call)、過剩雜合性、低定型率(く 0. 95)、簇分離、GenTrain分數、強度和簇寬度來消除SNP。共計25個樣品未能通過初始質量檢查或後續的基因分型嘗試。在質量控制後，生成了具有基因型定型的1，002，139個SNP。計算自報告的高加索人群體的每條染色體的SNP數、等位基因頻率分布和哈迪溫伯格平衡。統計學分析在單變量邏輯回歸模型中評估病毒學應答(EVR或SVR)和基線變量(年齡、體重指數[BMI]、HCV RNA水平和ALT商作為連續變量輸入；性別、HCV基因型、組織學診斷(存在或不存在肝硬化)和人種作為分類變量輸入)之間的關聯性。在針對基線BMI、性別、年齡、病毒負載、ALT商和主成分分析(PCA)組分調整後，使用邏輯回歸(PR0C LOGISTIC, SAS v9. 2)測試個體SNP和應答/不應答之間的關聯性。
如Purcell等人提出的16，使用以總群體(「pgt」)創造的祖先數據集，基於PCA進行祖先分析。總群體補充了來自11個不同種族的對象集的HapMap III期創立者，並在SAS JMP Genomics (S AS Institute Inc. , Cary, NC, USA)中進行分析。比較具有或沒有異常值的PCA組分。異常值被定義為這樣的個體，所述個體的祖先距離在前十個推斷的變異軸之ー上的平均值至少6倍標準差。去除位於X和Y染色體或線粒體DNA上的SNP，以及在HapMap III期創立者中沒有基因分型的SNP (釋放數27)，或者在具有已知的高度連鎖不平衡的區域(Chr5，44-51. 5Mb ；Chr6,24-36Mb ；Chr8,8-12Mb ；Chrll,42-58Mb ；Chrl7,40-43Mb)中的 SNP。使用窗ロ 大小1000，r2 < 0. 25和窗ロ偏移100的PLINK16使剩餘的SNP稀疏。通過邏輯回歸分析來測試在病毒學應答(EVR和SVR)和單個SNP之間的關聯性。針對基線特徵(BMI、性別、年齡、基線HCV RNA水平、ALT商數和PCA組分)進行調整。通過似然比測試(LRT)評估顯著性。無效模型定義如下病毒學應答=BMI+性別+年齡+HCV RNA水平+ALT商+PCA組分。在無效模型中，假定SNP的遺傳效應為0.備選模型定義如下病毒學應答=BMI+性別+年齡+HCV RNA水平+ALT商+PCA組分+SNP。使用LRT比較每個備選模型(即，含SNP的)的最大可能性估計量與相應的無效模型(即，不含SNP的)，其具有X平方分布和等於不同參數數量的自由度。SNP作為連續變量(0、1、2)輸入模型中。PCA組分代表分析群體中最高的5個組分。在自報告的高加索人群體和非I型基因型群體中運行相似的模型。在高加索人「pgt」群體的IL-28區域中的顯著SNP(p < 10_5)中計算連鎖不平衡(LD)。在Haploview v4. I17中生成r2的LD圖,LD塊是通過Gabriel等人的方法18推斷的。結果可獲得共計406名首次接受治療的患者和426名未對之前用PEG幹擾素a -2b(12KD)治療的過程應答的患者的樣品。EVR分析基於來自800名患者的數據，包括363名實現了 EVR的個體(45% )和437名未實現EVR的個體(55% )。SVR分析基於來自663名患者的數據，包括245名實現了 SVR的個體(37% )和418名未實現SVR的個體(63%)。表I中顯示了包括在EVR和SVR分析中的患者的基線特徵。基線因子的單變量邏輯回歸模型顯示HCV基因型(p = 1.50X10_25)、年齡(5. 80X 10べ8)、ALT 商(p = 7. 50 X I(Tiq)、人種(p = 9. 20X 10ィ)、BMI (p = 4. 70 X 10』和組織學診斷(p = I. 30X10』與EVR顯著相關，而HCV因型(p = 4. 30X 10—27)、年齡(p = 5. 50X 10べ8)、ALT 商(p = 2. IOX 1(T8)、人種(p = 2. IOX 1(T8)、組織學診斷(p =5. 40 X 10』、BMI (p = 7. 20 X I(Te)和 HCV RNA 水平(p = 0. 0022)與 SVR 顯著相關。應注意的是，性別既不與EVR也不與SVR顯著相關，而HCV RNA水平不與SVR顯著相關。全體I型基因型群體中的GWAS結果由於高的血緣關係係數(表示高度的親緣關係)，排除了共計4個分析了基因型的樣品。來自I型基因型患者的數據的分析包括了 627名具有已知的EVR狀態的患者(215名應答者[34.3%]和412名無應答者[65.7%])和516名具有已知的SVR狀態的患者(128名應答者[24. 8% ]和388名無應答者[75. 2% ])。圖I中通過染色體展示了 SVR和EVR的基因組範圍關聯性的結果。在19號染色體的IL-28區域中鑑定出一系列高度顯著的p值。分位值-分位值圖顯示預期的p值和觀察的P值緊密符合，除了與19號染色體相關的p值的ー些大的偏差(圖2)。對SVR和EVR的邏輯回歸分析分別掲示了 12和19個SNP，p < 10_5(表2)。與SVR和EVR分別相關的前6個SNP是相同的，都落入了 19號染色體的IL-28區域內。SVR 和 EVR 的前 2 個 SNP 是 rsl2979860(分別為 p = 1.4X1(T21 和 p = 5.0X10，和 rsl2980275 (分別為 p = 5. 8X 10_18 和 p = 4. 9X 1(T23)。與 SVR 相關的剩餘的 6 個 SNP中(表2)，無一與EVR相關，無一位於19號染色體上，且4個(rs943897、rsl7671102、rs4961441和rsl892723)可能是由於稀有純合子類別中的少數觀察結果(BB < 10名個體)的假相關。在與EVR相關的剩餘的13個SNP中(表2)，無一與SVR相關，僅I個位於19號染色體上，且2個(rsll89800和rs4975629)可能是假相關。 表3中顯示了總群體和自報告的高加索人亞群的任何SVR和EVR模型的p < 10_5的全部SNP的邏輯回歸分析。當在針對rsl2979860的效應進行調整之後重複分析時，無ー標誌物與SVR顯著相關，且僅I個標誌物與EVR顯著相關(rs8099917，p = 0. 0130)。表3中顯示的對IL-28區域中的SNP之間的連鎖不平衡的後續研究表明了ー個具有高度連鎖不平衡的簇(在rsl2979860和rsl2980275之間，r2 = 0. 98)和下遊的包含rsl2980275、rsl2979860、rs8109886 和 rs8099917 的第二個 SNP 簇(圖 3)。圖Ic中顯示了針對rsl2979860調整後的SVR的基因組範圍的結果。在針對rsl2979860調整並選入了額外的無應答者之後的邏輯回歸分析結果掲示了 p < 10_5的另外10個SNP (表4)。令人感興趣的是，最顯著的5個中的3個(rsl0009948、rsl0023606和rs7673763)位於4號染色體上。令人好奇的是，這些僅與SVR相關而不與EVR相關。解釋性分析在高加索人自報告群體中的rsl2979860為了更好地表徵和理解在IL28B之間的相關性，首先在自報告的高加索人群體中的非I型基因型中探索了 rsl2979860之間的相關性。使用與GWAS相同的邏輯回歸模型，以5%名義第一類錯誤，在SVR和rsl2979860C等位基因數量之間觀察到了臨界的顯著相關性(OR= I. 88,95% Cl =
, p = 0.06)。類似地，在 EVR 和 rsl2979860C 等位基因數量之間的顯著相關性(OR = 2. 27,95% Cl [I. 12 ；4. 70]，p = 0. 02)。此外，還2個試驗中分別描述了 rsl2979860之間的相關性。在首次接受治療的群體中，觀察到了 EVR和rsl2979860C等位基因之間的相關性，OR為大約5 (OR = 4. 9895%Cl [2. 35 ；10. 53]，p = 2. 6X10_5)。在全部3個治療層次中都持續觀察到了相關性。在PEG化幹擾素療法失敗的患者群體中，沒有發現與持續性病毒應答的相關性。然而，當比較EVR (N= 185)和無EVR (N= 154)時，與rsl2979860的相關性持續存在(0R=I. 91 [I. 22 ；2. 96],p = 0. 003)。相關性不依賴於基線時的病毒負載、性別、年齡、治療和ALT 商。根據本公開內容，可以在不進行過多的實驗的條件下，製備和執行本文中公開和要求保護的全部組合物和/或方法。雖然本發明的組合物和方法是按照優選的實施方案描述的，但對本領域技術人員顯而易見的是可以在不脫離本發明的主_、範圍和概念範圍內，對本文描述的組合物和/或方法、方法中的步驟或步驟的順序進行改變。對本領域技術人員顯而易見的全部此類相似的取代和修改都被視為落入由所附權利要求限定的本發明的主旨、範圍和概念範圍內。參考文獻:I. Ghany MG，Strader DB，Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management，andtreatment of hepatitis C An update. Hepatology 2009 ；49 :1335-1374.2. Manns MP, McHutchison JG, Gordon SC，Rustgi VK, Shiffman M，ReindollarR，Goodman ZD, Koury K，Ling M，Albrecht JK. 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權利要求
1.預測感染了HCV的人類對象對於基於幹擾素的治療的早期病毒學應答的方法，所述方法包括 提供來自所述人類對象的樣品並鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象中rsl2979860處存在至少ー個C等位基因表示相對於rsl2979860處存在兩個T等位基因的對象的更高的早期病毒學應答的可能性。
2.權利要求I的方法，其中所述對象感染了I型基因型HCV。
3.權利要求2的方法，其中先前沒有用幹擾素治療過所述對象。
4.權利要求3的方法，其中所述基於幹擾素的治療包含選自PEG幹擾素a_2a單ー療法、PEG幹擾素a-2a與利巴韋林,或幹擾素a-2b與利巴韋林的治療。
5.權利要求2的方法，其中所述對象沒有從先前的PEG幹擾素a-2b與利巴韋林的治療中實現早期病毒學應答。
6.權利要求5的方法，其中所述基於幹擾素的治療包含PEG幹擾素a_2a與利巴韋林。
7.預測感染了HCV的人類對象對於基於幹擾素的治療的早期病毒學應答的方法，所述方法包括 提供來自所述人類對象的樣品並鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象中rsl2979860處存在兩個T等位基因表示相對於rsl2979860處存在至少ー個C等位基因的對象的更高的無早期病毒學應答的可能性。
8.權利要求7的方法，其中所述對象感染了I型基因型HCV。
9.權利要求8的方法，其中先前沒有用幹擾素治療過所述對象。
10.權利要求9的方法，其中所述基於幹擾素的治療包含選自PEG幹擾素a_2a單ー療法、PEG幹擾素a -2a與利巴韋林,或幹擾素a -2b與利巴韋林的治療。
11.權利要求8的方法，其中所述對象沒有從先前的PEG幹擾素a-2b與利巴韋林的治療中實現早期病毒學應答。
12.權利要求11的方法，其中所述基於幹擾素的治療包含PEG幹擾素a-2a與利巴韋林。
13.選擇在感染了HCV的人類對象中實現持續的病毒學應答的基於幹擾素的治療的持續時間的方法，其中所述基於幹擾素的治療選自PEG幹擾素a _2a與利巴韋林，PEG幹擾素a -2a與直接作用的抗病毒劑、PEG幹擾素a -2a與利巴,林和直接作用的抗病毒劑,或利巴韋林與直接作用的抗病毒劑(以及內源性幹擾素)，所述方法包括 提供來自所述人類對象的樣品並鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象中rsl2979860處存在至少ー個C等位基因表示相對於rsl2979860處存在兩個T等位基因的對象，所述基於幹擾素的治療在更短的持續時間內實現持續的病毒學應答。
14.權利要求13的方法，其中所述對象感染了I型基因型HCV。
15.權利要求14的方法，其中所述直接作用的抗病毒劑是HCV蛋白酶抑制劑。
16.預測感染了HCV的人類對象對於使用PEG幹擾素a _2a、利巴韋林與直接作用的抗病毒劑治療的應答的方法，所述方法包括 提供來自所述人類對象的樣品並鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象中rsl2979860處存在至少ー個C等位基因表示相對於在rsl2979860處存在兩個T等位基因的對象，所述對象對於所述治療實現早期病毒學應答或持續的病毒學應答的更高的可能性。
17.權利要求16的方法，其中所述對象感染了I型基因型HCV。
18.權利要求17的方法，其中所述直接作用的抗病毒劑是HCV蛋白酶抑制劑。
19.預測感染了HCV的人類對象對於使用PEG幹擾素a-2A、利巴韋林與直接作用的抗病毒劑治療的應答的方法，所述方法包括 提供來自所述人類對象的樣品並鑑定存在於單核苷酸多態性rsl2979860處的核苷酸，其中，所述對象中rsl2979860處存在兩個T等位基因表示相對於rsl2979860處存在至少ー個C等位基因的對象，所述對象對於所述治療無法實現早期病毒學應答或持續的病毒學應答的更高的可能性。
20.權利要求19的方法，其中所述對象感染了I型基因型HCV。
21.權利要求20的方法，其中所述直接作用的抗病毒劑是HCV蛋白酶抑制劑。
全文摘要
本發明基於這樣的發現，即19號染色體上的單核苷酸多態性(SNP)和接受基於幹擾素的治療的C型肝炎病毒(HCV)患者的多樣性群體中的病毒學結果之間的相關性。
文檔編號C12Q1/70GK102869792SQ201180019151
公開日2013年1月9日 申請日期2011年4月11日 優先權日2010年4月13日
發明者T·舒, L·埃塞奧克斯, S·傑默, U·洛帕汀, N·舒爾曼, J·託梅斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司