抗FGF-2抗體Dab-2及其應用的製作方法
2024-01-28 12:00:15
專利名稱：抗FGF-2抗體Dab-2及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗體，特別涉及一種抗FGF-2高特異性的鼠源抗體Dab-2及其應用。
背景技術：
人成纖維細胞生長因子2 (fibroblast growth factor 2, FGF2)又名鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)，是成纖維細胞生長因子家族中的一員，是一種廣泛的有絲分裂原，可通過自分泌或旁分泌的方式促進多種細胞，包括腫瘤細胞的增殖、分化。FGF家族成員主要通過與其高親和力受體的結合向細胞內傳遞信號，發揮其生物學活性。FGF-2是一個多功能分子，分子表面具有多種結合表位，像受體結合位點，肝素結合位點，整合素結合位點等多個表位。針對不同表位的抗體具有不同的功能。而且,針對同一抗原的單克隆抗體具有非常大的多樣性，可變區序列不同，也代表了單抗的親和力的功能的差異。黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤，惡性黑色素瘤仍然是世界範圍內最為難治的腫瘤之一，美國每年有25000個惡性黑素瘤新增病例，死亡約6000人。隨著汙染的日益加劇，我國黑色素瘤患者日益增多。黑色素瘤細胞是FGF-2高分泌的細胞，這種自分泌或旁分泌的FGF-2可直接刺激腫瘤細胞的增值，促進腫瘤血管新生，加速腫瘤細胞的侵潤和轉移。自從1975年單克隆抗體技術建立以來，各種單克隆抗體相繼出現，這些單克隆抗體在疾病的診斷和治療方面發揮重要作用。同時也為難治的腫瘤等疾病帶來希望。目前美國FDA批准用於腫瘤治療的抗體藥物有十多種。其中，2011年首次批准了治療黑色素瘤的單抗藥物Yervoy, Yervoy是針對VEGFR的抗體藥物,開創了抗體藥物治療黑色素瘤的先例。黑色素瘤存在FGF2的高表達，且有證據表面FGF2的活性增加與腫瘤血管新生密切相關，而且FGF-2本身具有促進細胞增殖和轉移的作用。所以，針對FGF-2的抗體能夠有效中和黑色素瘤患者體內高表達的FGF-2，抑制腫瘤血管生成，進而抑制腫瘤的生長。
發明內容
為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在於提供一種抗FGF-2抗體Dab_20本發明的另一目的在於提供所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種抗FGF-2抗體Dab-2，包括重鏈可變區和輕鏈可變區；所述的重鏈可變區的胺基酸序列如下所示QVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEfflGfflDPENGDTVY
APKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCTYDGYFDYffGQGTTLTVSS ；所述的輕鏈可變區的胺基酸序列如下所示DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVYRYGDTYLHWYLQKPGQSPNLLIYKVSNRFS
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPRTFGGGTKLELKRTVAAP ；編碼所述的重鏈可變區的基因序列如下所示CAGGTTCAGCTT CAGCAATCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGTATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTATCTGCAGCTCAGCCGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACCTATGATGGTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA ；編碼所述的輕鏈可變區的基因序列如下所示GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTATACCGTTATGGAGACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAACCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGACTGTGGCTGCACCA ；編碼所述的重鏈可變區的基因由345個鹼基組成，編碼115個胺基酸，可變區含有3個⑶R(互補決定簇)區ADRl編碼5個胺基酸，⑶R2編碼17個胺基酸，⑶R3編碼7個胺基酸。編碼所述的輕鏈可變區的基因由354個鹼基組成，編碼118個胺基酸，可變區含有3個⑶R(互補決定簇)區ADRl編碼16個胺基酸，⑶R2編碼7個胺基酸，⑶R3編碼7個
胺基酸。上述抗FGF-2抗體Dab-2的用途由於抗體的生物活性是由抗體輕鏈和重鏈可變區中的高變區(CDRs)特異性的基因序列決定的，因此可採用基因工程方法，將編碼所述的抗FGF-2抗體Dab-2的基因構建、表達，得到多種形式的小分子基因工程抗體(如Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體(scFv)、納米抗體(Nanobody)、抗體融合蛋白)和IgG全抗體。在原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和真核細胞獲得該抗體基因表達或以此基因為基礎改建後的含有該抗體基因可變區的任何其他基因。該抗FGF-2抗體Dab-2，可在臨床上進行如下應用(I)用於腫瘤的診斷，⑵抑制腫瘤血管新生和抑制腫瘤的生長和轉移，(3)抑制肝、肺、腎纖維化的進程。上述的抗FGF-2抗體Dab-2在製備用於診斷和治療腫瘤(黑色素瘤)以及抑制內臟(如腎、肝或肺等)纖維化的抗體藥物中的應用。一種抗人FGF-2嵌合抗體，是將上述抗FGF-2抗體Dab_2的輕、重鏈可變區分別與人源抗體的恆定區融合得到。—種抗人FGF-2抗體Dab_2嵌合抗體的表達載體,含有編碼所述的抗人FGF-2嵌合抗體的基因序列；所述的抗人FGF-2抗體Dab_2嵌合抗體的表達載體的製備方法，包括以下步驟(I)設計引物①輕鏈的上遊引物(5』 -3』)AAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGATGTTTTGATGACCCAAACTCCA ；
②輕鏈的下遊引物(5』 -3』)GGGGCAGCCTTGGGCTGACTTGGTGCAGCCACAGTCCGTTTCAG ；③輕鏈恆定區上遊引物5』-AGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT-3』④輕鏈恆定區下遊引物5 』-TCTAGAATCATTATGAACAITCTGTAGGGG-3』⑤重鏈的上遊引物5』-GAGCTCACTCCCAGGITCAGCTTCAGCAATC-3』 ；⑥重鏈的下遊引物5』-GGGCCCTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGA-3』 ；(2)輕鏈可變區基因片段的製備以編碼所述的輕鏈可變區的基因序列為模板，使用引物①和引物②擴增輕鏈可變區基因片段；(3)人輕鏈恆定區基因片段的製備以人B淋巴細胞cDNA為模板，使用引物③和引物④擴增得到人輕鏈恆定區基因片段；(4)嵌合抗體輕鏈基因的製備以步驟(2)得到的輕鏈可變區片段和步驟(3)得到的人輕鏈恆定區片段為模板，使用引物①和引物④擴增得到嵌合抗體輕鏈基因；(5)重鏈可變區基因片段的製備以編碼所述的重鏈可變區的基因序列為模板，使用引物⑤和引物⑥擴增重鏈可變區基因片段；(6)抗人FGF-2抗體Dab_2嵌合抗體表達載體的製備將步驟(4)製備得到的嵌合抗體輕鏈基因通過Xba I和HindIII酶切位點克隆入真核表達載體plgG，得到重組載體PlgG-L ;將步驟(5)製備得到的重鏈可變區基因片段通過SacI和ApaI酶切位點克隆入真核表達載體plgG-L，得到抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體表達載體pIgG_Dab_2。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果本發明所述的抗FGF-2抗體Dab-2具有親和力高、特異性高的優點。
圖I是通過ELISA篩選抗bFGF陽性的噬菌體克隆圖。圖2是抗FGF-2抗體Dab_2的特異性檢測結果圖。圖3是抗FGF-2嵌合抗體表達目的蛋白的SDS-PAGE圖；泳道I是分子量標準，泳道2 3是純化樣品。圖4是抗FGF-2嵌合抗體的ELISA結果圖。圖5是抗FGF-2嵌合抗體抑制黑色素瘤細胞增殖效果圖。圖6是抗FGF-2嵌合抗體誘導黑色素瘤的細胞凋亡圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例I(一 )曬菌體抗體庫的篩選首先將重組人bFGF (北京啟維益成公司)用0. 05mol/L、pH8. 7的碳酸鹽緩衝液稀釋至50 100 ii g/mL,用ImL包被免疫管(Immunotube, NUNC公司)，4°C過夜,次日以質量體積比2. 5%的脫脂奶粉加滿免疫管37°C封閉2h，倒去封閉液，加入ImL噬菌體天然抗體庫(約IO13CFU, Enprobiotech公司，貨號EA001)，37°C孵育2h，吸去噬菌體抗體液，以含體積百分比0. 05%吐溫20的PBS(0. 01M,pH7. 2)洗2次(第二輪洗10次，以後洗滌20次以上)，蒸餾水洗滌I次。然後用2種方法回收結合於固相的噬菌體抗體①先加入ImL新鮮XLl-Blue菌(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)，37°C孵育15min後轉入IOmL含20 y g/mLAmp (氨苄青黴素)、10yg/mL Tet(四環素)的SB培養基(每升培養基含細菌培養用胰化蛋白陳309g，酵母提取物209g，19gMoPs,pH7. 0);②再將細菌感染回收後的免疫管用蒸餾水洗滌2次，力口A ImL洗脫液(0. ImL HCl、以甘氨酸調至pH = 2. 2後加入BSA至質量體積比為0. I % )，於37°〇靜置151^11，進行 洗脫回收，將洗脫液吸出後，立即加入40111 2mol/L Tris溶液中和，再加入 IOmL XLl-Blue 細胞(0D600 = 0. 8) 37°C靜置 15min,接著加入 IOmL 含 20 y g/mLAmp、10 u g/mL Tet的SB培養基。從2次回收的菌液分別取出適量鋪盤測定CFU，其餘細菌37°C培養3h，擴大體積到50mL，加入I. 7 X IO12PFU輔助病毒VCSM13 (廣州英韋創津生物科技有限公司)，30°C振蕩培養過夜。次日回收上清，常規PEG沉澱，所得的次級噬菌體抗體庫可進行下一輪的篩選。按相同方法進行3輪淘選，得到陽性噬菌體Fab抗體克隆。( 二)噬菌體抗體的製備及抗bFGF特異性的檢測從篩選第4輪的培養盤隨機挑取集落在含有50 u g/mL Amp的2YT培養液中37°C過夜培養，第二天取30 ill細菌到ImL LB培養基中，37°C培養至對數生長期，加入輔助病毒VCSMl3，30°C培養過夜，收取上清。按以下程序進行ELISA檢測將抗原(即bFGF)稀釋至10 u g/mL,用50 ill稀釋後的抗原包被ELISA板，2h後棄去孔內液體，用質量體積比3%脫脂奶-PBS溶液(即用0. 01M、pH7. 2的PBS配製的脫脂奶溶液)封閉後加入噬菌體抗體液(即第三輪篩選獲得的陽性噬菌體)，37°C孵育Ih，用質量體積比0. 05% Tween20-PBS溶液(即用0. OlM pH7. 2的PBS配製)洗滌3次，加入HRP-抗M13抗體(Promega公司)進行反應，洗滌後加入TMB底物顯色，讀取A450值。篩選到的具有與bFGF特異性結合的噬菌體抗體克隆的ELISA結果如圖I所示，圖I的結果表明，通過三輪噬菌體展示篩選，篩選到了抗bFGF陽性的噬菌體Fab抗體克隆，結果顯示，Dan-2, Dab-Il和Dab_E3均具有很好的bFGF親和力，其中Dan-2抗體的bFGF親和性最高。將篩選獲得的親和力最高的抗bFGF陽性噬菌體抗體克隆Dan-2送上海生物工程有限公司測序，得到如下序列編碼所述的重鏈可變區的基因序列如下所示CAGGTTCAGCTTCAGCAATCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGTATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTATCTGCAGCTCAGCCGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACCTATGATGGTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA ；編碼所述的輕鏈可變區的基因序列如下所示GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTATACCGTTATGGAGACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAACCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATdu JJ B il ^ Luw du d -T7 HMU C個籲,4—HMU Uf U8 al, ^ du JJ B il4:v*lJ^^*tv :M 5 i V r、0^$0 l-xxxcqEOod( fevf/ 9 §p^-s^$0 )聆盤釤菡農(啶<<S133X) IOds 蔣(啶<<S133X) I onx^lr。I-XXXCqEOOd 拉躺遛餾鍘鏨迆瑚(efl 平惡容 I、0^ ^ Iofi盤迆瑚VNaU^頰豳-KE^il餾蔣豳-K拉躺趙回釧辰洱趙回蓉CR4Sl^lr 豳-KE 稍遛餾 sMt:s,mJ (I)酵電蔣拉躺 xxxcqsood(fcvf/9R4slazc^}fl 平惡容銫)R4 SI 釤「面農(啶<<T3J133X) I Mqx 蔣(啶<<T3J133X) I 0 - S〔 §0〕
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X 6/9 Pf-ZHM V^COZZTSOT Zo司)0. 5 il L，T4連接酶緩衝液2. 5 il L，補水至25 u L。16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5a (Invitrogen公司)感受態細胞。(4)可溶性表達將上述連接反應成功構建的pComb3xTT_Fab可溶性表達載體轉化大腸桿菌HB2151菌株(Promega公司)。挑取陽性克隆進行原核表達，將鑑定正確的克隆接種2mL SB培養基(上海華壹生物科技有限公司)，37°C、200rpm的速度振蕩培養8 9小時，接著將培養得到的ImL菌液接種至50mL含有濃度20 u g/mLAmp的SB培養基振蕩培養至0D600 ^ 0.6，加入IPTG至終濃度lmmol/L，30°C誘導培養2 8小時，誘導表達之後將菌體離心，棄去上清，0. 01M, pH7. 2的PBS重懸菌體，超聲破碎。12000g/min離心之後取上清。 (5)表達產物的ELISA鑑定用0. 05mol/L、pH8. 7的碳酸鹽緩衝液將FGF-2 (北京啟維益成公司)分別稀釋重組VEGF(Sigma公司)、重組VEGF(Sigma公司)、重組白介素-2(IL_2,Sigma公司)和牛血清白蛋白(BSA, Sigma公司)成1000ng/mL包被液。在96孔板中分別加入100 u L/孔的重組人FGF-2、IOOng/孔重組VEGF、IOOng/孔IL-2和BSA包被液，4°C包被過夜。用質量體積比5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉30分鐘，加入100 ii L PBS (廣州展晨生物科技有限公司GMS)洗滌2次，每次5分鐘。加入上述製備得到的抗FGF-2Fab抗體的表達上清50 u L，37°C孵育I小時，PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入HRP-羊抗鼠IgG酶標二抗(按體積比為I : 5000稀釋，Promega公司)。洗滌5次，每次5分鐘，加入TMB底物顯色，讀取A450值。結果顯示，表達的抗FGF-2Fab抗體僅能與FGF-2結合，呈現較高的親和力，二對其他的VEGF、11-2、BSA等均沒有反應。表面其能夠特異性的結合FGF-2。(三)抗人FGF-2抗體Dab-2輕、重鏈可變區基因及其編碼的多肽產物在製備用於診斷或治療腫瘤中的應用以本發明所述的抗體Dab-2輕重鏈可變區基因出發，可以構建並表達多種形式的蛋白，如用來構建嵌合抗體。用所述抗Dab-2的抗體可變區與人抗體的恆定區通過基因拼接(嵌合PCR)構建成人-鼠嵌合抗體，從抗人FGF-2抗體Dab-2出發構建的人-鼠嵌合抗體抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的作用見圖。由於其完整保留了鼠源抗體的親和力，同時又能夠降低免疫原性，不容易在患者體內產生人抗鼠抗體(HAMA反應)，在腫瘤治療中將能發揮良好的治療效果。以本發明所述的抗體Dab-2輕、重鏈可變區基因出發，還可以構建人源化抗體針對可變區的人源化改造，包括CDR移植,表面胺基酸殘基修飾，表位導向選擇等。與嵌合抗體相比，人源化抗體主要保留了鼠源抗體可變區中的三個CDR區，其餘的骨架區均更換成人源的胺基酸，從而進一步降低免疫原性。可更好的開發成抗體藥物用於腫瘤等疾病的治療。小分子抗體Fab，主要由重鏈的可變區CHl區以及完整的輕鏈組成；單鏈抗體ScFv，用一個連接肽(Gly4Ser) 3連接重鏈可變區和輕鏈可變區構成；雙鏈抗體Dabody,用一個小連接肽Gly4Ser連接重鏈可變區和輕鏈可變區構成雙鏈抗體,是二價抗體，故親和力比ScFv要高。雙特異性或雙功能抗體，與其他的抗體分子通過構建成雙特異性或雙功能的Diabody或者全抗體來實現。重組蛋白融合蛋白，通過與其他的效應蛋白融合構成抗體融合蛋白等。示例(I)抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體的構建和表達將所獲的的抗FGF-2抗體Dab-2的輕重鏈可變區基因分別與人源抗體的恆定區通過嵌合PCR方法構建成嵌合抗體。具體過程如下①輕鏈的上遊引物(5，-3，)AAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGATGTTTTGATGACCCAAACTCCA ；②輕鏈的下遊引物(5，-3，)GGGGCAGCCTTGGGCTGACTTGGTGCAGCCACAGTCCGTTTCAG ；
③輕鏈恆定區上遊引物5』-AGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT-3』④輕鏈恆定區下遊引物5』-TCTAGAATCATTATGAACATTCTGTAGGGG-3⑤重鏈的上遊引物5』-GAGCTCACTCCCAGGITCAGCTTCAGCAATC-3』 ；⑥重鏈的下遊引物5』 -GGGCCCTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGA-3，；(2)以上述pComb3XTT-Fab-geneIII表達載體和人B淋巴細胞cDNA(為取外周血淋巴細胞，抽總RNA逆轉錄得到)為模板，通過嵌合PCR擴增將鼠源的輕鏈可變區與人源的輕鏈恆定區構建成嵌合輕鏈基因片段。其具體過程是以pC0mb3XTT-Fab-geneIII表達載體為模板，引物①和引物②擴增輕鏈可變區，以人B淋巴細胞cDNA為模板，擴增人輕鏈恆定區。以這兩種PCR產物為模板，引物①和引物④擴展全長的嵌合抗體輕鏈。擴增輕鏈可變區基因片段反應體系和條件為pComb3XTT-Fab-geneIII表達載體I u L, dNTP 混合物(濃度 2mM) 4u L, IOX 緩衝液 5 y L，I y L Blend Taq DNA 聚合酶(2. 5U/V- 1，Promega) 0. 5 u I,引物①和引物②(10 u mol/L)各I y L,添加去離子水至50 u L。PCR反應條件為94°C 4min,50°C 45Sec，72°C lmin，29 個循環，最後 72°C延伸 IOmin0擴增人輕鏈恆定區基因片段反應體系和條件為人B淋巴細胞cDNA為模板3 U L，dNTP 混合物(濃度 2mM) 4u L, IOX 緩衝液 5 y L，I y L Blend Taq DNA 聚合酶(2. 5U/u I,Promega) 0. 5 iil，引物③和引物④(10 u mol/L)各I y L，添加去離子水至50 y L。PCR反應條件為94°C 4min,50°C 40Sec，72°C 45Sec，26 個循環，最後 72°C延伸 IOmin0嵌合PCR擴增完整嵌合抗體輕鏈基因片段應體系和條件為前兩部擴增得到的輕鏈可變區基因片段和人輕鏈恆定區基因片段各I U L為模板，dNTP混合物(濃度2mM) 4 u L，緩衝液51^，1111 Blend Taq DNA 聚合酶(2. 5U/y 1，Promega) 0. 5 y 1，引物①和引物④(10 u mol/L)各I y L，添加去離子水至50 u L。PCR反應條件為-MV 4min, 50°C 50Sec,72°C lmin, 28個循環，最後72°C延伸lOmin。反應產物經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收並純化，得到PCR擴增的嵌合抗體輕鏈基因片段。(3)以引物⑤和引物⑥擴展出鼠源重鏈可變區基因片段，與PlgG(美國Script研究所，該表達載體包含人的重鏈恆定區序列)載體上的人重鏈恆定區連結構成完整的嵌合抗體重鏈基因片段。擴增人重鏈可變區基因片段反應體系和條件為pComb3XTT-Fab-geneIII表達載體 I ii L，dNTP 混合物(濃度 2mM) 4u L,緩衝液 5 y L，I y L Blend Taq DNA 聚合酶(2. 5U/V- 1，Promega) 0. 5 u I,引物①和引物②(10 u mol/L)各I y L,添加去離子水至50 u L。PCR反應條件為94°C 4min，50°C 50Sec，72°C lmin，28個循環，最後72°C延伸lOmin。反應產物經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收並純化，得到PCR擴增的人重鏈可變區基因片段。(4)將嵌合抗體的輕鏈基因片段和重鏈基因片段連接真核表達載體plgG。酶切反應通過Xba I (Takara公司)和HindIII (Takara公司)分別雙酶切(按說明書操作，37°C酶切6小時)pIgG載體和PCR擴增的嵌合抗體輕鏈基因片段片段，通過酶切產物回收試劑盒回收載體片段和輕鏈基因片段片段，T4DNA連接酶(Promega公司，按照說明書操作)連接，構建嵌合抗體載體plgG-L。通過SacI (Takara公司)和ApaI (Takara公司)分別雙酶切(按說明書操作，37°C酶切6小時)載體plgG-L和PCR擴增的嵌合抗體重鏈基因片段，通過酶切產物回收試劑盒回收載體片段和重鏈基因片段片段，T4DNA連接酶(Promega公司，按照說明書操作)連接，構建嵌合抗體載體pIgG_Dab_2。以上構建過程，陽性克隆篩選過程如下連接產物轉化大腸桿菌DH5 a (Promega公司)，挑取單克隆，提取質粒酶切鑑定。將pIgG-Dab-2陽性克隆送上海生物工程公司測序，證實得到目的載體。
(5)嵌合抗體的表達將獲得的重組pIgG-Dab-2嵌合抗體表達載體質粒通過Fugen 6試劑(Roche公司)，按照試劑說明書操作步驟瞬時轉染人胚腎293細胞(中科院上海細胞所)表達。(6)表達上清純化過程收集的細胞表達上清用50%的飽和硫酸銨沉澱，4°C放置過夜後，8500rpm離心20min，棄上清，於沉澱中加入8mL PB (20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl,pH7. 4)使之溶解,經PB透析後，用0. 45 iim濾膜過濾,然後用Ni SepharoseTM 6Fast Flow進行純化先用5倍柱體積的平衡緩衝液(20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl，5mM咪唑，pH7. 4)平衡，然後以250iil/min的流速上樣，上樣後用平衡緩衝液(20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl，5mM咪唑，PH7. 4)衝洗，然後用含有200mmol/L咪唑的PB洗脫雜蛋白，用含有300mmol/L咪唑的PB洗脫目的蛋白。最後將所收集的目的蛋白301 超濾管超濾並用？85(0.01511101/1、？11值7.4)置換，得到抗FGF-2嵌合抗體。用12% SDS-PAGE電泳鑑定純化後的抗FGF-2嵌合抗體，結果(圖3)顯示在分子量70kD和40kD左右出現目的蛋白帶，分別代表了嵌合抗體的完整重鏈和輕鏈。並且純化後抗體的純度達到了 95%以上。(7)用ELISA檢測表達產物的生物學活性將重組人FGF-2用0. 05mol/L，pH值9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋至0. 5 ii g/mL，以IOOii L/孔包被ELISA板，37°C孵育3h後棄去孔內液體，PBST (含體積百分比0. 05% Tween20和0. 015mol/L、pH值7. 4的PBS)洗滌3次。用質量百分比5%脫脂奶-PBST封閉後，以100 u L/孔加入一定濃度步驟(6)製備的抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體，37°C孵育lh，用PBST洗滌3次後，IOOii L/孔加入按體積比I : 5萬稀釋的羊抗人IgGl-Fc-HRP多抗(santa cruz公司)，37°C孵育lh，PBS_T洗滌5次之後加A TMB顯色，測A450值，實驗以PBS為陰性對照。結果如圖4所示，結果表明通過真核表達的抗FGF-2嵌合抗體同樣具有結合FGF-2的活性。嵌合抗體稀釋到60ng時ELISA的光吸收值仍在I. 0以上，表面該嵌合抗體具有較好的FGF-2親和力。(8)檢測該抗FGF-2嵌合抗體的抗腫瘤活性取對數期黑色素瘤B16細胞(中科院上海細胞所)，轉入96孔細胞培養板(1000個細胞/孔)，37°C孵育9h後，加入純化的腹水型FGF2單抗(200 y g/mL)。37°C孵育72h，加入CCK8試劑(CCK8試劑盒，上海生博醫學生物工程科技有限公司，產品貨號SUNBI008008) 10 u L，37°C孵育2h，酶標儀檢測A450值。結果如圖5所示，說明嵌合抗體可有效抑制黑色素瘤細胞的增殖，具有較好的抗腫瘤作用。取對數生長期的黑色素瘤B16細胞，以I X IOVmL密度接種於6孔細胞培養板；8h後加入含體積百分比0. 5%胎牛血清的DMEM培養基配製的各濃度的FGF2嵌合抗體(50 u g/mL, 100 u g/mL, 200 u g/mL)，空白對照組為不含抗體的0. 5%血清濃度的DMEM，陰性對照組為與FGF2單抗相同濃度的非免疫IgG，繼續培養96h後；根據AnnexinV-FITC/PI試劑盒(廣州佰默生物科技有限公司)說明說處理細胞，上流式細胞儀檢測。結果如圖6所示，說明嵌合抗體可有效誘導黑色素瘤細胞凋亡，表明該抗bFGF嵌合抗體能夠通過誘導黑色素瘤發生凋亡，並通過誘發凋亡來抑制黑色素瘤細胞的增殖，從而達到治療腫瘤的作用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方 式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種抗FGF-2抗體Dab-2，其特徵在於所述的抗FGF-2抗體Dab_2的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO. I所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.根據權利要求I所述的抗FGF-2抗體Dab-2，其特徵在於編碼所述的重鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 3所示；編碼所述的輕鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.權利要求I或2所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應用，其特徵在於所述的抗人鹼性成纖維細胞生長因子Dab-2抗體可用於製備診斷和治療腫瘤和/或抑制內臟纖維化的抗體藥物。
4.根據權利要求3所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應用，其特徵在於所述的腫瘤為黑色素瘤。
5.根據權利要求3所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應用，其特徵在於所述的內臟為腎、肝或肺。
6.根據權利要求3所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應用，其特徵在於所述的抗體藥物為將編碼所述的抗FGF-2抗體Dab-2的基因構建、表達，得到的多種形式的小分子基因工程抗體。
7.根據權利要求6所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應用，其特徵在於所述的小分子基因工程抗體為Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體、納米抗體、抗體融合蛋白或IgG全抗體。
8.一種抗人FGF-2嵌合抗體，其特徵在於將權利要求I所述的抗FGF-2抗體Dab-2的重鏈可變區、權利要求I所述的抗FGF-2抗體Dab-2的輕鏈可變區分別與人源抗體的恆定區融合得到抗人FGF-2嵌合抗體。
9.一種抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體的表達載體,其特徵在於含有權利要求2所述的重鏈可變區的基因序列和所述的輕鏈可變區的基因序列。
10.權利要求9所述的抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體的表達載體的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)設計引物 ①輕鏈的上遊引物如SEQID NO. 5所示； ②輕鏈的下遊引物如SEQID NO. 6所示； ③輕鏈恆定區上遊引物如SEQID NO. 7所示； ④輕鏈恆定區下遊引物如SEQID NO. 8所示； ⑤重鏈的上遊引物如SEQID NO. 9所示； ⑥重鏈的下遊引物如SEQID NO. 10所示； (2)輕鏈可變區基因片段的製備以編碼所述的輕鏈可變區的基因序列為模板，使用引物①和引物②擴增輕鏈可變區基因片段； (3)人輕鏈恆定區基因片段的製備以人B淋巴細胞cDNA為模板，使用引物③和引物④擴增得到人輕鏈恆定區基因片段； (4)嵌合抗體輕鏈基因的製備以步驟⑵得到的輕鏈可變區片段和步驟⑶得到的人輕鏈恆定區片段為模板，使用引物①和引物④擴增得到嵌合抗體輕鏈基因； (5)重鏈可變區基因片段的製備以編碼所述的重鏈可變區的基因序列為模板，使用引物⑤和引物⑥擴增重鏈可變區基因片段； (6)抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體表達載體的製備將步驟(4)製備得到的嵌合抗體輕鏈基因通過Xba I和HindIII酶切位點克隆入真核表達載體plgG，得到重組載體plgG-L ；將步驟(5)製備得到的重鏈可變區基因片段通過SacI和ApaI酶切位點克隆入真核表達載體plgG- L,得到抗人FGF-2抗體Dab_2嵌合抗體表達載體pIgG_Dab_2。
全文摘要
本發明公開了一種抗FGF-2抗體Dab-2及其應用。該抗FGF-2抗體Dab-2的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。編碼重鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO.3所示。編碼輕鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO.4所示。該抗FGF-2抗體Dab-2具有高親和力和特異性。將編碼該抗FGF-2抗體Dab-2的基因構建、表達，得到多種形式的小分子基因工程抗體，如Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體、納米抗體、抗體融合蛋白和IgG全抗體等，可用於製備診斷和治療腫瘤和/或抑制內臟纖維化的抗體藥物。
文檔編號G01N33/574GK102617734SQ201110449690
公開日2012年8月1日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者唐勇, 姜浩武, 宋其芳, 王宏, 王盼盼, 鄧寧, 黃建芳 申請人:暨南大學