端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系及其構建方法
2024-04-07 14:39:05
專利名稱：端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系及其構建方法
技術領域：
本發明屬於遺傳工程的細胞修飾領域，涉及一種細胞系及其建立方法和應用，具 體涉及一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系及其構建方法和應用。
背景技術：
正常組織來源的細胞在通常的體外培養條件下可生長、分裂，但經過有限次數的 傳代以後，就會停止增殖，進而衰老和死亡。這樣限制了體外培養細胞的進一步應用。為 了給細胞組織工程提供標準的細胞系，學者們提出了多種建立永生化細胞株的方法。所謂 「永生化」(immortalization)，就是指細胞處於連續的細胞周期而終止其發育進程，使細胞 獲得了無限的增殖能力。建立永生化細胞至少具有以下幾點優勢可以在體外研究軟骨細 胞的分化與生長及增殖之間的關係。永生化的組織細胞可以考慮作為組織細胞工程的細 胞庫或基因治療的靶細胞，前者為組織組織工程提供大量的經過預先處理和優化的組織細 胞，真正做到「組織工程化」;後者則使基因治療應用於組織細胞成為可能，因為正常組織細 胞傳代、增殖有限的缺點妨礙了基因轉染陽性靶細胞的挑選、鑑定及回輸。另外可以作為藥 理或毒理研究的標準細胞，有利於對各項實驗結果進行比較，因為各個實驗室的組織細胞 來源不同，培養方法各異，傳代千差萬別，使得實驗結果難以比較。而採用永生化細胞使得 實驗採用的組織細胞保持統一。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞 系(Infinite Cell Line)，也稱連續細胞系(Continuous Cell Line)。建立永生化細胞系 的方法包括腫瘤病毒、原癌基因、P53突變體等轉染正常組織細胞來構建。腫瘤病毒包括腺 病毒、猴腎細胞病毒、多瘤病毒等。其中猴腎細胞病毒轉染比較常見。猴腎細胞病毒(simian virus 40，SV40)，於60年代初被發現並分離，屬多瘤病毒 科，直徑45nm，為20面體立體對稱結構，殼粒數目為72，DNA分子量為3400kDa，由5，243 個鹼基對組成，它由結構蛋白(VP1、VP2、VP3)和兩種腫瘤抗原(大T和小T抗原)組成。 SV40病毒早期轉錄區轉化基因(A基因)編碼大T和小T抗原。大T抗原(95kDa)98%定 位於細胞核內，具有ATP酶和DNA解旋酶活性，使蛋白質絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化、ADP核 糖基化和己醯基化以及活化宿主細胞核糖體基因、誘導DNA合成、修飾蛋白質合成起始因 子等作用，為細胞轉化啟動所必需，對轉化起決定作用，而且轉化細胞表型的維持必須有大 T抗原的連續表達。小T抗原(20kDa)定位於核內及胞質內，能反式激活RNA多聚酶II和 III基因的啟動子，以及c-myc和c-fos癌基因轉錄，使細胞質肌動蛋白缺失和細胞粘附性 下降，它不是細胞轉化所必需的，但可起加強作用，與大T抗原一道共同維持轉化表型。SV40介導的永生化受多種因素影響，涉及到病毒DNA的整合、端粒酶的活化、生長 抑制因子的失活等多個方面。研究證實，SV40的大T抗原能延長細胞壽命、使細胞永生化的 功能與其滅活三種生長抑制因子_pRB、p53和SEN6的功能有關。①視網膜母細胞瘤基因產 物(product of retinoblastoma gene，pRB)在脫磷酸化時，藉助RB功能區與轉錄因子E2F 形成穩定的複合物(PRB-E2F)，從而抑制E2F的轉錄活性，使細胞不能進入S期。而SV40大T抗原能與脫磷酸化的pRB結合形成複合物，而使E2F游離，促進細胞進入S期。②p53基 因定位於17號染色體(17pl3. 1)，編碼由393個胺基酸組成的核磷蛋白，具有轉錄因子作 用。正常的P53蛋白(野生型)在細胞周期Gl期停滯時，檢查DNA的完整性，並通過其過 度表達使受損細胞進入凋亡，以確保DNA複製的完整性，避免子細胞出現DNA丟失。SV40大 T抗原能與p53結合而滅活其轉錄功能，使細胞避開Gl期停滯，進入增殖。③6號染色體長 臂存在生長抑制因子SEN6，定位於6q27，它與受體蛋白酪氨酸激酶EphB3相作用，SEN6功 能的丟失將會導致永生化。SEN6在複製衰老和永生化中的具體作用尚不清楚，但推測可能 與信號轉導通路有關。近來研究發現永生化上調蛋白-1和永生化上調蛋白_2與SV40介 導的永生化也密切相關。RyooZY等將IMUP-I和IMUP-2基因穩定轉染到NIH/3T3小鼠成纖 維細胞株後，發現IMUP-I和IMUP-2過表達的細胞株生長增殖特性發生改變，喪失停泊依賴 生長特性，在裸鼠體內浸潤生長並形成腫瘤，表明IMUP-I和IMUP-2的異位過表達在轉化基 因表型的獲得、體外致瘤性中發揮重要作用。SV40轉染是目前研究AST永生化使用最多的方法。感染人和齧齒動物細胞後，病 毒DNA隨機整合入宿主基因組，其早期區基因編碼的大T抗原可導致細胞的永生化，這是建 立永生化細胞株最常用的方法。SV40能使幾乎任何一種人類細胞發生永生化，但其永生化 率非常低。人乳頭瘤病毒(HPV) 16型或18型的E6和E7蛋白已經成功的將人的包皮細胞、 角化上皮細胞等永生化。其它如腺病毒ElA基因和EB病毒可分別有效永生化大鼠腎細胞 和人淋巴細胞。細胞內許多原癌基因可編碼生長因子等蛋白質，參與細胞增殖與分化的調控。如 myc、c-Jim、C-ras等通過基因轉染可介導目的細胞的永生化。P53是一種腫瘤抑制因子，而 其突變體則能夠使齧齒動物原代細胞永生化。以上將細胞永生化均是通過把外源性病毒、原癌基因等導入目的細胞，其整合是 隨機的，其表達產物可幹擾細胞內生理途徑，發生非預期的改變，如失去分化特徵和細胞周 期檢查點的控制。同時，通過外源性病毒、原癌基因等轉染獲得的是轉化細胞而非正常細 胞，其表型、核型等可發生改變，如接觸抑制喪失、多倍體改變等。本發明從現有技術中進行 細胞永生化時減少諸如這些表型、核型等的發生改變、基因隨機性整合等問題出發得到本 發明的研究成果。
發明內容
本發明的目的是提供一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系及其構建方法，解決 了現有技術中構建永生化皮膚成纖維細胞時存在的基因隨機性整合、基因產物幹擾細胞內 生理途徑等問題。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案如下一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系，發明目的是提供一種所述的端粒酶永生 化的皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(1)傳代培養皮膚成纖維細胞；(2)用pCIneo-hTERT質粒轉染正常成纖維細胞；(3)篩選穩定轉染的pCIneo-hTERT質粒的人成纖維細胞陽性克隆並擴大培養。優選的，所述步驟(1)中傳代培養的皮膚成纖維細胞是對人體皮膚採用植塊法進行分離皮膚成纖維細胞。優選的，所述步驟(3)中篩選陽性克隆是採用G418藥物進行篩選。優選的，所述步驟(3)中篩選是在轉染24小時後進行。優選的，所述開始篩選時採用的G418藥物的濃度為400μ g/ml，挑單後維持濃度 為 200 μ g/ml。優選的，所述方法還包括對穩定轉染的pCIneo-hTERT質粒的人成纖維細胞陽性 克隆的檢測步驟。優選的，所述的檢測方法是通過RT-PCR法來進行的；其使用的逆轉錄反應合成 cDNA hTERT上下遊引物為上遊引物5'CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3，；下遊引物5，GGATGAAGCGGAGTCTGGA3，；PCR 反應條件94°C預變性 2min ；PCR循環94°C 30s，53°C 45s, 72°C lmin，共 30 個 循環，最後72°C延伸IOmin ；PCR產物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。優選的，所述檢測方法中採用的內參照GAPDH上下遊引物為上遊引物5，ACCACAGTCCATGCCATCAC3，；下遊引物5，TCCACCACCCTGTTGCTGTA3，。本發明的又一目的在於提供一種所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系在用 作人類皮膚疾病研究和治療相關疾病的藥物中的應用。本發明人經長期研究發現，細胞缺乏端粒酶導致分裂過程中端粒長度不斷丟失是 細胞衰老的主要機制之一，而導入外源性人端粒酶逆轉錄酶(humantelomerase reverse transcriptase, hTERT)基因可以誘導細胞內端粒酶的活性，從而使端粒長度保持穩定，延 長細胞生存期和增強細胞增殖能力。而且最重要的是，它類似於胚胎幹細胞內存在的生理 途徑，因此，hTERT激活端粒酶而誘導細胞永生化是一種接近生理過程的途徑，這樣就為獲 得理想的組織工程皮種子細胞提供了有力保障。本發明皮膚成纖維細胞永生化的方法，是選取人端粒酶催化亞單位hTERT對皮膚 成纖維細胞進行轉染，最終得到與正常成纖維細胞生物學行為接近、性狀相對穩定的永生 化皮膚成纖維細胞系。該細胞系不僅可以成為細胞組織工程皮膚的種子細胞來源之一，同 時是一種延長體外培養細胞壽命並防止衰老的有效手段。本發明的構建方法通過將hTERT的真核表達質粒pCIneo-hTERT轉染原代培養的 正常人皮膚成纖維細胞，轉染後經篩選藥物G418進行篩選兩周後，挑取陽性抗性克隆，用 有限稀釋法將細胞克隆移至96孔板，待單個細胞克隆長大後擴大培養，用多種指標檢測獲 得的穩定轉染細胞株的永生化情況得到比較滿意的結果。與現有技術中已有技術相比，本發明的有益效果在於本發明技術方案得到的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞係為一種安全、接近生理 過程的標準的種子細胞；本發明技術方案中構建端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的方法 是一種接近生理過程的途徑，通過hTERT激活端粒酶而誘導細胞永生化，為細胞組織工程 提供一種安全、接近生理過程的標準的種子細胞，解決了目前技術中存在的基因隨機性整 合、基因產物幹擾細胞內生理途徑等問題。
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖1為本發明實施例組織塊法原代培養的人成纖維細胞；其中普通光鏡X 100 ；圖2為本發明實施例穩定轉染pCIneo-hTERT質粒的人成纖維細胞圖；圖3為本發明實施例端粒酶活性檢測圖；其中1為Hela細胞端粒酶活性檢測(陽 性對照)；2為第5代穩定轉染pCIneo-hTERT質粒的人成纖維細胞端粒酶活性檢測；3為第 5代未轉染人成纖維細胞端粒酶活性檢測；圖4為本發明實施例瓊脂糖凝膠電泳檢測穩定轉染細胞中hTERT表達；其中M為 DL2000 Marker，分子量從小到大依次為100，250，500，750，1000，2000bp ；圖5為本發明實施例第80代經轉染的成纖維細胞；圖6為本發明實施例第40代未經轉染的成纖維細胞；圖7為本發明實施例第80代經轉染的成纖維細胞核型分析；圖8為本發明實施例Hela細胞的軟瓊脂培養(陽性對照)。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用於說明 本發明而不限於限制本發明的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體廠家的條件做 進一步調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建人皮膚成纖維細胞的組織塊培養手術切取患者腹部皮膚(其它手術部位皮膚也可滿足條件)，置於含有10萬u/ L氨苄青黴素和100mg/L硫酸鏈黴素的含0. 05%吐溫-20的pH7. 4的磷酸鹽緩衝液(PBS) 中，反覆漂洗3-5次後，直到漂洗液清亮透明為止。剪棄表皮，脂肪和結締組織後，再將皮膚 儘量剪碎，越小越好，用PBS衝洗剪刀上的組織塊。用彎頭吸管將組織塊在瓶底均勻擺置， 每小塊間距5mm左右。組織塊放置好後，向瓶內滴入少許培養液，將培養瓶慢慢平放入37°C 培養箱中，靜止培養，動作要輕柔以免影響細胞貼壁。前3天內儘量減少觀察次數或不做觀 察，以免影響組織貼壁以至培養失敗。約一周左右組織塊周圍有成纖維細胞游離出，初次傳 代前不必勤換培養液，有代謝產物嚴重時才需更換培養液。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞 生長狀況。直到成纖維細胞長滿瓶底並能順利穿代者視為培養成功；圖1為組織塊法原代 培養的人成纖維細胞。正常人成纖維細胞轉染pCIneo-hTERT質粒和穩定轉染陽性克隆的挑選擴增並提取pCIneo-hTERT質粒。將培養的第3代人皮膚成纖維細胞接種入6孔 板，按Lipofectamine 2000說明書進行基因轉染。轉染後24小時以1 10比例進行傳 代，48小時後加入400 μ g/ml篩選藥物G418進行篩選。待對照組未轉染細胞全部死亡後， 將濃度減半為200 μ g/ml繼續維持篩選，直至出現陽性細胞克隆，用有限稀釋法將細胞克 隆移至96孔板，待單個細胞克隆長大後擴大培養。實施例2穩定轉染的成纖維細胞系的檢測和確證研究穩定轉染的成纖維細胞端粒酶活性檢測檢測顯示經轉染後成纖維細胞能穩定地表達端粒酶活性，反映端粒酶陽性的以6鹼基間距逐級遞增的特徵性梯度條帶，最小鹼基片段為50bp、其次為56、62及68片段。細 胞傳代超過80代後，檢測端粒酶活性，同樣可見特徵性條帶出現。RT-PCR檢測穩定轉染的成纖維細胞hTERT的表達提取第5代未轉染人皮膚成纖維細胞、第5代轉染人皮膚成纖維細胞和HeLa細 胞的總RNA，HeLa細胞為陽性對照，逆轉錄反應合成cDNA hTERT上遊引物5' CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3，，下遊引物5，GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3，，PCR 產物大小為 145bp。內參照 GAPDH 上遊引物5，ACCACAGTCCATGCCATCAC 3，，下遊引物5，TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3，， PCR 產物 452bp。PCR 反應條件94°C預變性 2min ；PCR 循環94°C 30s, 53°C 45s, 72°C lmin, 共30個循環，最後72°C延伸IOmin。PCR產物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。細胞形態觀察未轉染的細胞隨傳代次數增加，細胞由長梭形變為扁平狀，胞漿內出現較多顆粒。 而轉染細胞則一直呈長梭形，胞漿內很少見顆粒。細胞倍增時間測定經轉染的細胞，傳代次數已經超過80代，細胞的倍增時間約為3天，未出現細胞生 長停滯現象。而未轉染細胞在培養至30代左右即出現細胞生長停滯，細胞傳代時間明顯延 長，約2周傳代一次。細胞衰老檢測半乳糖甘酶活性檢測未經轉染的成纖維細胞傳代至第25代就開始出現 β -半乳糖苷酶陽性細胞，至30 40代，陽性細胞數達80% 90%，而轉染細胞傳代至80 代後很少有半乳糖苷酶陽性細胞。染色體核型分析取處於對數生長期的第30代轉染毛乳頭細胞，加入終濃度為0. 4g/ml的秋水仙 素，37培養4h，收集細胞，經低滲、固定、製片後行Giemsa染色，油鏡觀察。現轉染細胞已傳 代至80代，其細胞核型顯示，共23對染色體，仍為2倍體細胞，染色體結構形態正常，未見 斷裂、異位和缺失等。軟瓊脂克隆形成實驗採用軟瓊脂克隆形成實驗觀察細胞的懸浮生長能力。首先在24孔板中製備0. 5% 瓊脂培養基的底層凝膠，取處於對數生長期的第3代未轉染毛乳頭細胞、第30代轉染毛乳 頭細胞和HeLa細胞，製備單細胞懸液，按照500個/孔的密度製備0. 3 %瓊脂培養基作為上 層凝膠，培養2 3周，倒置顯微鏡下觀察細胞克隆形成情況。未轉染細胞和轉染培養90代細胞經3周培養後均不能在軟瓊脂內生長，而Hela 細胞(人宮頸癌細胞株)則可經3周培養後在軟瓊脂內生長形成較大的細胞克隆。上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人是 能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精 神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。序列表 柯明哲端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建方法
7[00694[00701[007120[0072DNA[0073[00741[0075CGGAAGAGTG[00762[007719[0078DNA[0079[00802[0081GGATGAAGCG[00823[008320[0084DNA[0085[00863[0087ACCACAGTCC[00884[008920[0090DNA[0091[00924[0093TCCACCACCC
說明書
6/6頁
TCTGGAGCAA
20
GAGTCTGGA
19
ATGCCATCAC
20
TGTTGCTGTA
20
權利要求
一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系及其構建方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(1)傳代培養皮膚成纖維細胞；(2)用pCIneo hTERT質粒轉染正常成纖維細胞；(3)篩選穩定轉染的pCIneo hTERT質粒的人成纖維細胞陽性克隆並擴大培養。
2.根據權利要求1所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特徵在於 所述步驟(1)中傳代培養的皮膚成纖維細胞是對人體皮膚採用植塊法進行分離皮膚成纖 維細胞。
3.根據權利要求1所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特徵在於 所述步驟(3)中篩選陽性克隆是採用G418藥物進行篩選。
4.根據權利要求3所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特徵在於 所述步驟(3)中篩選是在轉染24小時後進行。
5.根據權利要求3所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特徵在於 所述開始篩選時採用的G418藥物的濃度為400 μ g/ml，挑單後維持濃度為200μ g/ml。
6.根據權利要求1所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特徵在於 所述方法還包括對穩定轉染的pCIneo-hTERT質粒的人成纖維細胞陽性克隆的檢測步驟。
7.根據權利要求6所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特徵在於 所述的檢測方法是通過RT-PCR法來進行的；其使用的逆轉錄反應合成cDNA hTERT上下遊 引物為上遊引物5' CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3』 ；下遊引物5，GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3，；PCR 反應條件94°C預變性 2min ；PCR 循環94°C 30s, 53°C 45s, 72°C lmin，共 30 個循 環，最後72°C延伸IOmin ；PCR產物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
8.根據權利要求6所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特徵在於 所述檢測方法中採用的內參照GAPDH上下遊引物為上遊引物5' ACCACAGTCCATGCCATCAC 3'；下遊引物5』 TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3，。
9.一種權利要求1所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系在用作人類皮膚疾病研 究和治療相關疾病的藥物中的應用。全文摘要
本發明公開了一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系及其構建方法，屬於遺傳工程的細胞修飾領域，該方法包括傳代培養皮膚成纖維細胞；用pCIneo-hTERT質粒轉染正常成纖維細胞；篩選穩定轉染的pCIneo-hTERT質粒的人成纖維細胞陽性克隆並擴大培養。該方法為細胞組織工程提供一種安全、接近生理過程的標準的種子細胞，解決了現有方法中基因隨機性整合、基因產物幹擾細胞內生理途徑等問題。
文檔編號C12N5/10GK101921729SQ20101010927
公開日2010年12月22日 申請日期2010年1月26日 優先權日2009年4月8日
發明者柯明哲 申請人:柯明哲