用於增強與人類疾病相關的突變蛋白質的降解的物質與方法

2023-09-14 18:14:20 1

專利名稱：用於增強與人類疾病相關的突變蛋白質的降解的物質與方法
技術領域：
本發明用於增強與人類疾病相關的突變蛋白質的降解的物質與方法。
背景技術：
蛋白質必須摺疊為其正確的三維構象以達成其生物功能。多肽的 本質構象是被編碼於一級胺基酸序列，而且即使胺基酸序列中的單一 突變可損及蛋白質達成其正常構象的能力。當蛋白質無法正確地摺疊 時，生物的及臨床的效果可被摧毀。蛋白質凝集與摺疊為許多人類疾 病的主要出力者，例如常染色體顯性遺傳視網膜色素變性(autosomal dominant retinitis pigmentosa)、阿耳茨海默氏病、a 1-抗胰蛋白 酶缺乏症、囊胞性纖維症、腎性尿崩症與病原素媒介(prion-mediated) 的感染。其它的蛋白質摺疊失調中，例如常染色體顯性遺傳視網膜色 素變性、帕金森氏病與亨延頓氏舞蹈症、由於錯誤摺疊蛋白質的細胞 毒性效果而有病理結果。
錯誤摺疊蛋白質被ER質量調控系統辨識且作為藉由蛋白酶體的降 解所標的。除了蛋白酶體途徑以外，自體吞噬為蛋白質降解的另一主要細胞機制。雖然自體吞噬可被各種細胞內與細胞外的壓力所刺激， 包括胺基酸匱乏、錯誤摺疊蛋白質的凝集與損傷胞器的累積，自體吞 噬顯現為大致非選擇性的步驟。與亨延頓氏舞蹈症有關的傾向於凝集 物的多麩氨酸與多丙氨酸的擴張蛋白質藉由自體吞噬降解，而且於亨 延頓氏舞蹈症的蒼蠅與老鼠的模式中，自體吞噬的抑制減低突變亨延 頓氏舞蹈症蛋白質的毒性。自體吞噬亦已顯示對累積於ER之蛋白質清 除的貢獻。如果增加自體吞噬的方法可行，其可能增強錯誤摺疊蛋白 質的清除，而且清除與錯誤摺疊蛋白質的累積相關的細胞毒性。目前 急切需要用於緩和錯誤摺疊蛋白質的細胞毒性與預防神經功能的方 法。

發明內容
本發明特徵的組合物與方法有用於治療或預防由增強的錯誤摺疊
蛋白質的降解所引起的蛋白質構象紊亂症(PCD)。
於一態樣中， 一般而言，本發明提供用於個體預防或治療蛋白質
構象紊亂症(PCD)的方法，所述的方法包括對所述的個體(例如人類 患者)給藥有效量的增強自體吞噬蛋白質降解的化合物。於一具體例 中，所述的化合物(例如雷帕黴素、法尼基轉移酶抑制劑、FTI-277或 其類似物)抑制哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)或抑制腦中富集的Ras 同源體(Rheb)。於另一具體例中，所述PCD選自下述所成組群的一者 或多者al-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纖維症、亨延頓氏舞蹈症、 帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、癌症及庫賈氏症。於又 一具體例中，所述PCD為眼睛的PCD且選自下述所成組群的一者或多 者視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性(例如溼性或乾性)、青光 眼、角膜營養不良、視網膜劈裂症、斯塔爾加特病、常染色體顯性遺 傳脈絡膜小疣及貝斯特氏黃斑營養不良。於其它具體例中，所述的方 法進一步包括對個體(例如人類患者)給藥11-順式-視黃醇、9-順式_ 視黃醇或11-順式-視黃醇的7-環鎖異構物。
於另一態樣中，本發明提供用於個體(例如人類患者)預防或治療 眼的蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，所述的方法包括對所述的個體給 藥有效量的增強自體吞噬蛋白質降解的化合物。於另一態樣中，本發明提供用於個體(例如人類患者)預防或治療 視網膜色素變性或黃斑變性的方法，所述的方法包括對所述的個體給 藥增強自體吞噬蛋白質降解的化合物；與給藥11-順式-視黃醇或9-順 式-視黃醇，其中所述的11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與化合物對 所述個體為同時或彼此於14日內給藥足量以治療或預防視網膜色素變 性或黃斑變性。
於另一態樣中，本發明提供用於個體(例如人類患者)預防或治療 蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，其中所述PCD選自下述所成組群的一 者或多者a1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纖維症、亨延頓氏舞蹈症、
帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、癌症及庫賈氏症，所述 的方法包括對所述的個體給藥增強自體吞噬的化合物足量以治療或預
防個體的PCD。於一具體例中，本發明進一歩包括鑑定患者為具有PCD
的歩驟。於又一具體例中，本發明進一步包括測量細胞中錯誤摺疊蛋 白質、自體吞噬標記或自體吞噬液泡的濃度或表達。於一具體例中，
所述PCD為囊胞性纖維症且所述的方法進一步包括給藥選自下述所成 組群的任選一種或多種藥劑:抗生素、維生素A、 D、 E及K補充物、 沙丁氨醇支氣管擴張劑、脫氧核糖核酸酶及依普洛芬。於又一具體例 中，所述PCD為亨延頓氏舞蹈症且所述的方法進一步包括給藥選自下 述所成組群的任選一種或多種藥劑氟呱丁苯、吩噻嗪、利血平、丁
苯那嗪、金剛氨及輔酶QIO。於又另一具體例中，所述PCD為帕金森氏 病且所述的方法進一歩包括給藥選自下述所成組群的任選一種或多種
藥劑左旋多巴、金剛氨、甲磺酸溴隱亭、培高利特、阿樸嗎啡、節
絲肼、麥角乙脲、美舒麥角、麥角乙脲、麥角腈、美金氨、麥角苄酯、 吡貝地爾、對羥基苯乙氨、酪氨酸、苯丙氨酸、馬來酸甲磺酸溴隱亭、 馬來酸培高利特、抗組織氨、抗抑鬱劑及單氨氧化酶抑制劑。於又另
一具體例中，所述PCD為阿耳茨海默氏病且所述的方法進一步包括給
藥選自下述所成組群的任選一種或多種藥劑多萘哌齊、利凡斯的明、 加蘭他敏及他可林。於又另一具體例中，所述PCD為腎性尿崩症且所 述的方法進一步包括給藥選自下述所成組群的任選一種或多種藥劑 氯噻嗪/鹽酸氯噻嗪、阿米洛利及吲哚美辛。於又另一具體例中，所述 的方法進一步包括給藥選自下述所成組群的任選一種或多種藥劑醋酸阿比特龍、六甲蜜氨、脫水長春鹼、奧瑞斯坦丁、貝沙羅汀、必卡
他氨、BMS184476、 2， 3， 4， 5， 6-五氟-N-(3-氟_4-甲氧基苯基)苯磺醯氨、 博來黴素、N，N-二甲基-L-纈氨醯基-L-纈氨醯基-N-甲基-L-纈氨醯基 -N-脯醯氨基-1-L-脯氨酸-第三丁基醯氨、惡病質素、西馬多丁、苯丁 酸氮芥、環磷醯氨、3' ，4' -二脫氫-4， _脫氧-8， - noi'vin-長春花 鹼(caleukoblastine)、多西賽他、多西泰素、環磷醯氨、卡鉬、卡莫 司汀(BCNU)、順鉑、念珠藻環肽、阿糖胞苷、達卡巴嗪(DTIC)、更生 黴素、柔紅黴素、海兔毒素、多柔比星(阿黴素)、依託泊甙、5-氟尿 嘧啶、非那留氨、氟他氨、羥基脲及羥基脲紫杉垸、異環磷醯氨、利 阿唑、氯尼達明、洛莫司汀(CCNU)、雙氯乙基甲氨(氮芥)、美法侖、 羥乙基磺酸米布爾、利索新、司替尼、鏈脲黴素、絲裂黴素、甲氨蝶 呤、尼魯米特、奧那司酮、太平洋紫杉醇、潑尼莫司汀、丙卡巴肼、 RPR109881、磷酸司特目斯汀、黛莫芬、太索內明、紫杉醇、維甲酸、 長春花鹼、長春新鹼、硫酸長春地辛及維氟明。
於另一態樣中，本發明提供增強細胞中(例如眼部細胞、神經元、 上皮細胞)錯誤摺疊蛋白質的降解的方法，所述方法包括使細胞接觸有 效量的增強自體吞噬的蛋白質。於一具體例中，本方法進一步包括測 量細胞中(例如哺乳動物細胞，如人類細胞，活體外或活體內)錯誤折 疊蛋白質、自體吞噬標記或自體吞噬液泡的濃度或表達。於又另一具 體例中，所述的方法進一步包括使所述的眼部細胞接觸ll-順式-視黃 醇、9_順式-視黃醇或ll-順式-視黃醇的7-環鎖異構物。於又另一具 體例中，所述細胞包括形成凝集物或纖維的突變蛋白質(視蛋白、 myocilin蛋白、脂褐質蛋白、P-H3蛋白)。
於又另一態樣中，本發明提供用於治療PCD的醫藥組合物，包括 於醫藥可接受的賦型劑中的mT0R抑制劑或其類似物。
於又另一態樣中，本發明提供用於治療眼部PCD的醫藥組合物， 包括於醫藥可接受的賦型劑中的有效量的增強自體吞噬的化合物。
於又另一態樣中，本發明提供用於治療視網膜色素變性或年齡相 關性黃斑變性的醫藥組合物，包括於醫藥可接受的賦型劑中的有效量 的11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇以及有效量的自體吞噬抑制劑。
於又另一態樣中，本發明提供用於治療眼部PCD的試劑盒，所述試劑盒包括有效量的11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇以及有效量的 雷帕黴素或其類似物。
於又另一態樣中，本發明提供用於治療視網膜色素變性或年齡相 關性黃斑變性的試劑盒，所述試劑盒包括有效量的11-順式-視黃醇或
9-順式-視黃醇以及有效量的雷帕黴素或其類似物。
於又另一態樣中，本發明提供鑑定有用於治療PCD個體(例如人類 患者)的化合物的方法，所述方法包括於活體外表達錯誤摺疊蛋白質的 細胞接觸候選化合物；以及相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬 的增加，其中於經接觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患 有PCD的個體。
於又另一態樣中，本發明提供鑑定有用於治療患有視網膜色素變 性或年齡相關性黃斑變性個體(例如人類患者)的化合物的方法，所述 方法包括於活體外表達錯誤摺疊蛋白質的細胞接觸11-順式-視黃醇 (11-順式-視黃醇的7-環鎖異構物)或9-順式-視黃醇，與候選化合物； 以及相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接觸 細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患有視網膜色素變性的個 體。 '
於又另一態樣中，本發明提供鑑定有用於治療患有囊胞性纖維症 個體(例如人類患者)的化合物的方法，所述方法包括於活體外表達錯 誤摺疊蛋白質的細胞接觸候選化合物；以及相對於對照細胞決定所述 細胞中自體吞噬的增加，其中於經接觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合 物有用於治療患有囊胞性纖維症的個體。於一具體例中，所述錯誤折 疊蛋白質包括突變。於另一具體例中，所述錯誤摺疊蛋白質為視蛋白， 例如包括P23H突變的視蛋白。於又另一具體例中，自體吞噬增強為通 過監控蛋白濃度而測定；通過由監控自體吞噬標記的表達；或通過監 控自體吞噬液泡的數目。
於又另一態樣中，本發明提供用於個體(例如人類患者)預防或治 療蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，所述的方法包括對所述的個體給藥 有效量的增強雷帕黴素或FTI-277生物活性的化合物。於一具體例中， 所述化合物與雷帕黴素或其類似物合併給藥，或所述化合物與FTI-277 或其類似物合併給藥。於又另一具體例中，所述PCD選自下述所成組群的任何一者或多者al-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纖維症、亨延 頓氏舞蹈症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、癌症及庫 賈氏症。於另一具體例中，所述PCD為眼睛的PCD且選自下述所成組 群視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、青光眼、角膜營養不良、 視網膜劈裂症、斯塔爾加特病、常染色體顯性遺傳脈絡膜小疣及貝斯 特氏黃斑營養不良。於另一具體例中，所述方法進一步包括對個體給
藥11-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇或ll-順式-視黃醇的7-環鎖異構物。
於又另一態樣中，本發明提供用於個體(例如人類患者)預防或治 療視網膜色素變性的方法，所述的方法包括對所述的個體給藥雷帕黴
素或FTI-277和增強雷帕黴素或FTI-277的生物活性的化合物。於一 具體例中，本發明進一步包括對所述體給藥11-順式-視黃醇或9-順式 -視黃醇，其中所述的11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與化合物對所 述體為同時或彼此於14日內給藥足量以治療或預防個體的視網膜色素 變性。
於又另一態樣中，本發明提供用於個體(例如人類患者)預防或治 療蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，所述的方法包括合併給藥雷帕黴素 或FTI-277其類似物與增強雷帕黴素或FTI-277的生物活性的化合物， 其中所述雷帕黴素或FTI-277及化合物各給藥足量以治療或預防個體 的PCD。
於又另一態樣中，本發明提供用於增強細胞中錯誤摺疊蛋白質降 解的方法，所述的方法包括使細胞(例如眼部細胞、神經細胞、上皮細 胞)接觸有效量的雷帕黴素、FTI-277或其類似物與增強雷帕黴素或 FTI-277的生物活性的化合物，其中所述雷帕黴素或FTI-277及化合物 各給藥足量以增強該蛋白的降解。於一具體例中，所述方法進一步包 括使細胞接觸11-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇或11-順式-視黃醇的 7-環鎖異構物。
於又另一態樣中，本發明提供用於治療眼部PCD的醫藥組合物， 包括於醫藥可接受賦形劑中的雷帕黴素、FTI-277或其類似物與增強雷 帕黴素或FTI-277的生物活性的化合物，其中所述雷帕黴素或FTI-277 及化合物各呈現足量以治療或預防個體(例如人類患者)的PCD。於又另一態樣中，本發明提供鑑定有用於治療患有PCD的個體(例 如人類患者)的化合物的方法，所述方法包括在自體吞噬增強劑的存在 或不存在下，使活體外表達錯誤摺疊蛋白質的細胞接觸候選化合物； 以及相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接觸 細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患有PCD的個體。
於又另一態樣中，本發明提供鑑定有用於治療患有視網膜色素變 性的個體(例如人類患者)的化合物的方法，所述方法包括使活體外表 達錯誤摺疊蛋白質的細胞接觸ll-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與雷 帕黴素或FTI-277，與候選化合物；以及相對於對照細胞決定所述細胞
中自體吞噬的增加，其中於經接觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有 用於治療患有視網膜色素變性的個體。
於又另一態樣中，本發明提供鑑定有用於治療患有囊胞性纖維症
的個體的化合物的方法，所述方法包括使活體外表達錯誤摺疊CFTR蛋 白的細胞接觸候選化合物與雷帕黴素或FTI-277;以及相對於對照細胞 決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接觸細胞自體吞噬的增加 鑑定化合物有用於治療患有囊胞性纖維症的個體。
於上述任何態樣的各種具體例中，所述PCD選自下述所成組群的 任何一者或多者al-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纖維症、亨延頓氏 舞蹈症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、癌症及庫賈氏 症。於上述任何態樣的又其它具體例中，所述PCD為眼睛的PCD且選 自下述所成組群的一者或多者視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變 性(例如溼性或乾性)、青光眼、角膜營養不良、視網膜劈裂症、斯塔 爾加特病、常染色體顯性遺傳脈絡膜小疣及貝斯特氏黃斑營養不良。 於上述任何態樣的再其它具體例中，所述的化合物抑制哺乳動物雷帕 黴素靶蛋白(mTOR)或抑制腦中富集的Ras同源體(Rheb)。於上述任何 態樣的一較佳具體例中，所述眼睛的PCD為視網膜色素變性或黃斑變 性，例如年齡相關性黃斑變性(例如溼性或乾性)。於上述任何態樣的 再其它具體例中，所述的方法進一步包括對個體(例如哺乳動物，如人 類)給藥11-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇或11-順式-視黃醇的7-環鎖 異構物。於上述任何態樣的較佳具體例中，所述個體包括影響蛋白質 摺疊的突變(例如在視蛋白中的突變，如P23H突變或在CFTR的突變，如AF508)。於上述任何態樣的再其它具體例中，所述降解對錯誤摺疊 蛋白質有選擇性。於上述任何態樣的再其它具體例中，有用於本發明
的方法的化合物為雷帕黴素、法尼基轉移酶抑制劑、FTI-277或該等化 合物的類似物。於再其它具體例中，所述的方法進一步包括對個體給 藥11-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇或11-順式-視黃醇的7-環鎖異構 物。於又另一具體例中，所述的化合物抑制哺乳動物雷帕黴素耙蛋白 (mTOR)或抑制腦中富集的Ras同源體(Rheb)。於上述任何態樣的各種 具體例中，所述個體(例如人類或獸醫動物患者)包括影響蛋白質摺疊 的突變，例如在視蛋白中的突變(例如P23H突變)。於再其它具體例中， 所述降解對錯誤摺疊蛋白質有選擇性。於再其它具體例中，所述11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與化合物彼此於24小時內、於3日內或 於5日內給藥。於上述任何態樣的其它具體例中，所述11-順式-視黃 醇或9-順式-視黃醇與化合物為同時給藥。於再其它具體例中，所述 l卜順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與化合物為對眼睛給藥；例如眼內給 藥。於再另一具體例中，所述11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與化 合物為各自併入組合物以提供其長時間的釋放(例如微球體、納米球體 或納米乳化物)。於再另一具體例中，所述長時間的釋放通過藥物傳遞 裝置。於再另一具體例中，所述的方法進一歩包括給藥維生素A補充 物。於上述任何態樣的其它具體例中，自體吞噬增強為通過監控蛋白 濃度而測定；通過由監控自體吞噬標記的表達；或通過監控自體吞噬 液泡的數目。


第1A至II圖顯示相對於野生型(WT)視蛋白對於錯誤摺疊P23H視 蛋白的選擇性降解的自體吞噬。第1A、 1C及1E為免疫墨點分析顯示 HEK-293細胞穩定地使用野生型視蛋白(第1A圖)或P23H視蛋白(第1C 圖)轉染且使用雷帕黴素或胺基酸耗竭誘發自體吞噬的視蛋白的蛋白 質表達。第1E圖中P23H視蛋白表達細胞進一步使用11-順式視黃醇處 理。顯示為自體吞噬誘發的時程。第1B、 1D及1E圖為顯示野生型(第 1B圖)、P23H視蛋白(第1D圖)以及P23H視蛋白使用11-順式視黃醇解 救(第1F圖)的經時降解圖。下述狀況分別註記為下述符號培養基有胺基酸(令)、胺基酸匱乏(議)、有雷帕黴素(A)以及胺基酸匱乏但有
雷帕黴素(魯)。第1G、 IH及II圖為免疫墨點分析。第1G圖顯示於野 生型與P23H表達細胞誘發自體吞噬後mTOR的去磷酸化。第1H及II 圖顯示於細胞表達P23H(第1H圖)或細胞表達P23H也使用11-順式視 黃醇處理(第II圖)的自體吞噬狀況中，伴隨子Bip、鈣聯蛋白及Hsp70 的蛋白質表達。
第2A至2F圖顯示相對於野生型引起AF508的增生降解的自體吞 噬。第2A及2C圖為免疫墨點分析顯示BHK細胞穩定第使用野生型 CFTR (第2A圖)或△ F508 (第2C圖)轉染接著進行胺基酸耗竭(4至6行) 或雷帕黴素處理50mM(7至9行)或兩者(10至12行)的HA-標示的CFTR 表達。第2B及2D圖為顯示野生型CFTR(第2B圖)及AF508(第2D圖) 的經時降解圖。下述狀況分別註記為下述符號培養基有胺基酸(命)、 胺基酸匱乏(■)、有雷帕黴素(▲)以及胺基酸匱乏但有雷帕黴素(參)。 第2E圖為免疫墨點分析顯示於野生型CFTR與AF508表達細胞誘發自 體吞噬後mTOR的去磷酸化。第1H及II圖顯示於細胞表達野生型CFTR 或AF508的自體吞噬狀況中，伴隨子Bip、鈣聯蛋白及Hsp70的調節。
第3A至3B圖為顯示表達野生型視蛋白(第3A圖)或P23H視蛋白 (第3B圖)的HEK-293細胞使用免疫螢光染色自體吞噬標記的顯微圖。 染色顯示自體吞噬標記與P23H視蛋白的錯誤摺疊凝集物共定位。視蛋 白(中間組)使用自體吞噬標記(左側組)Atg7、 LC3及LAMP-1的共定位 系顯示於正常與胺基酸耗竭的狀況。
第4A至4B圖為顯示表達野生型CFTR(第4A圖)或AF508 (第4B 圖)的BHK細胞使用免疫螢光染色自體吞噬標記的顯微圖。自體吞噬標 記與AF508CFTR蛋白質共定位而保留於ER。 HA-標示CFTR(中間組)使 用自體吞噬標記(左側組)Atg7、 LC3及LAMP-1的共定位系顯示於正常 與胺基酸耗竭的狀況。
第5A至5C圖顯示細胞的三種電子顯微圖。第5A圖顯示細胞中 P23H凝集物以視紫質(rhodopsin)與免疫金標識的染色。第5B及5C 圖顯示於自體吞噬細胞中溶酶體與自體吞噬液泡。
第6圖為顯示於視網膜色素變性的P23H老鼠模式中雷帕黴素處理 增強視黃醇功能的條狀圖。對照組P23H1與P23H2為表達一倍體P23H視蛋白的基因轉殖小鼠。Rap-P23HA與B為表達一倍體P23H視蛋白且 使用雷帕黴素處理的基因轉殖小鼠。WT-1、 2及3為野生型對照小鼠。 Rap-WTA及B為接受雷帕黴素野生型對照小鼠。各條表示單一小鼠的 ERG分析。
第7圖為顯示於黃斑變性的老鼠模式中雷帕黴素處理增強視黃醇 功能的條狀圖。各條表示單一老鼠的ERG分析。
第8圖為西方墨點分析顯示於P23H表達細胞使用法尼基轉移酶抑 製劑FTI-277處理的P23H蛋白質降解。用於微管蛋白的西方墨點分析
顯示於下方作為負載對照。詞語〃饋入〃標記培養狀況有胺基酸以及含 血清培養基；詞語"F+R"標記饋入與使用雷帕黴素處理；詞 語"F+FTI277"標記饋入以及使用10 u M或50 u M的FTI277處理。西 方墨點分析使用微管蛋白為探針顯示於下方作為蛋白質負載對照。
第9A至9B圖顯示FTI-277處理造成P23H視蛋白降解結果。第9A 圖為顯示於24小時的時程中使用FTI-277的Rheb抑制後P23H視蛋白 濃度的免疫墨點分析。P23H視蛋白表達細胞使用10tiM(8至IO行)或 50 " M(ll至13行)的FTI277處理。雷帕黴素(5至7行)處理使用作為 陽性對照。亦使用氮基酸及血清饋入對照(2至4行)。微1^蛋白作為負 載對照。第9B圖為顯示於P23H視蛋白表達細胞中，於2小時(h)、 6 小時即12小時的比較雷帕黴素與FTI-277 (50 iiM)處理的免疫墨點分 析的帶像素強度的降解圖。
第10圖為顯示伴隨子鈣聯蛋白、鈣網蛋白、Hsp70及Hsp90濃度 的免疫墨點分析組。此工作分析以時間依賴方式的FTI-277對於未折 疊蛋白質響應與熱休克響應兩者的效果，與顯示自體吞噬排除UPR與 HSR。
第11A至11C圖顯示FTI-277阻隔S6K與mTOR磷酸化的免疫墨點 分析組。第11A圖顯示S6K的磷酸化狀態繫於雷帕黴素與FTI-277處 理後的兩小時內測定。第11B圖顯示mTOR的磷酸化狀態繫於12小時 的時程使用雷帕黴素、FTI-277與FTI-277合併胺基酸與血清缺乏而測 定。
第12A至12C圖為顯示於FTI-277處理後自體吞噬體標記的免疫 共定位的系列顯微圖。第12A圖顯示Atg7染色與第12B圖顯示Atg8染色。該等標記於使用FTI-277處理後觀察與P23H視蛋白凝集物的共 定位。胺基酸饋入與雷帕黴素處理的細胞使用作為對照。第12C圖顯 示細胞使用FTI-277處理的共軛焦影像。共膠影像輕處第顯示自體吞 噬體標記Atg7與Atg8與P23H視蛋白凝集物間的細胞間共定位。自體 吞噬體抗體為經TRITC(左)標示與適蛋白為經FITC(右)標示。
第13A至第13C圖顯示細胞對於FTI-277處理的自體吞噬響應。 第13A圖顯示使用溶酶體探針作為標記，觀察FTI-277處理後細胞中 溶酶體代謝途徑的向上調控。第13圖顯示電子顯微圖超結構分析，其 於使用FTI-277的細胞處理6小時後進行。使用cMPase細胞化學處理 細胞以目視可見溶酶體以及自體溶酶體。第13C圖為顯示FTI-277處 理2小時後與6小時後進行形態學分析的結果圖。使用胺基酸與血清 饋入比較FTI-277處理後的自體吞噬誘發。
第14圖顯示於FTI-277處理後HuH7細胞中GFP-LC3的過度表達 的共軛焦分析。
第15A與15B顯示FTI-277誘發自體吞噬。第15A圖顯示使用自 體吞噬抑制劑3MA處理細胞後所進行的免疫墨點分析。3MA抑制藉由 FTI-277誘發的P23H視蛋白降解。胺基酸與血清匱乏細胞(頂行)使用 作為對照以觀察24小時的P23H視蛋白的累積。類似地，FTI-277處理 於3MA存在時(淡灰條)呈現P23H視蛋白降解。相較於單獨以FTI-277 處理(深灰調)，於3MA處理的細胞於12小時觀察到視蛋白的最大累積。 第15B圖顯示P23H過度表達細胞於饋入(淡灰條)與FTI-277處理(深 灰條)狀況使用蛋白酶體抑制劑，MG132,處理12小時，顯示MG132於 缺乏中未乾擾錯誤摺疊P23H視蛋白的降解。
第16圖為胰島素/T0R/S6K代謝途徑的示意圖，顯示藉由FTI-277 與雷帕黴素的抑制位置。PI3激酶的活化導致Akt的磷酸化。TSC1/2 作用微GAP以活化Rheb，換言之為磷酸化mTOR。 mTOR的抑制導致細胞 自體吞噬的誘發。藉由FTI-277之Rheb的強力抑制所誘發的自體吞噬 類似於藉由雷帕黴素的mTOR抑制所誘發的自體吞噬。
具體實施方式
定義
"哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)"意為對於GenBank讀取編號P42345具有至少85%或95%同一性的多肽序列。
"抑制mTOR"意為降低至少10。/。的至少一種相關於mT0R的生物活 性。範例的"mTOR生物活性〃包括mTOR激酶活性、細胞中自體吞噬的 誘發、細胞循環進程的調控、DNA重組與DNA損傷偵測。抑制mTor與 S6激酶的磷酸化的化合物也抑制mTOR生物活性。
"腦中富集的Ras同源體(rheb)"意為對於GenBank讀取編號 NP—005605具有至少85%或95%同一性的多肽序列。
"抑制rheb"意為降低至少10%的至少一種相關於mTOR的生物活 性。範例的"rheb生物活性"包括自體吞噬的誘發、inTOR的磷酸化、 鳥嘌呤核苷酸結合活性與GTPase活性。
"蛋白質構像疾病"意為疾病或疾患的病理有關於錯誤摺疊蛋白 質的存在。於一具體例中，當錯誤摺疊蛋白質幹擾細胞、組織或器官 的正常生物活性而引起蛋白質構像疾病。
"雷帕黴素生物活性"意為自體吞噬的增強、mTOR抑制、T-淋巴 球增生的抑制、淋巴因子(lymphokine)分泌的抑制、酵母細胞增生的 抑制、蛋白質降解的增強、或相關於雷帕黴素對細胞或有機體給藥的 任何其它效果。
"自體吞噬蛋白質降解"意為藉由自體吞噬實質上發生的降解。 "類似物"意為結構性相關於參考化合物且與參考化合物共享主 要相同功能的化合物。類似物亦意為參考化合物的衍生物或代謝物。 "增強〃亦為至少10%、 15%、 25%、 50%、 75%或100%的正轉變。 "錯誤摺疊蛋白質〃意為相對於參考蛋白質具有影響其三級結構 的轉變的蛋白質。錯誤摺疊蛋白質的範例包括視蛋白的突變形式(例如 P23H視蛋白)，亦即相對於視蛋白參考序列(例如GenBank讀取編號 應—000539及NP—000530)具有序列轉變的形式以及人類CFTR的突變 形式(例如，具有[Delta]F508突變)，亦即相對於CFTR參考序列(例 如，GenBank讀取編號AAA35680， NP—000483， P13569)具有序列轉 變的形式。
詞語"微球體"意指具有生物活化物質並如其中的實質上球型膠 體結構物。 一般而言，微球體具有於約0.5uM至約500uM範圍內的
尺寸分布。當結構物直徑小於1微米，則可使用相對應詞語"納米球體"。
"納米乳化物"意指包含小的液體結構物的油於水中分散物。於
一實施例中，納米乳化物包含具有約0. 5至5微米平均粒徑的液滴的 油相。
"降低"意為至少10%、 25%、 50%、 75%或100%的負轉變。 "選擇性降解"意為優先地影響錯誤摺疊蛋白質的降解，因此正 確摺疊蛋白質實質上不受影響。於各種具體例中，少於45%、 35%、 25%、 15%、 10%或5%的正確摺疊蛋白質受到降解。
如使用於本文，詞語〃治療〃、"處理"、"處置"(treat、 treating、 treeatment)等意指降低或緩和疾病及/或與疾病相關的症 候。應明了，雖然不排除，治療疾病或症狀不需要所述的疾病、症狀 或與其相關的症候為完全地消除。
如使用於本文，詞語，，予頁防，，(prevent 、 preventing 、 preventation)、"預防性治療"等意指降低於個體發展疾病或症狀的 可能性，該個體不具有但處於可能發展失調或症狀的風險。
本發明特徵為組合物與方法，有用於增強活體內錯誤摺疊蛋白質 的降解。 一般而言，本發明系基於發現本發明的化合物(例如雷帕黴素、 FTI-277、其類似物與變異物)增強突變蛋白質的降解。有利地，突變 蛋白質為特定地降解，而期望野生型式的濃度保留大量地未改變。錯 誤摺疊蛋白質可幹擾正常細胞功能，且可引起細胞毒性，導致人類蛋 白質構像紊亂症(PCD)。 PCD包括c:l-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纖維 症、亨延頓氏舞蹈症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、 癌症及病原素媒介的疾患(例如庫賈氏症)。本發明的組合物與方法特 別有用於預防或治療眼的PCD，包括視網膜色素變性、年齡相關性黃斑 變性(溼性型與乾性型)、青光眼、角膜營養不良、視網膜劈裂症、斯 塔爾加特病、常染色體顯性遺傳脈絡膜小疣及貝斯特氏黃斑營養不良。 本發明的組合物可使用於治療PCD，以減緩受影響細胞的死亡，緩和 PCD所引起的症候，或從起始的第一位置預防PCD。
自體吞噬增強劑
自體吞噬為用於細胞質中細胞組成降解的演化上保留機制，且於飢餓細胞中作為細胞救贖機制。於自體吞噬中，細胞質小片由細胞膜 封為囊，形成自體吞噬液泡，該液泡可能與溶酶體融合而使其內含物
降解。自體吞噬增強劑可獨立使用或與11-順式視黃醇、、9-順式-視黃 醇或11-順式-視黃醇的7-環鎖異構物組合用於治療PCD。自體吞噬增
強劑雷帕黴素特別有用於治療視網膜色素變性與其它眼的疾病以及用 於囊胞性纖維症與相關於錯誤摺疊蛋白質或蛋白質凝集物的其它疾 病。自體吞噬增強劑有用於本發明的方法包括，但不限於雷帕黴素、
FTI-277與其鹽或其類似物。 雷帕黴素
雷帕黴素 (Rapamune , sirolimus， Wyeth)為由吸水鏈黴菌 (&e^湖yc6^勿^roscc^'cz^)所生產的環狀內酯。雷帕黴素微免疫抑 制性藥物，其抑制T-淋巴球活化與增生。雷帕黴素結合至且抑制哺乳 動物的雷帕黴素標耙(mTOR)，為細胞循環進展所需要的激酶。mT0R激 酶活性的抑制阻隔T-淋巴球增生與淋巴因子分泌。
雷帕黴素結構與功能類似物包括單醯基化-與二醯基化雷帕黴素 衍生物(美國專利編號4， 316,885);雷帕黴素水溶性前藥(美國專利編 號4， 650， 803) ; (PCT Publication No. WO 92/05179);氨基甲酸酯類(美 國專利編號5，118，678);醯氨酯類(美國專利編號5， 118， 678);生物素 酯類(美國專利編號5， 504， 091);氟化酯類(美國專利編號5， 100， 883); 縮醛類(美國專利編號5,151,413);矽烷酯類(美國專利編號 5， 120， 842);雙環衍生物(美國專利編號5, 120， 725);雷帕黴素二量體 (美國專利編號5， 120， 727) ; 0-芳基，0-烷基，0-烯基與0-炔基衍生 物(美國專利編號5，258，389);與重氫化雷帕黴素(美國專利編號 6， 503， 921)。其它的雷帕黴素類似物包括CCI-779、 (Wyeth Ayerst)、 他克莫司(tacrol imus)、卩比維莫司(pimecrolimus) 、 AP20840 (Ariad Pharmaceutics) 、 AP23841 (Ariad Pharmaceutics)與ABT-578 (Abbott Laboratories) 、 SAR943 (32-脫氧基雷帕黴素，Eynott等人， Immunology. 109 (3) : 461-7， 2003)與依維莫司(everolimus) (SDZ RAD)。依維莫司Everolimus (40-0-(2-羥乙基)雷帕黴素(CERTICAN， Novartis)為結構性類似於雷帕黴素的免疫抑制大環內酯。其它的雷帕黴素類似物敘述於美國專利編號5， 202， 332與5， 169, 851。
雷帕黴素目前用於口服給藥為液體與錠劑配方物。RAPAMUNE. TM. 液體含有1 mg/mL雷帕黴素而於給藥前稀釋於水或柳橙果汁中。含有1 或2 mg雷帕黴素的錠劑亦可取得。雷帕黴較加為每日給藥一次。口服 給藥後吸收快速且完全。典型地，雷帕黴素的患者劑量根據患者狀況 而改變，但某些標準建議劑量提供於下文。雷帕黴素的起始負載劑量 為6 mg。後續維持劑量典型為2 mg/day。或者，3 mg、 5 mg、 10 mg、 15 mg、 20 mg或25 mg的負載劑量可與1 mg、 3 mg、 5 mg、 7 mg或10 mg 的每日維持劑量使用。體重低於40kg的患者，雷帕黴素劑量典型地基 於體表面積而調整； 一般而言，使用3 mg/mVday負載劑量與1 mg/m7day 維持劑量。
法尼基轉移酶抑制劑
法尼基轉移酶抑制劑抑制法尼基化，法尼基化為蛋白質的後轉譯 修改而增加經修改的蛋白質的親水性而引起其定位於細胞膜的表面。 對細胞膜的定位典型地為法尼基化蛋白質的正常功能所需。法尼基受 體部分已於各種蛋白質中特徵化為於標靶蛋白質的羧基端發現四個氨 基酸序列。此四個胺基酸序列已特徵化為-C-A-A-X，其中"C"為半胱氨 酸殘基，"A"為任何脂肪族胺基酸與"X"為任何胺基酸。法尼基轉 移酶抑制劑(FTIs)，例如FTI-277，抑制Ras與其它法尼基化蛋白質(例 如Rheb)的後轉譯脂質代謝。如同更詳細的下文所述，FTI-277為範例 的法尼基轉移酶抑制劑，具由去活化mT0R而於細胞誘發自體吞噬。mT0R 負調控自體吞噬作為響應於胺基酸的AKT/PKB的下遊標靶。根據部分 的本發明，其它抑制法尼基轉移酶的藥劑亦可有用於本發明的方法。
有用於本發明方法的法尼基轉移酶抑制劑已知於此項技術且敘述 於，例如美國專利編號:7， 022， 704、 6， 936， 431 、 6， 800， 636、 6， 790， 633、 6, 740, 661、 6， 737， 410、 6， 576, 639、 6， 528， 523、 6， 498' 152、 6， 440， 974、 6， 432， 959、 6,410,541、 6,399,615、 6， 372， 747、 6， 362， 188;於其它 具體例中，敘述3-巰基吡咯啶酮類FTIs，例如美國專利編號6, 946， 468; 5-經取代四氫萘酮類(tetralones)FTIs敘述於，例如美國專利編號 6， 943， 183;雙環抑制劑敘述於美國專利編號6， 528， 535;與三唑類作為法尼基轉移酶抑制劑敘述於，例如美國專利編號20050234117。有用於 本發明的方法的其它範例的FTIs敘述於美國專利申請案編號 20060079530、 20050148609、 20050059672與20050020516;與於下述 科學文獻Santucci等人，Cancer Control 10:384-387， 2003; Megnin- Chanet等人，BMC Pharmacology, 2:2， 2002, BMS-214662; 與Appels等人，(The Oncologist, 10: 565-578, 2005)。範例的法 尼基轉移酶抑制劑包括但不限於為Santucci等人所敘述的Rl 15777、 GGTI-2166 、 BMS-214664， Cancer Control 10:384-387， 2003; Megnin-Chanet等人所敘述的RPR-130401， BMC Pharmacology, 2:2， 2002; BMS-214662 (Bristol-Myers Squibb， Princeton, NJ) ; L778123 (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ) ; tipifarnib(試驗 的名稱，Rl 15777; Zarnestra(TM) ; Ortho Biotech Products, L. P.， Bridgewater， NJ) ; lonafarnib (試驗的名稱，SCH66336; Sarasar(TM); Schering-Plough Corporation, Kenilworth， NJ); FTI-277 (Calbiochem， EMD Biosciences, San Diego);與L744832 (Biomol International L.P. ， Plymouth Meeting, PA)。
FTIs的建議臨床^flj量典型地為每日界於100 ug與10， 000 mg。給 藥可為此項技術所知的任何方法。特別地tipifarnib口服給藥150、 200、 300、 400、 500與600 mg的劑量每日兩次持續21日。Lonafarnib 口服給藥100、 200、 300，與400 mg的劑量每日兩次於連續療程。 BMS-214662典型地為靜脈內給藥每3周一次輸注1小時以100 mg/m2、 200 mg/m2、 275 mg/m、 300 mg/m2》24小時輸注；或者BMS-214662 以每周排程300 mg/m2與每周排程102 mg/m2。 BMS-214662給藥的每日 基準為81 mg/m2亦有用於本發明的方法。給藥FTIs的其它模式已知於 此項技術，且敘述於例如Appels等人(The Oncologist, 10: 565-578， 2005)。
目艮蛋白質構"(象紊舌L症(Ocular Protein Conformational Disorders)
本發明的組合物特別有用於實質的任何眼蛋白質構像紊亂症 (Ocular Protein Conformational Disorders; PCD)。.該疾患特徵化 為於眼內錯誤摺疊蛋白質的累積為蛋白質凝集物或纖維化。本發明的組合物選擇性地增強錯誤摺疊蛋白質的降解而保留正確摺疊蛋白質的 濃度大幅地未受影響。視網膜色素變性為範例的眼PCD其相關於視蛋 白的錯誤摺疊蛋白質(例如P23H視蛋白)(GenBank讀取編號 NM—000539與NP—000530)，以及與碳酸酐酶IV (CA4)的突變)(GenBank 讀取編號NM—000717 and NP—000708) (Rebello等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Apr 27; 101 (17) : 6617-22) 。 CA4為糖基化磷脂醯肌 醇錨定蛋白質，其為高度表達於人類眼睛的脈絡膜微血管。R14W突變 引起CA4蛋白質為不正確摺疊且帶有此突變的患者患有常染色體顯性 遺傳視網膜色素變性。增強CA4多肽的突變型的降解的本發明的組合 物有用於與CA4多肽的突變相關的常染色體顯性遺傳視網膜色素變性 的治療。
X染色體串聯視網膜裂損症(X-linked juvenile retinoschisis (RS))為另一眼PCD。 RS為男性青少年黃斑退化(juvenile macular degeneration)的常見成因。於RSI (NM—000330， NP—000321)的突變、 或retinoschesin基因有責於X關聯視網膜裂損症，於男性為常見、 早髮型黃斑變性，而結果導致視網膜內層的分裂以及視力的嚴重損失。 於RSI的突變破壞蛋白質摺疊(J Biol Chem. 2005 Mdr 18:280(11): 10721 -30)。增強RSI突變型的降解的本發明組合物有用於視網膜裂 損症的治療。
青光眼為眼PCD與myocilin蛋白質的突變有關。Myocilin蛋白質 為普遍表達於許多人類器官(包括眼睛)的未知功能的分泌性糖蛋白。 於此myocilin蛋白的突變引起一種型的青光眼，為世界上失明的主要 原因。突變的myocilin蛋白累積於轉染細胞的內質網作為不溶性凝集 物(Aroca-Aguilar等人，Biol Chem. 2005 Jun 3; 280 (22) : 21043-51; GenBank讀取編號NMJ300261與NP—000252)。增強myocilin蛋白的 突變型降解的本發明組合物有用於myocilin蛋白相關的青光眼的治 療。
類斯塔爾加特黃斑病為眼PCD且與EL0VL4的突變相關。EL0VL4 (非 常長鏈脂肪酸4的延長)為參予非常長鏈脂肪酸生合成的蛋白質ELO家 族的成員。EL0VL4的突變已於患有常染色體顯性遺傳類斯塔爾加特黃 斑病(STGD3/adMD)的患者受到鑑定。EL0VL4突變蛋白質於轉染細胞累積為大凝集物(Grayson等人，J Biol Chem. 2005 Jul 21; Epub) (GenBank讀取編號NM—022726 and NP一073563)。增強EL0VL4突變的 降解的本發明組合物有用於類斯塔爾加特黃斑病的治療。
遺傳性黃斑改變性疾病(Malattia Leventinese; ML)與多恩巢狀 式網膜萎縮(Doyne honeycomb retinal dystrophy; DHRD)為兩種常染 色體顯性遺傳PCDs其特徵化為累積於視網膜色素細胞(RPE)下方的己 知為小疣的黃-白沉積物。EFEMP1於脈絡膜小疣形成扮演要角且腎及黃 斑變性的病原學(Stone等人，Nat Genet. 1999 Jun; 22 (2) : 199-202) (GenBank讀取編號NM_004105與NP—004096)。突變的EFEMP1為錯物 摺疊且保留於細胞內。增強EFEMP1突變型的降解的本發明組合物有用 於常染色體顯性遺傳脈絡膜小疣的治療。
貝斯特氏黃斑營養不良為常染色體顯性遺傳PCD，其由編碼 Bestrophin蛋白的VMD2 (hBESTl)的突變所引起，為CI (-)通道(Gomez 等人，DNA Seq. 2001 Dec; 12(5-6) :431-5) (GenBank i賣取編號 NM—004183與NP—004174)。於bestrophin蛋白的突變似乎引起蛋白質 錯物摺疊。增強正確摺疊bestrophin蛋白的突變型的降解的本發明組 合物有用於貝斯特氏黃斑營養不良的治療。
5q31 -關聯的角膜營養不良為常染色體顯性遺傳PCDs其特徵化 為年齡依賴性進展的角膜蛋白質沉積物的累積且接著視力損傷。於 5Z&M基因(GenBank讀取編號醒_000358)，亦稱為7^7^，/(轉型生長 因子-0-誘發；transforming growth factor-[beta]-induced)對此 狀況的全族群有責。Arg-124以及其它殘基的取代，經由參予改變角膜 組織蛋白質更新的不同凝集途徑。導致角膜特異的編碼蛋白質 (GenBank讀取編號.NP—000349)的沉積。增強正確摺疊蛋白質的突變 型的降解的本發明組合物有用於5q31 -關聯的角膜營養不良的治療。
治療方法
技術領域：
本發明提供治療PCDs疾病及/或疾患或其症候(例如細胞毒性)的 方法，藉由選擇性增強錯誤摺疊蛋白質的降解。本方法包括對本文所 述個體(例如哺乳動物，如人類)給藥有效量的含有化合物(例如mT0R 抑制劑，如雷帕黴素、法尼基轉移酶抑制劑(如FTI-277))的醫藥阻合物。因此， 一具體例為治療個體患有或懷疑有蛋白質構像疾病或疾患 或其症候的方法。所述方法包括對哺乳動物給藥治療量的本文化合物 足量以治療疾病或疾患或其症候，以使疾病或疾患受到治療的條件。
本發明的方法包括對個體(包括鑑定為需要改治療的個體)給藥足 量的本文所述化合物或本文所述組合物，以產生該效果。鑑定需藥該 治療的個體可為個體的或健康照護專業的判斷且可為主動性(例如意 見)或被動性(例如由測試或診斷方法測量)。
本發明的治療方法，包括預防療法， 一般包括給藥醫療有效量的 本文所述化合物，例如對有需要的個體(例如動物、人類)，包括哺乳 動物(特別是人類)給藥化合物的配方物。該治療適合對個體給藥，包 括人類，患有、具有、懷疑有或有風險於疾病、疾患或其症候。該等 個體有無處於風險的測定可藉由診斷測試或個體或健康照護提供者的 意見(例如基因測試、酵素或蛋白質標記、標記(如本文所述)、家族使 等)的任何被動性或主動性的判定。本文所述組合物亦可適用於治療蛋 白質摺疊(包括錯誤摺疊)可能引起的任何其它疾病。
於一具體例中，本發明提供偵測治療進展的方法。本方法包括於 患有或懷疑有與蛋白質摺疊(包括錯誤摺疊)相關的疾病或其症候的個 體，測定診斷標記(標記)(例如藉由本文所述化合物所調節的任何本文 所述的標耙，蛋白質或其指示劑等)濃度或診斷測定(例如篩選、分析) 的步驟，其中該個體經給藥治療量的本文所述化合物足以治療該疾病 或其症候。本發明方法中標記濃度的測定可與健康正常對照組或其它 患病患者中的標記相比較以建立該個體的疾病狀態。於較佳具體例中， 個體中標記的次級濃度於第1濃度測定後的時間點測定，且比較兩濃 度以偵測疾病的進展或治療的療效。於某些較佳具體例中，個體中標 記的治療前濃度根據本發明於開始治療前測定；標記的治療前濃度可 與療法後的個體中標記濃度相比較，以測定治療的療效。
醫藥組合物
本發明特徵為醫藥製劑，包括與醫藥可接受付型劑的化合物，其中， 該化合物提供錯誤摺疊蛋白質的選擇性降解。該製劑具有治療與預防 兩種應用。於一具體例中，醫藥組合物包括l卜順式視黃醇或9-順式視黃醇與增強錯誤摺疊化合物的化合物組合。該11-順式視黃醇或9-
順式視黃醇與該化合物為一起或分別配方。本發明化合物可為醫藥組 合物的一部分給藥。組合物應為無菌且含有適合對個體給藥的醫療有 效量的該多肽的重量或容積單位。本發明的組合物與組合可為醫藥包 裝物的一部分，其中各化合物呈單獨的劑量。
如使用於本文，本發明化合物(包括本文所述配方物的化合物)定義 為包括其醫藥可接受的衍生物或前藥。"醫藥可接受的衍生物或前 藥"為本文化合物的任何醫藥可接受的鹽、酯、酯的鹽或其它衍生物， 於對接受者給藥能提供(直接或間接)本發明的化合物。特別較佳的衍 生物與前藥為當對哺乳動物給藥(例如允許口服給藥化合物更容易地 於血液中吸收)增加本發明化合物的生體可利用率或相對於母化合物 增強母化合物對生物組成(例如腦或淋巴系統)的傳遞。較佳的前藥包 括衍生物，其中的基團增強水溶性或活化經由腸膜的傳遞子，付於本
文所述配方物的結構物。參照Alexander, J.等人y0wr;2W i/edicjW C力簡'"2T 1988， 31， 318-322; Bundgaard, H. "esi卵of 屍ro(ir收5"; Elsevier: Amsterdam, 1985; pp 1-92; Bundgaard， H.; Nielsen, N. M.ofi/ec/2'ci朋7 C/ ,'stry 1987， 30， 451-454; Bundgaard, H. A Text^cia^ of Z r收"ew'卵a/7(^"ei^/ci，e/^; Harwood Academic Publ. : Switzerland, 1991; pp 113-191; Digenis, G. A. 等人j7a/ 必o。A Zy/ erj'7Z7e/7力aJ屍力ar鵬ccJo《y 1975, 28， 86- 112; Friis， G. J. ; Bundgaard, H. A r^YZ^oc^: of Z r收/fe57'卵朋J "eyeJop膨/^; 2 ed. ; Overseas Publ. : Amsterdam, 1996; pp 351-385; Pitman, I. H. i/ec/ici朋2 / esearc力j eriew^ 1981， 1， 189-214; Sinkula， A. A. ; Yalkowsky. TowztjsJ 0/ ,AgiTM3cew力ic37 5"cie/7ces 1975， 64， 181-210; Verbiscar， A. J. ; Abood, L. G加，J o/" GWs^T 1970，13，1176-1179; Stella， V.J.; Himmelstein， K. J. Towr朋2 i/eo^'ci朋7 C力e肌'str7 1980， 23， 1275-1282; Bodor， N. ; Kaminski， J. J.y e/ orz^ i/7 C力簡'Wir 1987， 22， 303-313。
本發明的化合物可'經由補充的合適功能性修改而增強選擇性生物 性質。該等修改已為此項技術所知且包括增加生物穿透性至指定的生物組成(例如血液、淋巴系統、神經系統)，增加口服可利用率、增加 溶解性以允許藉由注射給藥、改變代謝與改變排初速率者。 本發明化合物的醫藥可接受鹽類包括該等衍生自醫藥可接受無機與有 機的酸類與鹼類。適合的酸鹽類的範例包括醋酸鹽、己二酸鹽、褐藻 酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、重硫酸鹽、酪酸鹽、檸檬 酸鹽、樟腦鹽、樟腦磺酸鹽、葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、 甲酸磺酸鹽、延胡索酸鹽磺酸鹽、葡庚酸鹽、羥乙酸鹽、半磺酸鹽、 庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥乙基磺酸鹽、 乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、 硝酸鹽、波莫酸鹽、果酸鹽、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽、磷酸鹽、苦味 酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、 硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽與十一垸酸酯鹽。其它酸類，例如草酸，雖然 其本身不為醫藥可接受的，但可作為獲得本發明化合物及其醫藥可接 受的酸加成鹽類的中間體，應用於鹽類的製備。衍生自合適鹼的鹽類
包括鹼金屬(例如鈉)、鹼土金屬(例如鎂)、銨與N-(烷基)/鹽類。本發
明亦設想揭示於本文化合物的任何含氮基團的四級化
(quaternization)。水可溶或油可溶或可分散的產物可由該四級化獲 得。
本發明的醫藥組合物使用於預防或治療給藥應為無菌。無菌容易 地藉由通過無菌過濾膜(例如0.2um膜)過濾、藉由伽瑪射線、或藉由 任何此項技術領域已知的合適方法而完成。 一般而言，治療的多肽組 合物放置於具有無菌組合件的容器，例如靜脈內溶液袋或具有可藉由 皮下注射針頭穿刺的栓塞的小瓶。該等組合物習慣性地儲存於單位或 單位劑量容器，例如，密封的安瓶或小瓶，為水溶液或為用於重組成 的凍幹配方物。
化合物可藉由選擇性地與醫藥可接受的付型劑組合。使用於本文 的詞語"醫藥可接受的付型劑"意指適合對人類給藥的一種或多種相 容的固體或液體填充物、稀釋劑或封囊物質。詞語"載劑"註記為有 機或無機成分，為天然或合成的，與活性成分組合而有助於給藥。醫 藥組合物的成分亦能與本發明的分子、與其彼此，以使其無實質上損 傷所欲醫藥療效的幹擾的方式而共混合。付型劑較佳含有例如增強滲透性與化學穩定性的物質的微量添加 物。該等材料於施用劑量及濃度對接受者為無毒性，且包括緩衝液例 如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽與其它 有機酸類或其鹽類；三羥基甲基氨基甲烷(TRIS)、碳酸氫鹽、碳酸鹽 與其它有機鹼類與其鹽類；抗氧化劑，例如抗壞血酸；低分子量(例如 少於10個殘基)多肽，例如多精氨酸、多離氨酸、多麩氨酸與多天冬 氨酸；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合 物，例如聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)、聚丙二醇(PPGs)與聚乙二醇(PEGs); 胺基酸，例如甘氨酸、麩氨酸、天冬氨酸、組氨酸、離氨酸或精氨酸； 單糖類、雙糖類與其它碳水化合物包括纖維素或其衍生物，葡萄糖、 甘露糖、蔗糖、葡聚糖類或硫酸化碳水化合物衍生物，例如肝素、軟 骨素硫酸鹽或湖精硫酸鹽；多價金屬離子，例如二價金屬離子，包括 鈣離子、鎂離子與錳離子；螯合劑，例如乙二氨四乙酸(EDTA);糖醇， 例如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡離子，例如鈉或銨；及/或非離子性界 面活性劑，例如聚脫水山梨醇或泊洛沙姆(poloxamer)。其它衍生物可 包括，例如穩定劑、抗微生物劑、惰性氣體、流體與營養補充劑(例如 林格氏葡萄糖)、電解質補充劑等，其可一慣用量存在。
如上所述，該組合物可給藥有效量。有效量將依據給藥模式、欲 處理的特定狀況與所欲結果。亦可依據症狀狀態、個體的年齡與生理 狀況、同時療法的本質與醫學實施者所熟知的任何因素。對於治療應 用，量應足以達成醫學上所欲結果。
對於具有蛋白質構像紊亂疾病或疾患的患者，有效量為足以增加 細胞中正確摺疊蛋白質的濃度。對於具有相關於錯誤摺疊蛋白質的劑 並或疾患的患者，有效量為足以穩定、降低或減低相關病原學的症候。 一般而言，本發明化合物的劑量形成每日約0. 01 mg/kg至每日約1000 mg/kg。期望劑量範圍由約50至約2000 mg/kg為適合。較低劑量將導 致由某些給藥型式，例如靜脈內給藥。於起始施用劑量為不充足的個 體反應的情況中，可額外施用於患者耐受性允許的較高劑量(或由不 同、更定位化的傳遞途徑的有效較高劑量)。每日多次劑量可仔細考慮 以達成本發明組合物的合適全身性濃度。
有多種給藥途徑。 一般而言，本發明的方法可使用醫學上可接受的任何給藥模式，意指產生活性化合物的有效濃度而不引起臨床上不 可接受的化效果的任何模式。於一較佳具體例中，本發明的組合物為 眼內給藥。給藥的其它模式包括口服、直腸的、局部的、眼內的、舌 下的、陰道內的、腦池內的、腦室內的、氣管內的、鼻腔、穿皮的、 植入物內/上或腸胃外的途徑。詞語〃腸胃外的"包括皮下的、氣管內 的、靜脈內的、肌肉內的、腹腔內的或輸注。包括本發明組合物的組 合物可添加至生理性流體，例如添加至玻璃體液(intravitreal humor)。用於CNS給藥，有多種技術可選擇用於促進療法橫過血腦屏 障的轉移，包括藉由手術或注射的破壞、瞬間開啟界於CNS血管內皮 細胞間的黏合接觸與有助於通過該等細胞的轉位的化合物。由於對患 者的便利性以及劑量排程，口服給藥較佳可用於預防療法。
本發明的醫藥組合物可視需要的迸一步如所欲的含有一種或多種 其它蛋白質，包括血漿蛋白質、蛋白酶與其它生物材料，只要對個體 給藥不引起壞效果。合適的蛋白質或生物材料可藉由公開且為此項技 術領域已知的方法，由人類或哺乳動物血漿獲得；由重組組織培養物 的上清液、萃取物或溶解物、病毒、酵母、細菌或含有根據標準重組 DNA技術導入表達人類或哺乳動物的血漿蛋白質的基因者；或由流體 (例如血液、乳、淋巴、尿液等)或含有根據標準重組DNA技術導入表 達人類或哺乳動物的血漿蛋白質的基因的基因轉殖動物。
本發明的醫藥組合物可包括一種或多種pH緩衝化合物，以維持配 方物的pH於反應生理pH的預先決定的濃度，例如約5. 0至約8. 0的 範圍。使用於液體配方物的pH緩衝化合物可為胺基酸或胺基酸的混合 物，例如組氨酸或例如組氨酸與甘氨酸的胺基酸的混合物。或者，pH 緩衝化合物較佳地為維持配方物的pH於預先決定的濃度(例如約5.0 至約8. 0的範圍)的藥劑，且該劑量不螯合鈣離子。該等pH緩衝化合 物的說明實例包括但不限於咪唑與醋酸鹽離子。pH緩衝化合物可以合 是於維持配方物的pH於預先決定的濃度的任何量存在。
本發明的醫藥組合物亦可含有一種或多種滲透調節劑，亦即調節 配方物的滲透性質(例如張性(tonicity)、滲透壓及/或滲透壓力)於接 受者個體的血流與血細胞可接受濃度的化合物。滲透調節劑可為任何 不螯合鈣離子的試劑。滲透調節劑可為對熟習此項技術領域者為已知或可取得的調節配方物滲透性質的任何化合物。熟習此項技術領域者 可依經驗地決定使用於本發明配方物的指定滲透調節劑的適合性。滲 透調節劑的合適型態的說明實例包括但不限於鹽類，例如氯化鈉與 醋酸納；糖類，例如蔗糖、葡萄糖與甘露糖；胺基酸，例如甘氨酸； 與該等試劑及/或試劑型態的一種或多種的混合物。滲透調節劑可以足 以調節配方物的滲透性質的任何濃度存在。
包括本發明化合物的組合物可含有多價金屬離子，例如鈣離子、 鎂離子及/或錳離子。有助於穩定組合物且對接受者個體無壞影響的任 何多價金屬離子皆可使用。熟習此項技術領域者，基於兩個準則，可 依經驗地測定合適的金屬離子與該等金屬離子的合適來源為已知，且 包括無機與有機鹽類。
本發明的醫藥組合物亦可為非水性液體配方物。任何合適的非水 性液體皆可使用，只要其對含於其中的活性成分提供穩定性。較佳地， 該非水性液體為親水性液體。合適的非水性液體的說明實例包括甘 油；二甲亞碾(DMSO);聚二甲基矽氧烷(PMS);乙二醇，例如乙二醇、
二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(PEG)200、 PEG300與PEG400;與聚丙 二醇，例如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(PPG)'425、 PPG725、 PPG1000、 PPG2000、 PPG3000與PPG4000。
本發明的醫藥組合物亦可為經混合的水性/非水性液體配方物。任 何合適的非水性液體配方物，例如上文所述者，可單獨與任何水性液 體配方物，例如上文所述者， 一起施用，只要經混合的水性/非水性液 體配方物對含於其中的化合物提供穩定性。較佳地於該配方物中的非 水性液體為親水性液體。合適的非水性液體的說明實例包括甘油； DMS0; PMS;乙二醇，例如PEG200、 PEG300與PEG400;與聚丙二醇， 例如PPG425、 PPG725、 PPG1000、 PPG2000、 PPG3000與PPG4000。
合適的穩定配方物可允許活性成分於冰凍或於未冰凍液體狀態的
儲存。依據組合物的性質，穩定的液體配方物可儲存於至少-7crc的溫
度，但亦可儲存於至少0。C的較高溫度或界於約0. rC與約42'C之間。 一般而言，對熟悉此項技術領者已知蛋白質與多肽對pH、溫度與可影
響治療效果的其它因子的多重性的變化敏感。
其它傳遞系統可包括經時釋放、延遲釋放或持續釋放傳遞系統。該等系統可避免本發明組合物的重複給藥，增加個體與醫生的便利性。 已有許多型態的釋放傳遞系統且為熟悉此項技術領域者所知。包括基
本系統例如聚乳酸(美國專利3，773,919;歐洲專利58, 481)、聚(乳酸 -甘醇)、共聚草酸酯、聚己內酯、聚酯醯氨、聚正交酯、聚羥基丁酸(例 如聚-D-(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利133，988)、 L-麩氨酸與Y-乙基-L-麩氨酸酯的共聚物(Sidman， K. R.等人，Biopolymers 22: 547-556)、 聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或醋酸伸乙基乙烯酯(Langer， R.等人，J. Biomed. Mater. Res. 15:267-277; Langer， R. Chem. Tech. 12:98-105) 與聚酸酐。
持續釋放組合物的其它實例包括微形塑物(例如膜或微膠囊)形式 的半可滲透性聚合物基材。傳遞系統亦可包括非聚合物系統為；脂質 包括固醇類，例如膽固醇、膽固醇酯與脂肪酸或中性脂肪(例如單-、 二-與三-甘油酯；水凝膠(hydrogel)釋放系統，例如生物性衍生的生 物可吸收水凝膠(亦即幾丁質水凝膠或甲殼素水凝膠)；黏液系統；肽 為主系統；蠟被覆物；使用傳統黏合劑與付型劑的壓縮錠劑；部分融 合植入物等。具體實例包括但不限於；(a)剝蝕系統，其中試劑含有 魚基質內的如敘述於美國專利編號4， 452， 775、 4， 667， 014、 4， 748， 034 與5,239,660以及(b)擴散系統，其中活性成分準許於經調控的速率 由聚合物滲透，例如敘述於美國專利編號3, 832， 253與3, 854， 480。
可使用於本發明的方法與組合物的傳遞系統的另一型態為膠體分 散系統。膠體分散系統包括脂質為主的系統(包括油於水中乳化物)、 膠團(micelles)、混合膠團與微脂體。微脂體為人工的膜管，其有用 於活體內或活體外的傳遞載體。大的單層管(LUV)，尺寸範圍由0.2至 0.4wm，可包囊大的巨分子於水性內層中且可於生物活性型式傳遞至 細胞(Fraley， R. ， and Papahadjopoulos， D. ， Trends Biochem. Sci. 6: 77- 80)。
微脂體可藉由將微脂體耦合制特定配體(例如單株抗體、糖、糖脂 質或蛋白質)而標靶至特定組織。微脂體可由GibcoBRL商業取得，例 如，為LIPOFECTIN 與LIPOFECTACE ，其為陽離子性脂質，例如N-[I -(2， 3 二油醯基氧基)-丙基]-N, N， N-三甲基銨氯化物(DOTMA)與二 甲基二十八垸基銨溴化物(DDAB)。用於製造微脂體的方法已為此項技術領域所知且經敘述於許多文獻，例如於德國專利3,218,121; Epstein等人,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP52，322;歐洲專利36,676;歐洲專利88， 046;歐洲專利143,949; 歐洲專利142,641;日本專利申請案83-118008; U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and歐洲專利102,324. Liposomes also have been reviewed by Gregoriadis， G. , Trends Biotechnol.， 3: 235-241)。
載體的另一形態為生物兼容性微球體或適合用於移植至哺乳動物 接受者的植入物。有用於本方法的生物可蝕性植入物的範例敘述於PCT 國際專利申請案號PCT/US/03307 (公開案號W0 95/24929，名稱為 "Polymeric Gene Delivery System") 。 PCT/US/0307揭示生體可相容， 較佳地為生物可降解性聚合物基質，於合適啟動子的調控下用於含有 外源性基因。該聚合性基質可使用於達成該外源性基因或基因產物於 個體的持續釋放。
該聚合性基質較佳地為微顆粒形式，例如為微球體(其中試劑分散 於固體聚合物基質)或微膠囊(其中試劑儲存於聚合物殼的芯)。上述含 有藥物的聚合物的微膠囊例如敘述於美國專利5， 075， 109。用於含有試 劑的聚合物基質的其它形式包括膜、被覆物、膠、植入物與支架。聚 合物基質裝置的尺寸與組成為選擇使結果為於基質導入其中的組織中 的較佳釋放動力學。聚合物基質的尺寸迸一歩依據所使用的傳遞方法 加以選擇。較佳地，當使用氣霧途徑時，聚合物基質與組合物為包封 於界面活性劑載體。該聚合物基質組合物可選擇為具有較佳降解速率 且亦可為生物黏合性材料的形式，以進一步增加轉移有效性。該基質 組合物亦可選擇為不降解，但經由擴散於延長的時間而釋放。該傳遞 系統亦可為生物兼容性微球體，適合於定位、位置特定的傳遞。該微 球體敘述於Chickering， D. E.，等人，Biotechnol. Bioeng. ， 52: 96-101; Mathiowitz， E.,等人，Nature 386: 410-414。
非生物可降解性與生物可降解性的聚合物基質兩者可使用對個體 傳遞本發明的組合物。該等聚合物可為天然的或合成的聚合物。聚合 物依據所欲釋放的時間歷程而加以選擇， 一般而言，於數小時至一年或更長的順序。典型地，釋放的時間範圍界於數小時與3至12個月之 間為最合宜。聚合物視需要地為水凝膠形式，可吸收約其重量90%的水， 且迸一步視需要地與多價離子或其它聚合物交聯。
可使用於形成生物可降解傳遞系統的合成的聚合物的範例包括聚 醯氨、聚碳酸酯、聚烯、聚伸垸二醇、聚環氧烷、聚對酞酸伸烷酯、 聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯滷化物、聚乙烯吡咯啶酮、 聚乙交酯、聚矽氧烷、聚氨酯與其共聚物、烷基纖維素、羥烷基纖維 素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸系與甲基丙烯酸系酯 的聚合物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥基-丙基甲基 纖維素、羥丁基甲基纖維素、纖維素醋酸酯、纖維素丙酸酯、纖維素 醋酸酯丁酸酯、纖維素醋酸酯酞酸酯、羧乙基纖維素、纖維素三醋酸 酯、纖維素硫酸酯鈉鹽、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、 聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、 聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯 酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙 烯酸癸酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(對酞 酸伸乙酯)、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙 烯吡咯啶酮與乳酸與甘醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(正)酯聚(丁酸)與 聚(乳酸-共己內酯)，以及天然的聚合物例如褐藻酸鹽與其它多醣類包 括糊精與纖維素、膠原蛋白、其化學衍生物(化學基團的取代、加成， 例如烷基、伸垸基、羥基化、氧化與其它為熟悉此項技術領域者所慣 常使用的修改)、白蛋白與其它親水性蛋白質、玉米蛋白與其它醇溶蛋 白與疏水性蛋白質、共聚物與其混合物。 一般而言，該等材質於活體 內藉由酵素性水解或暴露於水，藉由表面或整塊剝蝕而降解。
傳遞至肺上皮細胞的方法
於某些具體例中，例如用於囊胞性纖維症的治療，其希望直接對肺 上皮細胞給藥本發明的化合物，所希望的途徑可為藉由肺氣霧。用於 肺傳遞的藥物可於滷化烴推進劑中作為水性配方物、作為懸浮物或溶 液，或作為乾燥粉末給藥。水性配方物必須藉由水性氣霧器氣霧化施 用於水利或超音速原子化，以推進劑為主的系統需要合適的加壓的劑量計量吸入器，以及乾燥粉末需要可有效地分散藥物物質的乾燥粉末 吸入器裝置。對於水性與其它非加壓的液體系統，各種氣霧器(包括小 容積氣霧器)可用於氣霧化配方物。壓縮器驅動的氣霧器合併有注射技 術與使用壓縮空氣以產生液體氣霧。超音波氣霧器依賴機械能源以壓 電晶體的振動形式產生適於呼吸的液體液滴。推進劑驅動吸入器於各 驅動釋放經計量的醫藥品劑量。醫藥品配方為於合適推進劑中的藥物 物質的懸浮物或溶液。乾燥粉末吸入氣正常為依賴吸入氣體的爆發而 於該單位引出以傳遞藥物劑量。該等裝置敘述於例如美國專利
4， 807， 814與5， 785， 049。
肺部藥物傳遞經由口與喉嚨的器物的吸入而達成。具有約2至約5 微米直徑的顆粒為夠小而可達上-至中-肺部區域(導通氣道)，但太大 而無法到達肺泡。甚至更小的顆粒，亦即約0.5至約0.2微米，始能 接近肺泡區域。具有直徑小於約0.5微米的顆粒亦可藉由沉降於肺泡 區域沉積，然而非常小的顆粒可能被呼出。用於製備氣霧傳遞系統的 技術已為熟悉此項技術領域者所知。參照美國專利案號4， 512， 341、 4， 566， 452、 4,746,067、 5， 008， 048、 6,796,303與美國專利申請案號 20020102294。熟悉此項技術領域者可輕易地修改各種參數與條件用於 生產肺氣霧而不造成過度實驗。
眼部傳遞的方法
技術領域：
本發明的組成物(例如自體吞噬增強劑、mTOR抑制劑(例如雷帕黴 素)、法尼基轉移酶抑制劑(例如FTI-277))特別適合用於治療眼蛋白質 構像紊亂症，例如視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、青光眼、 角膜營養不良、視網膜劈裂症、斯塔爾加特病、常染色體顯性遺傳脈 絡膜小疣及貝斯特氏黃斑營養不良。
於一方向中，本發明的組合物為經由適合於經由眼睛的玻璃體直接 植入的眼部裝置給藥。本發明的組合物可提供為持續釋放組合物，例 如敘述於美國專利5， 672， 659與5， 595， 760者。發現該等裝置提供用 於治療眼睛的多種組合物的持續調控釋放，且無局部或全身性的不利 副作用。此眼部傳遞方法的目的為使含於眼內裝置的藥物或植入物的 量最大化而最小化其尺寸以延長植入物的歷時。參照美國專利5， 378， 475; 6， 375, 972與6， 756， 058以及美國專利申請案20050096290 與200501269448。該等植入物可為生物可降解性及/或生物可兼容性植 入物，或可為非生物可降解性植入物。生物可降解性眼植入物敘述於 例如美國專利申請案20050048099。植入物對活性試劑可為可滲透性或 不可滲透性，且可插入眼腔室，例如前眼或後眼腔室或可移植入鞏膜、 脈絡裂入空間、或玻璃體外的無血管區域。或者，隱形眼鏡可作為本 發明組合物的儲存處亦可使用於藥物傳遞。
於一較佳具體例中，植入物可放置於無血管區域，例如鞏膜上，以 使藥物的穿鞏膜擴散至所欲的治療位置，例如眼內空間與眼的黃斑部。 再者，穿鞏膜擴散的位置較佳地為接近黃斑部。用於傳遞組合物的植 入物的範例包括但不限於敘述於下述美國專利的裝置；3， 416， 530;
3， 828，777;4， 014， 3354，300， 5574, 327， 7254， 853， 224
4， 946，450;4， 997， 6525，147， 6475， 164， 1885， 178, 635
5， 300，114;5， 322， 6915，403, 9015， 443， 5055， 466， 466
5， 476，511;5， 516， 5225，632， 9845， 679， 6665， 710， 165
5， 725，493;5， 743, 2745，766， 2425， 766， 6195， 770， 592
5， 773，019;5， 824， 0725，824， 0735， 830， 1735， 836' 935
5， 869，079，5, 902， 5985，904， 1445， 916， 5846， 001， 386
6， 074， 661; 6， 110'485; 6,126,687; 6,146,366; 6， 251， 090; 與 6， 299， 895，以及於W0 01/30323 and W0 01/28474，其全部併入本文 作為參考文獻。
實例包括但不限於下述者；持續釋放藥物傳遞系統，包括內容器(包 括有效量的試劑以有效的獲得所欲局部性或全身性的生理或藥物學效 果)，不可滲透至試劑通道的內管，該內管具有第一末端與第二末端且 包覆至少部份的內容器，內管的材質的尺寸與形式為使內管能支持其 本身重量，位置於內管第一末端的不可滲透膜，該不可滲透膜預防藥 劑經由內管的第一末端通出容器，以及位置於內管第二末端的可滲透 膜，該可滲透膜允許試劑經由內管第二末端擴散至容器外；用於對眼 治療給藥本發明化合物的方法，該方法包括植入持續釋放裝置以對眼 的玻璃體傳遞本發明化合物的步驟，或植入物、用於對眼治療給藥本 發明化合物的持續釋放裝置；持續釋放藥物傳遞裝置包括a)藥物芯，包括醫療有效量的至少一種第一藥劑以有效的獲得診斷效果或有效的 獲得所欲的局部性或全身性的生理或藥學效果；b)至少一種一元式杯 果(unitary cup)基本上不可滲透至試劑通道且定義內部間隔以接受藥 物芯，該一元式杯果包括具有環繞於該一元式杯果的開放頂端至少某 些部分的至少一嵌壁式溝的開放頂端；c)可滲透栓塞，其可滲透至試 劑通道，該可滲透栓塞位於該一元式杯果的開放頂端，其中該溝與可 滲透栓塞交叉於其位置且封閉該開放頂端，該可滲透栓塞允許試劑通 道於藥物芯外，經過該可滲透栓塞，且通出於該一元式杯果的開放頂 端；以及d)至少一第二試劑有效於獲得診斷效果或有效於獲得所欲的 局部性或全身性生理或藥物學的效果，或持續釋放藥物傳遞系統包括 內芯，其包括有效量的具有所欲穩定性與聚合物被覆層的試劑，該聚 合物層可滲透至該試劑，其中該聚合物被覆曾完全包覆內芯。
用於眼部傳遞的其它方向包括微脂體對眼睛標靶本發明化合物的 使用，且較佳地為對視黃醇色素上皮細胞及/或布氏膜(Bruch' s membrane)。例如，化合物可依上述方式與微脂體複合，且此化合物/ 微脂體複合物注射至具有眼PCD的患者，始用靜脈注射將化合物導至 所欲眼部組織或細胞。直接注射微脂體複合物至視網膜色素上皮細胞 或布氏膜附近，亦可提供用於標靶複合物與某些眼部PCDs的形式。於 一具體實例中，化合物經由眼內持續傳遞(例如VITRASERT或ENVISION) 給藥。於一具體實例中，化合物經由後筋膜下注射傳遞。於另一具體 實例中，含有本發明組合物的微乳化物顆粒傳遞至眼部組織以由布氏 膜、視網膜色素上皮細胞或兩者取得脂質。
納米顆粒為膠體擔體系統，已顯示藉由延長血清半衰期包囊藥物有 改良的療效。聚垸基氰基丙烯酸酯類(PACAs)納米顆粒為於臨床發展中 的聚合物膠體藥物傳遞系統，敘述於Stella等人，J. Pharm. Sci., 2000. 89: p. 1452—1464; Brigger等人，Int. J. Pharm. ， 2001. 214: p. 37-42; Calvo等人，Pharm. Res. ， 2001. 18: p. 1157-1166; and Li等人，Biol. Pharm. Bull., 2001. 24: p. 662-665。生物可降解 聚(羥基酸類)，例如聚(乳酸)(PLA)與聚(乳酸-共-乙交酯)的共聚物為 強力地使用於生醫應用且己受到FDA核准用於某些臨床應用。此外， PEG-PLGA納米顆粒具有許多期望的擔體特徵包括(i)欲包囊的試劑包括總擔體系統的合理的高重量分率(負載)；(ii)使用於包囊處理的第 一步驟的試劑量以合理的高濃度併入最終擔體(包封率)；(iii)該擔體 具有冷凍乾燥能力且於溶液中無凝集的重新組成；(iv)該擔體微生物 可降解的；(V)該擔體系統為小尺寸；以及(vi)該擔體增強顆粒持久性。
納米顆粒使用實際上任何生物可降解的殼而合成已為此項技術領
域所知。於一具體例中，使用聚合物，例如聚(乳酸)(PLA)或聚(乳酸-共-甘醇酸)(PLGA)。該等聚合物微生物可兼容與生物可降解，且進行 修改以期望增加納米顆粒的光化學效果與循環生命期。於一具體例中， 該聚合物以終端羧基(C00H)修改而增加顆粒的負電合且因此限制與負 電荷核酸適體的交互作用。納米顆粒亦可以聚乙二醇(PEG)修改，其亦 增加顆粒於循環中的半衰期與穩定性。或者，該C00H基團轉為N-羥基 琥珀醯氨(NHS)酯用於共價連結至醯氨修改的適體。
有用於本發明的組合物與方法的生物可降解聚合物包括但不限於 聚醯氨、聚碳酸酯、聚烯、聚伸垸二醇、聚環氧烷、聚對酞酸伸烷酯、 聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯滷化物、聚乙烯吡咯啶酮、 聚乙交酯、聚矽氧垸、聚氨酯與其共聚物、烷基纖維素、羥烷基纖維 素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸系與甲基丙烯酸系酯 的聚合物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥基-丙基甲基 纖維素、羥丁基甲基纖維素、纖維素醋酸酯、纖維素丙酸酯、纖維素 醋酸酯丁酸酯、纖維素醋酸酯酞酸酯、羧乙基纖維素、纖維素三醋酸 酯、纖維素硫酸酯鈉鹽、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、 聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、 聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯 酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙 烯酸癸酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環氧乙垸)、聚(對酞 酸伸乙酯)、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙 烯吡咯啶酮、聚玻尿酸、酪蛋白、明膠、明膠蛋白、聚酸酐、聚丙烯、 褐藻酸鹽、甲殼素、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲 基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲 基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚 (丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸癸酯)與其任何組合。於一具體例中，本發明的納米顆粒包括PEG-PLGA 聚合物。
本發明的組合物亦可為局部傳遞。用於局部傳遞，組合物於以核准 用於眼部傳遞的任何醫藥可接受的付型劑中提供。較佳地，該組合物 為液滴型式傳遞至眼睛表面。用於某些應用，組合物的傳遞依賴於化 合物通過鞏膜至眼睛內部的擴散。
熟悉此項技術領域者應了解使用本發明的化合物治療眼部PCD的
最佳治療法可為直接測定。此非試驗性質疑而是一種最適化，此點微 經常性地於醫學技術領域中進行。於裸鼠的活體內研究經常提供最適 化劑量與傳遞法的起始點。經常於某些小鼠研究中，注射頻率由每周 一次開始。然而，此頻率可最適化調整由一天至每兩周至每月，根據 由起始臨床試驗以及特定患者需求所獲得的結果。
用於本發明組合物的人類劑量(例如自體吞噬增強劑，mTOR抑制劑 (例如雷帕黴素)、法尼基轉移酶抑制劑(例如FTI-277))可啟始由使用 於小鼠的化合物量推知而測定，熟悉此項技術領域者可辨知於相對於 動物模式，於此項技術領域中經常性地修改人類劑量。於某些具體例 中，設想劑量可由約1 mg化合物/Kg體重至約5000 mg化合物/Kg體 重；或由約5 rag/Kg體重至約4000 mg/Kg體重或由約10 mg/Kg體重 至約3000 mg/Kg體重；或由約50 mg/Kg體重至約2000 mg/Kg體重； 或由約100 mg/Kg體重至約1000 mg/Kg體重；或由約150 mg/Kg體重 至約500 mg/Kg體重。於其它具體例中，劑量可約l、 5、 10、 25、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 1250、 1300、 1350、 1400、 1450、 1500、 1600、 1700、 1800、 1900、 2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000 mg/Kg體重。於其它具 體例中，設想可使用較高劑量，該劑量可為約5 mg化合物/Kg體重至 約20mg化合物/Kg體重的範圍。於其它具體例中，劑量可為約8、 10、 12、 14、 16或18 mg/Kg體重。其中雷帕黴素可使用每天1 mg、 2 mg、 3 mg、 5 mg、 7 mg、 10 mg、 15 mg、 20 mg或25 mg的齊lj量。當然， 此劑量可向上或向下調整，作為該處理程序中的經常性操作，根據起 始臨床研究的結果與特定患者的需求。篩選分析
如本文所討論者，錯誤摺疊蛋白質經常幹擾細胞的正常生物功能且 引起PCD。於許多情況中，錯誤摺疊蛋白質的累積為蛋白質凝集物引起 細胞損傷與細胞毒性。使用增強該等蛋白質降解的化合物，因而緩和 細胞毒性。有多數種方法可供選擇進行鑑定該等化合物的篩選分析。 於一方向中，無法適於野生型構像的突變蛋白質於細胞中表達(例如細 胞活體外或活體內)；使細胞與候選化合物接觸；以及化合物對於自體 吞噬的效果使用本文所敘述的此項技術領域中已知的任何方法分析。 增強自體吞噬的化合物使用任何標準方法(例如免疫分析)經由測量錯 誤摺疊蛋白質濃度的降低、經由測量細胞毒性的降低、經由測量自體 吞噬液泡存在的增加、或經由測量自體吞噬標記(例如磷酸化的mTOR 或S6激酶)濃度的增加。相對於位接觸化合物的對照細胞，降低接觸 細胞中錯誤摺疊蛋白質的存在量的化合物，考慮為有用於本發明的方 法。分析錯誤摺疊蛋白質量的降低，例如經由測量細胞內蛋白質凝集 物的降低、經由測量細胞毒性的降低或經由測量蛋白質濃度的降低。 較佳地，錯誤摺疊蛋白質為選擇性的降解。於相關方向中，於雷帕黴 素、FT工-277、 l卜順式視黃醇、9-順式視黃醇或其類似物或其衍生物 的存在下篩選。有用的化合物降低錯誤摺疊蛋白質的量為至少10%、15% 或20%,或較佳地為25%、 50%或75%;或更較佳地為至少100%、 200%、 300%或甚至400%。
需要時，經鑑定化合物的療效於具有PCD(例如視網膜色素變性、 囊胞性纖維症、亨延頓氏舞蹈症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、腎 性尿崩症、癌症(例如相關於p53突變的癌症)以及病原素相關的疾患 (例如庫賈氏症))動物模式中分析。
雷帕黴素活性增強劑的篩選
本發明系直接關於用於PCD治療的增強自體吞噬的方法。增強雷帕 黴素或FTI-277生物活性的化合物期望增強錯誤摺疊蛋白質的降解。 因此，化合物經鑑定作為增強雷帕黴素或FTI-277的生物效果，有用 於本發明的方法。於一具體例中，增強雷帕黴素生物活性的小分子使用小分子標靶鑑定策略於酵母細胞中鑑定。雷帕黴素抑制野生型酵母 細胞的生長。增強酵母細胞生長的抑制效果的化合物可使用經常性方 法鑑定，例如化學基因修改篩選。該篩選已知於此項技術領域且敘述
於例如雷帕黴素Huang等人，PNAS 101: 16594-16599， 2004。雷帕黴
素治療誘發營養匱乏回應狀態喚起，經常導致生長抑制的結果。使用 化學基因修改篩選雷帕黴素的小分子增強劑(SMERs)，於酵母細胞 (& cc力ar，yces cerew'w'ae)中增強(例如增加至少5%、 10%、 25%、 50%、 75%、 85%、 90%或95%)雷帕黴素的效果。以生物素化SMERs探試 蛋白質體晶片將鑑定修改雷帕黴素的細胞效果的公認的細胞內標耙蛋 白質。於一具體例中，雷帕黴素於候選化合物的在或不存在下添加至
酵母細胞的培培養基。酵母細胞繼續培養以及偵測酵母細胞的增生(例
如使用光學密度)。與雷帕黴素組合而降低酵母細胞增生的化合物鑑定
為SMER。該等化合物單獨或與雷帕黴素組合似乎有用於增強自體吞噬。
需要時，SMER對於自體吞噬的效果使用本文所述的任何方法(例如自體
吞噬標記的增加、自體吞噬液泡的增加、錯誤摺疊蛋白質降解的增強)
或以致於此項技術領域者進行分析。
測試化合物與萃取物
一般而言，於細胞中能降低錯誤摺疊蛋白質的量或增加該等蛋白質 的選擇性降解的化合物，根據此項技術領域已知的方法，由天然產物 或合成(或半合成)萃取物的大資料庫或化學資料庫鑑定。熟悉藥物發 現與開發的領域者應了解測試萃取物或化合物的精確來源，對於本發 明的篩選步驟並不重要。因此，設想為數眾多的化學萃取物或化合物 可使用本文所述的方法進行篩選。該等萃取物或化合物的範例包括但 不限於植物為主的、真菌為主的、原核生物為主的或動物為主的萃取 物，酸酵液與合成化合物，以及現存化合物的修改者。亦可使用數種 方法產生任意數目的化學化合物的隨機或直接的合成(例如半合成或 全合成)，包括但不限於糖類為主的、脂質為主的、肽為主的與核酸為 主的化合物。合成的化合物資料庫為商業上可取得自Brandon Associates (Merrimack, N. H.)與 Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.)。或者，為細菌、真菌、植物與動物萃取物型式的天然化合物的 資料庫可由商業上數種來源取得，包括Biotics (Sussex, UK) 、 Xenova(Slough, UK) 、 Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FIa.)與Pha皿Mar， U.S.A. (Cambridge, Mass.)。此夕卜，天然與合 成的產物資料庫需要時可根據此項技術領域已知的方法(例如標準萃 取與劃分的方法)產生。再者，需要時，任何資料庫或化合物容易地使 用標準化學的、物理的或生化的方法加以修改。
此外，熟悉藥物發現與開發的領域者容易了解已知於正確摺疊蛋白 質中己知對其活性用於去冗餘(der印lication)(例如命名學去冗餘、 生物去冗餘與化學去冗餘、或其任何組合)的方法或複製物的去除或材 料的重複應儘可能的施用。
當發現粗萃取物修正錯誤摺疊蛋白質的構像且進一步劃分正向先 導性萃取物為必要以單離話反應於所觀察得效果的化學組成。因此， 萃取、劃分與純化步驟的目標為於增加正確摺疊蛋白質產生的粗萃取 物中仔細地特徵與鑑定化學體。該異源萃取物的劃分與純化的方法已 知於此項技術領域。需要時，顯示有用於相關於錯誤摺疊蛋白質或蛋 白質凝集物的任何病理的治療用試劑可根據此項技術領域中已知方法 進行化學性修改。 合併療法
有用於治療PCD(例如視網膜色素變性、亨延頓氏舞蹈症、帕金森 氏病、阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、癌症及庫賈氏症)的本發明組合 物，需要時，可與已知於此項技術領域的任何標準療法合併。對於視 網膜色素變性，標準療法為維生素A補充劑。於帕金森氏病的情況中， 標準療法包括給藥下述多巴氨受體激動劑/左旋多巴的任何一者或多 者金剛氨、甲磺酸溴隱亭、培高利特、阿樸嗎啡、苄絲肼、麥角乙 脲、美舒麥角、麥角乙脲、麥角腈、美金氨、麥角苄酯、吡貝地爾、 對羥基苯乙氨、酪氨酸、苯丙氨酸、馬來酸甲磺酸溴隱亭、馬來酸培 高利特；其它標準療法包括抗組織氨、抗抑鬱劑、多巴氨激動劑及單 氨氧化酶抑制劑。對於亨延頓氏舞蹈症，標準療法包括給藥下述的任 何一者或多者氟呱丁苯、吩噻嗪、利血平、丁苯那嗪、金剛氨及輔 酶QIO。對於阿耳茨海默氏病，標準療法包括給藥下述的任何一者或多 者多萘哌齊(Aric印t)、利凡斯的明(Exelon)、加蘭他敏(Razadyne) 及他可林(Cognex)。對於腎性尿崩症，標準療法包括給藥下述的任何一者或多者氯噻嗪/鹽酸氯噻嗪、阿米洛利及吲哚美辛。對於囊胞性 纖維症，標準療法包括給藥下述黏膜薄化藥物(例如阿法鏈道酶 (dornase alfa)的任何一者或多者支氣管擴張劑(例如沙丁氨醇)與 治療感染的抗生素。對於癌症，標準療法包括給藥下述的任何一者或 多者醋酸阿比特龍、六甲蜜氨、脫水長春鹼、奧瑞斯坦丁、貝沙羅 汀、必卡他氨、BMS184476、 2， 3， 4， 5， 6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基) 苯磺醯氨、博來黴素、N， N-二甲基-L-纈氨醯基-L-纈氨醯基-N-甲基-L-纈氨醯基-N-脯醯氨基-l-L-脯氨酸-第三丁基醯氨、惡病質素、西馬多 丁、苯丁酸氮芥、環磷醯氨、3， ，4， _二脫氫-4， _脫氧-8， - norvin-長春花鹼(cal.eukoblastine)、多西賽他、多西泰素、環磷醯氨、卡鉑、 卡莫司汀(BCNU)、順鉑、念珠藻環肽、阿糖胞苷、達卡巴嗪(DTIC)、 更生黴素、柔紅黴素、海兔毒素、多柔比星(阿黴素)、依託泊甙、5-氟尿嘧啶、非那留氨、氟他氨、羥基脲及羥基脲紫杉烷、異環磷醯氨、 利阿唑、氯尼達明、洛莫司汀(CCNU)、雙氯乙基甲氨(氮芥)、美法侖、 羥乙基磺酸米布爾、利索新、司替尼、鏈脲黴素、絲裂黴素、甲氨蝶 呤、尼魯米特、奧那司酮、太平洋紫杉醇、潑尼莫司汀、丙卡巴肼、 RPR109881、磷酸司特目斯汀、黛莫芬、太索內明、紫杉醇、維甲酸、 長春花鹼、長春新鹼、硫酸長春地辛及維氟明。 試劑盒
本發明提供適劑盒以治療或預防PCD或其症候。於一具體例中，試 劑盒包括包含有效量的雷帕黴素或其類似物的醫藥包裝物。於其它具 體例中，所述試劑盒包括雷帕黴素與11-順式視黃醇或9-順式視黃醇。 於另一具體例中，所述試劑盒包括有效量的法尼基轉移酶抑制劑(例如 FTI-277)。較佳地，所述組合物微單位劑量型式。於一些具體例中， 試劑盒包括無菌容器，且該容器含有治療或預防組合物；該容器可為 盒子、安瓶、瓶、小罐、管、袋、藥包、撕碎包或已為此項技術所知 的其它適合容器型式。該等容器可由塑料、玻璃、層合紙、金屬箔、 或適合載持醫藥品的其它材質。
如果需要時，本發明的組合物或其組合與對具有或處於發展PCD的 風險的個體給藥的指示一起提供。 一般而癌，所述指示將包含有關用 於治療或預防PCD的化合物的使用情報。於其它具體例中，所述指示包括至少下述一者化合物或化合物組合的敘述；用於治療PCD或其 症候的劑量排程與給藥；注意事項；警告；指示；窗口指示；過度劑 量情報；副作用；動物藥動學；臨床研究；及/或參考文獻。所述指示 可直接印刷於容器(有容器時)，或作為標籤應用於容器，或作為個別 紙張、小冊、或夾頁應用至或與容器。
下述實施例提供用於說明本發明，而非限制本發明。熟悉此項技術 領域者將了解下述所提供的具體結構物可使用多種方法變化，只要與 上述發明一致性者且保留化合物或其組合的重要性質。
實施例
視網膜色素變性(RP)為PCD包括導致感細胞光受體死亡的遺傳性 視網膜異常的異源族群。光受體的死亡導致夜盲以及由於患有視網膜 色素變性患者的周邊視力的損失進展所引起的後續的視力窄化。具有 常染色體顯性遺傳視網膜色素變性(ADPR)的患者的20致25%於視紫質 基因有突變，最常見的突變為P23H。 P23h突變導致無法與11-順式視 黃醇結合的錯誤摺疊蛋白質。錯誤摺疊P23H蛋白質保留於細胞中而形 成凝集物(Saliba等人2002. JCS 115: 2907-2918; Illing等人2002. JBC 277: 34150-34160)。此凝集物行為分類某些RP突變，包括P23H， 為蛋白質構像紊亂症(PCD)。
編碼囊胞性纖維穿膜導通調節子(CFTR)的基因缺陷引起囊胞性纖 維症，其位另一PCD。囊胞性纖維症最常見於高加索人種，美國約有
30， ooo囊胞性纖維症患者。形成cr通道的CFTR於許多器官中為上皮cr 運送系統的重要組成，包括腸、胰臟、肺、汗腺與腎臟。於cr分泌腸 上皮細胞中，"—經由位於基側膜的討^-}(+-2cr共運子進入細胞且經由
CFTR存在於頂端膜；接著滲透水分。編碼CFTR基因的缺陷減低其Cl—運
送能力或其細胞表面表達濃度而引起囊胞性纖維症。此氯運送的缺陷 導致受損的空氣通道分泌物的清潔以及容易受到細菌感染。雖然囊胞 性纖維症為多系統疾病，呼吸衰竭為死亡的主要原因。 雖然下述實施例直接使用特定的突變蛋白質以鑑定化合物增強突
變性視蛋白或CFTR蛋白質的降解，但本發明不為此所限。化合物經鑑 定為有用於選擇性增強細胞中錯誤摺疊視蛋白或錯誤摺疊CFTR的降解(例如自體吞噬降解)，分別有用於視網膜色素變性或囊胞性纖維症的 治療。該等化合物似乎增強任何錯誤摺疊蛋白質的降解，且一般有用 於實際上任何蛋白質構像疾病的治療。使用於進行下述試驗的方法敘
述於 Noorwez 等人 ，Journal of Biological Chemistry 279:16278-16284 (2004)，其全部內容併入本為作為參考文獻。 實施例l:自體吞噬誘發導致錯誤摺疊蛋白質的降解
使用HEK293四環黴素誘發的穩定細胞株表達P23H或野生型視蛋 白，巨自體吞噬由胺基酸耗竭或由雷帕黴素暴露所誘發。第IA圖顯示 自體吞噬由胺基酸耗竭單獨(4至6行)或由雷帕黴素(7至9行)或由氮 基酸耗竭與雷帕黴素暴露的組合(10至12行)誘發時，野生型視蛋白的 免疫墨點降解圖。第IB圖於試驗的時間歷程中比較野生型視蛋白的相 對量且顯示於自體吞噬誘發的24小時歷程中，野生型視蛋白的濃度主 要未改變。相對地，細胞中當自體吞噬經由任何該等方法誘發時，P23H 視蛋白的量快速地降低(第1C圖)。P23H視蛋白的降解圖(第1D圖)顯 示當自體吞噬由胺基酸耗竭所誘發時，33%的錯誤摺疊視蛋白於2小時 內降解(第1D圖，方±央)。當自體吞噬由雷帕黴素所誘發時，46%的蛋 白質於治療的6小時內降解(第1D圖，三角形)。當胺基酸耗竭與雷帕 黴素治療合併時，降解進一步增強(第1D圖，圓形)，其中幾乎52%的 錯誤摺疊視蛋白於2小時內降解且81%於12小時後降解。
實施例2:自體吞噬特定地降解錯誤摺疊蛋白質
為了測定此效果由蛋白酶體抑制劑調控或僅由自體吞噬調節，檢測 細胞中P23H降解，其中自體吞噬於蛋白酶體抑制劑或自體吞噬抑制劑 的存在下誘發。3-甲基腺苷(自體吞噬抑制劑)與MG132(蛋白酶體抑制 劑)於自體吞噬誘發時間添加至細胞培養基。第1F圖顯示3-MA於氨基 酸耗竭的細胞中抑制P23H降解。第1G圖顯示蛋白酶體抑制劑(MG132) 對P23H視蛋白降解無效果(第1D圖)。該等研究顯示自體吞噬特異地 降解錯誤摺疊的P23H視蛋白。
實施例3:雷帕黴素增強錯誤摺疊蛋白質的自體吞噬先前研究顯示11-順式視黃醇作用為藥動學伴隨子有助於P23H視蛋 白^的摺疊與穩定性。給藥U-順式視黃醇使多數的P23H蛋白質匯集至
細胞表面^，於該處其與11-順式視黃醇結合形成視紫質。當11-順式
視黃醇於自體吞噬誘發時給藥，P23H降解的程度未受改變(第1E圖4 至6行)。然而，由於11-順式視黃醇增加正確摺疊蛋白質的濃度且雷 帕黴素增強任何殘餘錯誤摺疊蛋白質的降解，似乎合併給藥11-順式視 黃醇與雷帕黴素用於眼部PCD的治療具有增強的臨床療效。
於培養基補充有或無胺基酸的視紫質濃度類似(第1E圖1至3行， 4至6行)。於胺基酸耗竭中使用11-順式視黃醇治療的細胞中P23H蛋 白質的降解圖與表達野生型視蛋白的細胞或未接受11-順式視黃醇的 P23H視蛋白過度表達的細胞的降解圖比較。於11-順式視黃醇存在時， 相較於表達野生型視蛋白的細胞或無11-順式視黃醇存在的P23H視蛋 白過度表達的細胞P23H蛋白質降解顯示中度降解圖。
有趣地，單獨使用雷帕黴素治療誘發P23H視紫質的快速降解，無 論其是否單獨給藥或與胺基酸匱乏的細胞合併(第1F圖，7至9行，10 至12行)。於11-順式視黃醇存在時的P23H降解圖類似培養於正常條 件(第1F圖，鑽石形)或培養於胺基酸耗竭培養基(第1F圖，'方形)的 細胞。當無ll-順式視黃醇存在的雷帕黴素給藥觀察到增強的降解(第 1F圖，三角形)。接近32。/。的P23H蛋白質於12小時內降解。當雷帕黴 素對胺基酸肌餓細胞給藥時，未觀察到進一步的視紫質降解的增加。 事實上，雷帕黴素對胺基酸耗竭細胞的給藥類似於單獨雷帕黴素處理 的效果。幾乎3W的P23H蛋白質於2小時內降解(第1F圖，圓形)。因 此，由雷帕黴素所誘發的自體吞噬，於11-順式視黃醇存在時選擇性地 增加P23H蛋白質降解。
實施例4:自體吞噬誘發所引發於mTOR磷酸化的特徵性變化
mTOR為哺乳動物雷帕黴素標靶，且mTOR濃度於自體吞噬細胞中特 徵性為降低。為了確認使用上述方法所誘發的自體吞噬，於胺基酸耗 竭細胞與接受雷帕黴素的細胞中特徵化為mTOR磷酸化。如預期的，於 胺基酸耗竭細胞與接受雷帕黴素的細胞中，自體吞噬誘發後觀察到磷 酸化mTOR的量降低。自體吞噬誘發特徵化於表達野生型或P23H視蛋白的細胞，以及亦給藥11-順式視黃醇的細胞。由于于自體吞噬狀況下， Bip與鈣聯蛋白(藉由未摺疊蛋白質回應(UPR)而向上調控的伴隨子)與
Hsp70(藉由熱休克回應(HSR)而向上調控的伴隨子)未變化，故此磷酸 化的增加為對mTor有特異性。於藉由胺基酸匱乏或雷帕黴素處理所誘 發的自體吞噬後，三個伴隨子的量歷時保持恆定(第1H圖、第II圖)。
為了測定自體吞噬是否提供錯誤摺疊蛋白質降解的一般機制，將突 變性囊胞性纖維穿膜導通調節子(CFTR)蛋白質進行特徵化。CFTR為 cAMP-活化的氯離子通道表達於上皮細胞的頂部膜。如同P23H， CFTR 為多源膜蛋白。該等多源蛋白質具有許多a螺旋穿膜段。於CFTR的突 變影響其功能所需的製造、處理與運送至細胞質膜的能力。
野生型CFTR (第2圖)與突變型CFTR A F508 (第2C圖)蛋白質表達於 BHK穩定細胞株。經由胺基酸耗竭、雷帕黴素處理或雷帕黴素處理與氨 基酸耗竭的組合於表達野生型CFTR或突變性CFTR蛋白質的細胞中誘 發自體吞噬(第2A圖)。雖然自體吞噬誘發不影響野生型CFTR蛋白質 濃度(第2B圖)，回應於胺基酸耗竭、雷帕黴素處理或雷帕黴素處理與 胺基酸耗竭的組合(第2C圖)的自體吞噬，AF508蛋白質(第2D圖)， 進行快速降解。降解圖顯示胺基酸匱乏於12小時內降解約34%的^ F508蛋白質(第2D圖，三角形)，而雷帕黴素處理於12小時候引起50% 的蛋白質降解(第2D圖，方形)。當胺基酸匱乏與雷帕黴素處理組合時， 降解更大。幾乎75%的突變性蛋白質於處理的6小時內降解以及80%於 處理12小時後降解(第2D圖，圓形)。該等觀察顯示自體吞噬選擇性 地降解錯誤摺疊AF508蛋白質。於表達野生型或突變型CFTR蛋白質的 細胞誘發自體吞噬後，mTOR磷酸化降低。觀察到伴隨子(Bip、鈣聯蛋 白與hsp70)的濃度無差異。第2E圖與第2F圖為顯示於雷帕黴素的在 或不存在下，培養於正常培養基或培養於胺基酸耗竭培養基的細胞中， mTor磷酸化(第2E圖)與鈣聯蛋白、鈣網蛋白、Hsp70或Bip蛋白質表 達的免疫墨點分析圖。
實施例5:自體吞噬標記於自體吞噬誘發後與錯誤摺疊蛋白質的共定 位自體吞噬誘發可使用電子顯微鏡鑑定細胞中自體吞噬液泡(AVs)的
存在而偵測。P23H細胞於正常培養基中含有一些AVs，但當細胞培養 於胺基酸耗竭培養基時，該液泡數目顯著增加(第5圖)。
為了測定錯誤摺疊蛋白質是否與自體吞噬標記共定位，表達野生型 (第3A圖)或突變性P23H視蛋白(第3B圖)的細胞進行Atg7、 LC3與 Lampl自體吞噬標記染色。細胞與試蛋白特異的與自體吞噬標記特異的 抗體培養後誘發自體吞噬。野生型視蛋白蛋白質存在於細胞膜，而P23H 形成細胞內凝集物。相同的自體吞噬標記於表達野生型(第4A圖)或突 變性AF508 CFTR蛋白質(第4B圖)的B服細胞中檢測。於該等細胞中， AF508 CFTR蛋白質未形成可目視的凝集物。野生型CFTR蛋白質於細 胞膜以及細胞內觀察到(第4A圖)，而△ F508仍保留於ER (第4B圖)。 第5A至5C圖為顯示P23H凝集物、溶酶體與自體吞噬細胞的電子顯微 鏡圖。
使用Atg7免疫螢光染色顯示與兩突變性蛋白質共定位的點狀染 色。Atg7與P23H的共定位顯示於第3B圖以及與AF508的共定位顯示 於第4B圖。Atg8亦與兩突變性蛋白質共定位染色。Atg8顯示與P23H 的錯誤摺疊蛋白質凝集物共定位的點狀染色(第3B圖)。Atg8染色亦與 保留於ER的AF508蛋白質共定位(第4B圖)。該等觀察進一步支持自 體吞噬對於突變性多源蛋白質(例如P32H與AF508)的降解的重要性。
總結，自體吞噬途徑特異地降解錯誤摺疊的多源蛋白質，例如P23H 與AF508而對野生型蛋白質具有非常小的影響。由於野生型與突變性 視蛋白蛋白質表達於人類胚胎腎細胞株而野生型與突變性CFTR蛋白質 表達於嬰兒倉鼠腎細胞株，此結果不依賴於使用於表達突變性蛋白質 的細胞株。
自體吞噬可使用電子顯微鏡目視。於表達P23H視蛋白的細胞中觀 察到雙重膜自體吞噬液泡的數目增加。自體誘發後，該等細包含有P23H 視蛋白的大的凝集物或小的未集結的凝集物。亦觀察到深的酸性磷酸 酶染色的溶酶體相關於AV's與凝集物。不欲受制於一實際理論，此可 能顯示溶酶體途徑於錯誤摺疊視蛋白的降解的重要角色。
自體吞噬標記與錯誤摺疊P23H視蛋白及AF508蛋白質共定位。 Atg7為編碼形成AVs所需要的組裝El泛素-活化酵素蛋白質的關鍵自體吞噬基因。Atg7促進Atg8(為與微管蛋白相關的蛋白質輕鏈3)對形 成AVs的隱蔽膜的脂質的結合。Atg8存在於自體吞噬體的早期與後期 兩者的膜。Atg7及Atg8與P23H及A F508蛋白質的不同的點狀染色建 議AVs對於錯誤摺疊蛋白質降解的角色。
實施例6:雷帕黴素處理於視網膜色素變性增強視黃醇功能
表達具有P23H突變的突變性老鼠視蛋白的基因轉殖小鼠，進行類 似於視網膜色素變性患者觀察到的病生理變化的快速進展的光受體退 化。與P23H異源突變性小鼠的活體內研究顯示雷帕黴素處理於3個月 時程救贖視黃醇功能(第6圖)。
實施例7:雷帕黴素於黃斑變性增強視黃醇功能
累積於視黃醇色素上皮(RPE)細胞的雙-類視黃醇螢光團作為褐脂 質組成，被認為對嚴重的斯塔爾加特病的RPE細胞損失有責任，斯塔 爾加特病為黃斑變性的早髮型，且亦可參予年齡相關的黃斑變性的病 原學。於黃斑變性老鼠模式的活體內研究顯示於具有與斯塔爾加特病 相關的ABCR基因的一缺陷版本的Abcr異源突變性小鼠中，雷帕黴素 處理救贖視黃醇功能。ABCR基因編碼rim蛋白質(RmP)，為表達於光受 體外節視盤邊緣的ATP-結合-卡匣轉運子。
實施例8: FTI277誘發P23H視紫質的快速降解
如同雷帕黴素所致結果，使用法尼基蛋白質轉移酶抑制劑，FTI277， 甲基{N- [2-苯基-4-N [2 (R) -氨基-3-巰基丙基氨基]苄醯基]}-蛋氨酸 (Calbiochem)，誘發P23H視紫質的快速降解(第8圖)。如同雷帕黴素 所致結果，FTI277增強自體吞噬，以及FTI277有用於蛋白質構像疾 病的處理。
實施例9: FTI-277刺激P23H視蛋白的降解
為了研究FTI-277對突變性視蛋白濃度的效果，表達P23H視蛋白 的HEK293細胞使用不同濃度(1、 5、 10與50 u M)的FTI-277培養。於 50uM觀察到P23H視蛋白的時間依賴性降解。於10M偵測到FTI-277無效果(第9A圖)。當相較於雷帕黴素時，7(^的P23H視蛋白於雷帕黴 素處理後12小時消失，而FT工-277於該時間歷程中導致50%的P23H 視蛋白損失(第9B圖)。
實施例10: FTI-277不誘發UPR/HSR
使用FTI-277處理後，分析參予未摺疊蛋白質響應(UPR)的內質網 伴隨子(鈣聯蛋白與鈣網蛋白)，或與熱休克響應(HSR)相關的細胞質伴 隨子(Hsp70與Hsp90)的濃度差異。FTI-277位影響該二響應，建議 FTI-277誘發P23H視蛋白的降解排除UPR與HSR兩者(第10圖)。
實施例11: FTI-277處理阻隔mT0R/S6K信號
如預測的，如果此藥物抑制Rheb活性，FTI-277有效地抑制mTor 與S6激酶的磷酸化(第11A與11B圖)。磷酸化的mTor與S6激酶可見 於胺基酸與血清饋入的細胞。如同使用雷帕黴素處理，FTI-277誘發 mTOR的磷酸化，其與胺基酸與血清匱乏合併時進一步增強(第11A圖)。 類似地，S6激酶的磷酸化於使用FTI-277或雷帕黴素處理的細胞中劇 烈的減低(第11B圖)。相對地，於HEK293細胞中Akt磷酸化的刺激不 受FTI-277處理的影響，建議Ras活性未受影響，然而於MAPK磷酸化 觀察到些許增加，類似於Basso等人，J. Biol. Chem. 280， 31101-31108, 2005 (第11C圖)。
實施例12:於FTI-277處理中使用Atg7與Atg8的P23H視蛋白的共定 位
雷帕黴素誘發的P23H視蛋白降解藉由自體吞噬調控，FTI-277降 解處理也經由自體吞噬。P23H視蛋白凝集物與己知自體吞噬體標記， Atg7與Atg8的關係，藉由免疫螢光顯微鏡分析。該等標記於生長於完 整培養基的未處理細胞中正常地不與P23H定位(第12A與第12B圖)。 於FTI-277處理中觀察到該二標記與P23H的共定位顯著增加(第12A 與第12B圖)。Atg7與Atg8回應於P23H視蛋白凝集物的定位較佳藉由 共軛焦顯微鏡觀察(第12C圖)。Atg7的點顯示與P23H視蛋白凝集物簇 集，與P23H視蛋白共定位。同樣地，某些Atg8的點與P23H視蛋白凝集物有增強的共定位，然 而，其餘的點仍位於凝集物周圍。Atg7與Atg8蛋白質存在於凝集物內 與周圍，支持其於P23H視蛋白降解的自體吞噬角色。
實施例13:由FTI-277的自體吞噬誘發
該等結果顯示FTI-277活化自體吞噬。因此，使用溶酶體探針 (lysotracker)觀察細胞中溶酶體液泡的數目與尺寸分析對FTI-277的 自體吞噬回應。當細胞使用雷帕黴素或FTI-277處理細胞時，觀察到 溶酶體的數目與尺寸的增加(第13A圖)。其次，使用電子顯微鏡估算 於未處理與FTI-277處理的表達P23H視蛋白的HEK293細胞的自體吞 噬回應。如藉由溶酶體探針所見，FTI-277處理的細胞含有許多大的含 有溶酶體酸性磷酸酶的自體吞噬液泡(第13B圖)。再者， 一些液泡呈 現處於鯨吞大的細胞質凝集物的步驟(第13B圖)。於形態定性中，相 較於未處理的細胞，發現AVs於FTI-277處理的細胞中的劃分容積增 加4至6倍(第13C圖)。該數據建議FTI-277於服K293細胞促進自體 吞噬回應。
也研究FTI-277於穩定地表達自體吞噬標記(GFP-LC3)的HuH7肝細 胞的效果。於饋入細胞中，GFP-LC3優先地發現擴散於細胞質。當該等 細胞使用FTI-277處理時，GFP-LC3定位於與自體吞噬液泡一致性的數 個結構物以及發生自體吞噬(第14圖)。該等研究顯示於使用FTI-277 處理的細胞中，自體吞噬劇烈地向上調控。
P23H視蛋白表達HEK293細胞中自體吞噬的誘發，使用阻隔自體吞 噬的P3-激酶抑制劑(3-甲基腺苷；3-MA)檢測。於FTI-277存在下，3-MA 處理預防視蛋白的降解，此效果未見於單獨使用FTI-277處理的細胞 (第15A圖)。為了進一步確認P23H視蛋白為自體吞噬的，使用蛋白酶 體抑制劑(MG132)。於FTI-277與MG132與單獨FTI-277的存在下，P23H 視蛋白降解具有類似的動力學，建議蛋白酶體降解於此途徑的角色受 到限制(第15B圖)。
法尼基轉移酶抑制劑(FTIs)原始設計為阻隔Ras致癌蛋白質的作 用。Ras活性取決於法尼基化，為連結法尼基類異戊二烯膜錨定至蛋白 質的後轉譯修飾。法尼基轉移酶催化15-碳異戊二烯脂質由法尼基二磷酸鹽至多種蛋白質受質的半胱氨酸殘基的轉移。法尼基轉移酶辨識受 質羧基端的CAAX盒。
Rheb為鳥苷酸結合蛋白質與GTPase。 Rheb蛋白質含有Gl-G5盒， 其為參予GTP的辨識與水解的序列的短鏈(Bourne等人，(1990) Nature 348， 125-132)。再者，Rheb蛋白質結束於法尼基化所需要的 CAAX(CSVM)部位。於哺乳動物細胞中，已建立Rheb活化S6K的能力。 由於Rheb突變缺乏CAAX部位不能或化S6K，此功能依賴於法尼基化 (Castro等人，J. Biol. Chem. 278， 32493—32496， 2003; Tee等人， Curr. Biol. 13， 1259-1268， 2003)。再者，己建立FTIs，如同FTI-277， 完全地阻隔Rheb的烯化作用(prenylation) (Basso等人，J. Biol. Chem. 280， 31101-31108， 2005)。 Rheb不進行香葉醯香葉醯化 (geranylgeranylation)。除了 Rheb有其它FTIs的標耙。研究顯示如 同K-Ras4B的蛋白質，由於當法尼基化受到抑制時期進行香葉醯香葉 醯化而顯示對FTIs的阻抗性[(22， 23)。該等研究建議Rheb較其它進 行法尼基化的蛋白質為FTIs的更特異的標靶。此外，Akt磷酸化不受 FTI-277的影響，建議FTI-277不影響Ras活性，Rheb為胰島素/T0R/S6K 信號途徑的組成(Cast'ro等人，J. Biol. Chem. 278， 39921-39930， 2003; Tabancay等人，J. Biol. Chem. 278， 39921-39930， 2003; Tee 等人，Curr. Biol. 13， 1259-1268 24， 2003; Inoki等人,Genes Dev. 17， 1829-1834， 2003; Garami等人，Mol. Cell 11， 1457-1466， 2003)。 如本文所報導，觀察到使用FTI-277的mT0R與S6K的去磷酸化，與Rheb 的抑制一致。當自體吞噬藉由雷帕黴素的使用於細胞中誘發時，觀察 到mT0R與S6K的磷酸化的類似減低。除了抑制mTOR，該等結果顯示藉 由FTI-277的處理可於細胞誘發自體吞噬，其阻隔Rheb進一步的mTOR 上遊(第16圖)。
使用50tiM的FTI-277處理P23H視蛋白表達細胞，如同雷帕黴素 處理，誘發突變性視蛋白的降解。使用對自吞噬體標記Atg7與Atg8 的抗體的免疫螢光研究確認於該等細胞誘發自體吞噬。Atg7為編碼形 成AVs所需要的組裝El泛素-活化酵素蛋白質的關鍵自體吞噬基因 (Tanida等人，(2001) J. Biol. Chem. 276， 1701-1706。 Atg7促進 Atg8(為與微管蛋白相關的蛋白質輕鏈3)對形成AVs的隱蔽膜的脂質的結合(Ohsunii等人，7feL 2， 211-216， 2001;
Kabeya等人，,5y. 117， 2805-2812， 2004)。兩標記與P23H 視蛋白共定位。再者，超音波研究為使用電子顯微鏡解析當使用 FTI-277處理時細胞中AVs的增加表達。於某些微影像中，觀察到AVs 鯨吞細胞質凝集物。再者，形態分析顯示使用FTI-277處理的細胞中 AVs的劃分容積增加6倍，因此確實建立該等細胞中自體吞噬的誘發。 總結，該等數據建議自體吞噬途徑不僅可藉由使用雷帕黴素阻隔 mTOR而受到刺激，亦可藉由使用小分子法尼基轉移酶抑制劑(例如 FTI-277)調控mT0R上遊成分而受到刺激。如同其它FTIs， FTI-277降 低Rheb的法尼基化，因而去活化此G-蛋白。該等研究開啟使用FTIs 治療各種蛋白質構像紊亂(PCDs)的可能性，由於自體吞噬參予降解突 變性、凝集的蛋白質，其關聯於多種神經退化疾病，包括帕金森氏病 (Cuervo等人，Science 305， 1292-1295， 2004)、亨延頓氏舞蹈症 (Ravikumar等人Nat. Genet. 36， 585- 595， 2004)。刺激於亨延頓 氏舞蹈症的自體吞噬(Ravikumar等人Nat. Genet. 36， 585- 595， 2004)，於細胞培養以及老鼠模式兩者中，以及常染色體顯性遺傳視網 膜色素變性導致累積凝集物的損失。同時，FTIs用於癌症的臨床試驗 (第II期與第III期)的目前使用中，進一步確信於人類與測試動物中 此化合物的毒性消失。FTIs藥物可提供雷帕黴素的替代療法，特別是 增強由自體吞噬的蛋白質凝集物的移除。
上述試驗使用下述方法及材料實施。 哺乳動物細胞培養
野生型與P23H視蛋白表達於HEK293四環黴素誘發的穩定細胞株。 於37。C、 5.0%0)2存在下，細胞生長於補充有10%加熱去活化胎牛血清 (Sigma)、與抗生素-抗真菌素溶液(Invitrogen， San Diego， CA)、保 米黴素(Cayla， Toulouse, France) 、 zeocin醣蛋白抗生素(Invitrogen: San Diego, CA)的含有高葡萄糖的Dulbecco's modified Eagle's培養 基(Invitrogen， San Diego, CA)。細胞中視蛋白合成界由四環黴素(1 U g/ml)的添加而誘發。嬰兒倉鼠腎(BHK)細胞株穩定地表達野生型與 具有C-端HA抗原決定基的A 508CFTR變異株(CFTR-HA)(參照Sharma eta[lambda].， J Cell Biol. 2004 164(6) :923— 33)。於37。C、 5. 00線 存在下，細胞生長於以1:1的比例具有10。/。FBS的DMEM/F12 (Invitrogen San Diego, CA)中。
HuH7肝細胞穩定地以pGFP-LC3轉染(Ogawa等人， Science307(5710) : 727 - 731， 2005)使用脂質最適化試劑盒，the PerFect lipid (pFx_3)， 由Invitrogen (San Diego， Calif.)貝勾得。 PFX-3 (Invitrogen)根據製造商的步驟。於0. 5mg/ml的G418存在下 生長的族落經單離、擴增與藉由螢光顯微鏡與西方墨點法篩選GFP-LC3 表達。
自體吞噬的誘發
藉由將細胞培養於胺基酸耗竭培養基或使用雷帕黴素(50mM)處理 細胞，或兩者而於細胞中誘發自體吞噬。細胞培養於自體吞噬誘發條 件下2、 6或12小時。於指定的時間點，於蛋白酶抑制劑(完全蛋白酶 抑制齊U混合物錠劑)(Roche Molecular Biochemicals， Mannheim, Germany)的存在下，於4。C將細胞溶解於1%正-十二烷基3 -麥芽糖苷 (DM) (Anatrace， Maumee， 0H)1小時。細胞於Beckman高速離心機以 36， OOOrpm於4匸離心30分鐘。收集溶解物進行免疫墨點分析。
SDS凝膠電泳與免疫墨點分析
細胞溶解物於10%SDS聚丙烯醯胺凝膠進行電泳且轉移至 Immobilon-NC (Millipore， Billerica， MA)硝基纖維素膜。該膜於室 溫與以1:1稀釋於PBST(PBS具有0. 1% triton X-100， pH 7. 4)的市售 封阻緩衝液(Li-Cor， Lincoln, Nebraska)培養1小時，接著與指定的 一級抗體培養l小時。墨點各於PBST中清洗3次各5分鐘，與真近紅 外光染劑，IRDye800-結合的二級抗體(Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA)培養1小時。最後膜再以PBST清洗3次且 於Oddyssey紅外光掃描儀(Li-Cor, Lincoln, Nebraska)掃描。免疫 墨點的訂量使用Licor軟體進行。 一級抗體包括抗視蛋白的抗體， HA-tag (Covance Princeton, NJ) 、 mT0R、磷酸化mTOR (Upstate Charlottesville, VA)、鈣聯蛋白、hsp70 (Stressgen， Victoria, BC，CA)、Bip (BD PharMingen, SanDiego， CA)抗微管蛋白(Sigma Chemical St. Louis， Missouri), 1D4 (University of British Columbia)、 Akt、 phospho-Akt、 S6K、 phospho-S6K、 MAPK與phosphor-MAPK (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)。
免疫螢光法
細胞生長於載玻片且固定於4%三聚甲醛。接著以50m麗HXl猝息， 細胞以PBS清洗且與指示一級抗體於室溫培養1小時。細胞以PBS清洗5 次且與二級抗體(TRITC-及FITC-結合)培養1小時。再次清洗細胞且以 含有DAPI的Vectashield安放。 一級抗體包括LC3、 LAMP-1、 Atg7(Dr Dunn)、視蛋白、Atg72°、 Atg8與HA-tag。細胞使用 Zeiss Axiophot顯微鏡觀察。
使用溶酶追蹤子(Molecular Probe)的染色亦於37"C於活細胞進 行。共軛焦影像使用Leica TCS SP2 A0BS Spectral Confocal Microscope放大倍數63X 。
老鼠模式
abcr +/-小鼠由Mata等人描述於Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2001;42:1685-1690。
表達P23H視蛋白的小鼠由Liu等人描述於Journal of Cell Science 110， 2589-2597 (1997)。
活體內雷帕黴素處理
sk^/-小鼠由四個月大開始使用每周20mg/kg的雷帕黴素處理。 雷帕黴素由腹腔內注射給藥。
異合子P23H基因轉殖鼠於由21日大開始每周使用雷帕黴素處理。
視網膜電圖(Electroretinography)
於ERG前老鼠於黑暗中適應24小時。使用K他命(ketamine)與二 甲苄噻嗪(xylazine)的混合物昏迷老鼠。藉由體重決定劑量。將老鼠眼睛使用普魯柏卡因(proparacaine)液滴與老鼠眼睛麻木且使用 AK-dilate膨脹。接著將老鼠置於機器(UTAS-E 2000)，於期厚之插入 接地電極，另一電極插入頸中，使用一對電極由各眼紀錄ERG。得到基 線讀值後，於20、 10及0dB測量ERG。測量每個月的ERG且測定B-波 幅度。
FTI-277處理
於50yM使用FTI-277 (Calbiochem)。在洗除四環黴素後，細胞 處理0、 2、 6與12小時後，於含有1%正十二垸基_ 0-麥芽糖苷(DM) (Anatrace)於蛋白酶抑制劑(完全蛋白酶抑制劑混合物錠；Roche Molecular Biochemicals)的存在下於4""C溶解1小時。作為自體吞噬 的陽性對照，細胞使用雷帕黴素(50nM)處理，接著洗除四環黴素。溶 解物於Beckman車高速離心機以36， OOOrpm於4。C離新10分鐘。收即 上清液以及進行免疫墨點分析。亦使用阻隔自體吞噬的3-甲基腺苷 (3-MA) (lOmM) (Sigma Chemical (St. Louis, Missouri))以及MG132 (25[mu]M) (Sigma Chemical (St. Louis， Missouri))。
電子顯微鏡
P23H視蛋白表達細胞生長於ACLAT片於24_孔盤。視蛋白產生為界 由四環黴素添加誘發48小時且在四環黴素移除後使用FTI-277處理細 胞6小時。接著使用PBS清洗，使用2%三聚甲醛、2%戊二醛於0. 1M 二甲砷酸鈉緩衝液，pH7.4於4。C固定v30分鐘，以及如前所述(31) 進行CMPase細胞化學處理。AVs的形態定性使用Image J軟體T-test 分析以每秒20電子微影像的條件完成且P-值(雙尾顯著)於0. 05以下 或等於0. 05認為顯著(標記為星號)。
其它具體例
由上文敘述，應可了解變化與修改可將本文所述的內容調整以適合 各種用途與狀況。某些具體例亦包含於前文所述權利要求的範疇中。本文的各種定義的組件所列舉的引述，包括列舉組件的任何單獨組 件或組合(或次組合)所變化的定義。本文具體例的引述包括任何單一 具體例或具體例與其它具體例或其一部分的組合的具體例。
本說明書述及所有專利與文獻，即使各獨立的專利與文獻為具體地 與獨立地的指明，其全部內容皆併入於本文作為參考文獻
參考文獻
1. S. M. Noorwez 等人，Journal of Biological Chemistry 279: 16278—16284 (2004)
權利要求
1.一種用於個體預防或治療蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，所述的方法包括對所述的個體給藥有效量的增強自體吞噬蛋白質降解的化合物。
2. 根據權利要求1的方法，其中所述化合物抑制哺乳動物雷帕黴素耙 蛋白(mTOR)或抑制腦中富集的Ras同源體(Rheb)。
3. 根據權利要求2的方法，其中所述化合物為雷帕黴素或其類似物。
4. 根據權利要求2的方法，其中所述化合物為法尼基轉移酶抑制劑。
5. 根據權利要求4的方法，其中所述法尼基轉移酶抑制劑為FTI-277。
6. 根據權利要求l的方法，其中所述PCD選自下述所成組群cil-抗 胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纖維症、亨延頓氏舞蹈症、帕金森氏病、 阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、癌症及庫賈氏症。
7. 根據權利要求l的方法，其中所述PCD為囊胞性纖維症。
8. 根據權利要求l的方法，其中所述PCD為眼睛的PCD且選自下述所 成組群視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、青光眼、角膜營 養不良、視網膜劈裂症、斯塔爾加特病、常染色體顯性遺傳脈絡膜 小疣及貝斯特氏黃斑營養不良。
9. 根據權利要求8的方法，其中所述PCD為視網膜色素變性或年齡相 關性黃斑變性。
10. 根據權利要求8的方法，其中所述年齡相關性黃斑變性為溼性型或 乾性型。
11. 根據權利要求8的方法，其中所述的方法進一步包括對個體給藥ll-順式-視黃醇、9_順式-視黃醇或11-順式-視黃醇的7-環鎖異構物。
12. —種用於個體預防或治療眼的蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，所述的方法包括對所述的個體給藥有效量的增強自體吞噬蛋白質降 解的化合物。
13. 根據權利要求12的方法，其中所述PCD為眼睛的PCD且選自下述所成組群視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、青光眼、角膜營養不良、視網膜劈裂症、斯塔爾加特病、常染色體顯性遺傳脈絡 膜小疣及貝斯特氏黃斑營養不良。
14. 根據權利要求13的方法，其中所述PCD為視網膜色素變性或年齡 相關性黃斑變性。
15. 根據權利要求14的方法，其中所述年齡相關性黃斑變性為溼性型 或乾性型。
16. 根據權利要求12的方法，其中所述化合物抑制哺乳動物雷帕黴素 靶蛋白(mTOR)或抑制腦中富集的Ras同源體(Rheb)。
17. 根據權利要求12的方法，其中所述化合物為雷帕黴素或其類似物。
18. 根據權利要求12的方法，其中所述化合物為法尼基轉移酶抑制劑。
19. 根據權利要求12的方法，其中所述法尼基轉移酶抑制劑為FTI-277。
20. 根據權利要求12的方法，其中所述的方法進一步包括對個體給藥 l卜順式-視黃醇、9-順式-視黃醇或11-順式-視黃醇的7-環鎖異構
21. —種用於個體預防或治療視網膜色素變性或黃斑變性的方法，所述 的方法包括a) 對所述的個體給藥增強自體吞噬蛋白質降解的化合物；與b) 給藥11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇，其中所述的ll-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與化合物對所述個體為同時或彼此於 14日內給藥足量以治療或預防視網膜色素變性或黃斑變性。
22. 根據權利要求21的方法，其中所述化合物抑制哺乳動物雷帕黴素 靶蛋白(mTOR)或抑制腦中富集的Ras同源體(Rheb)。
23. 根據權利要求22的方法，其中所述化合物為雷帕黴素或其類似物。
24. 根據權利要求22的方法，其中所述化合物為法尼基轉移酶抑制劑。
25. 根據權利要求24的方法，其中所述法尼基轉移酶抑制劑為FTI-277。
26. 根據權利要求21的方法，其中所述11-順式-視黃醇為11-順式-視 黃醇的7-環鎖異構物。
27. 根據權利要求1至26的任一項的方法，其中所述個體包括影響蛋 白質摺疊的突變。
28. 根據權利要求27的方法，其中所述突變在視蛋白中。
29. 根據權利28的方法，其中所述視蛋白包括P23H突變。
30. 根據權利要求1至26的任一項的方法，其中所述降解為選擇性降 解錯誤摺疊蛋白質。
31. 根據權利要求1至26的任一項的方法，其中所述11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與化合物彼此於5日內給藥。
32. 根據權利要求31的方法，其中所述ll-順式-視黃醇或9-順式-視 黃醇與化合物彼此於24小時內給藥。
33. 根據權利要求32的方法，其中所述11-順式-視黃醇或9-順式-視 黃醇與化合物為同時給藥。
34. 根據權利要求31至33的任一項的方法，其中所述11-順式-視黃醇 或9-順式-視黃醇與化合物為對眼睛給藥。
35. 根據權利要求34的方法，其中所述給藥為眼內給藥。
36. 根據權利要求31至33的任一項的方法，其中所述11-順式-視黃醇 或9_順式-視黃醇與化合物為各自併入組合物以提供其長時間的釋 放。
37. 根據權利要求36的方法，其中所述組合物為微球體、納米球體或 納米乳化物。
38. 根據權利要求36的方法，其中所述長時間的釋放通過藥物傳遞裝 置。
39. 根據權利要求31至33的任一項的方法，其中所述的方法進一步包 括給藥維生素A補充物。
40. —種用於個體預防或治療蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，所述的 方法包括對所述的個體給藥增強自體吞噬的化合物足量以治療或 預防個體的PCD。
41. 根據權利要求40的方法，其中所述化合物抑制哺乳類動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)或抑制腦中富集的Ras同源體(Rheb)。
42. 根據權利要求40的方法，其中所述化合物為雷帕黴素或其類似物。
43. 根據權利要求40的方法，其中所述化合物為法尼基轉移酶抑制劑。
44. 根據權利要求40所述的方法，其中法尼基轉移酶抑制劑為FTI-277。
45. 根據權利要求40的方法，其中所述PCD選自下述所成組群a 1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纖維症、亨延頓氏舞蹈症、帕金森氏病、 阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、癌症及庫賈氏症。
46. 根據權利要求40的方法，進一步包括鑑定患者為具有PCD的步驟。
47. 根據權利要求40的方法，進一步包括測量細胞中錯誤摺疊蛋白質、 自體吞噬標記或自體吞噬液泡的濃度或表達。
48. 根據權利要求40的方法，其中所述PCD為囊胞性纖維症且所述的 方法進一步包括給藥選自下述所成組群的藥劑抗生素、維生素A、 D、 E及K補充物、沙丁氨醇支氣管擴張劑、脫氧核糖核酸酶及依普 洛芬。
49. 根據權利要求40的方法，其中所述PCD為亨延頓氏舞蹈症且所述 的方法進一步包括給藥選自下述所成組群的藥劑氟呱丁苯、吩噻 嗪、利血平、丁苯那嗪、金剛氨及輔酶QIO。
50. 根據權利要求40的方法，其中所述PCD為帕金森氏病且所述的方 法進一步包括給藥選自下述所成組群的藥劑左旋多巴、金剛氮、 甲磺酸溴隱亭、培高利特、阿樸嗎啡、苄絲肼、麥角乙脲、美舒麥 角、麥角乙脲、麥角腈、美金氨、麥角苄酯、吡貝地爾、對羥基苯 乙氨、酪氨酸、苯丙氨酸、馬來酸甲磺酸溴隱亭、馬來酸培高利特、抗組織氨、抗抑鬱劑及單氨氧化酶抑制劑。
51. 根據權利要求40的方法，其中所述PCD為阿耳茨海默氏病且所述 的方法進一步包括給藥選自下述所成組群的藥劑多萘哌齊、利凡 斯的明、加蘭他敏及他可林。
52. 根據權利要求40的方法，其中所述PCD為腎性尿崩症且所述的方法進一步包括給藥選自下述所成組群的藥劑氯噻嗪/鹽酸氯噻嗪、阿米洛利及n引哚美辛。
53. 根據權利要求40的方法，其中所述PCD為癌症且所述的方法進一 歩包括給藥選自下述所成組群的藥劑醋酸阿比特龍、六甲蜜氨、 脫水長春鹼、奧瑞斯坦丁、貝沙羅汀、必卡他氨、BMS184476、 2， 3， 4， 5, S-五氟-N- (3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺醯氨、博來黴素、 N， N-二甲基-L-纈氨醯基-L-纈氨醯基-N-甲基-L-纈氨醯基-N-脯醯 氨基-1-L-脯氨酸-第三丁基醯氨、惡病質素、西馬多丁、苯丁酸氮 芥、環磷醯氨、3， ，4' -二脫氫-4， _脫氧-8， - norvin-長春花鹼 (caleukoblastine)、多西賽他、多西泰素、環磷醯氨、卡鉑、卡 莫司汀(BCNU)、順鉑、念珠藻環肽、阿糖胞苷、達卡巴嗪(DTIC)、 更生黴素、柔紅黴素、海兔毒素、多柔比星(阿黴素)、依託泊甙、 5-氟尿嘧啶、非那留氨、氟他氨、羥基脲及羥基脲紫杉垸、異環磷 醯氨、利阿唑、氯尼達明、洛莫司汀(CCMJ)、雙氯乙基甲氨(氮芥)、 美法侖、羥乙基磺酸米布爾、利索新、司替尼、鏈脲黴素、絲裂黴 素、甲氨蝶呤、尼魯米特、奧那司酮、太平洋紫杉醇、潑尼莫司汀、 丙卡巴肼、RPR109881、磷酸司特目斯汀、黛莫芬、太索內明、紫 杉醇、維甲酸、長春花鹼、長春新鹼、硫酸長春地辛及維氟明。
54. —種增強細胞中錯誤摺疊蛋白質的降解的方法，包括使所述的細胞 接觸有效量的增強自體吞噬的蛋白質。
55. 根據權利要求54的方法，其中所述化合物抑制哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)或抑制腦中富集的Ras同源體(Rheb)。
56. 根據權利要求54的方法，其中所述化合物為雷帕黴素或其類似物。
57. 根據權利要求54的方法，其中所述化合物為法尼基轉移酶抑制劑。
58. 根據權利要求57的方法，其中所述法尼基轉移酶抑制劑為FTI-277。
59. 根據權利要求57的方法，進一步包括鑑定患者為具有PCD的步驟。
60. 根據權利要求54的方法，進一步包括測量細胞中錯誤摺疊蛋白質、 自體吞噬標記或自體吞噬液泡的濃度或表達。
61. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞為眼部細胞。
62. 根據權利要求61的方法，其中所述的方法進一步包括使所述的眼 部細胞接觸11-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇或11-順式-視黃醇的 7-環鎖異構物。
63. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞為上皮細胞。
64. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞包括形成凝集物或纖維的 突變蛋白質。
65. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞包括突變視蛋白。
66. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞包括突變性myocilin蛋白。
67. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞包括突變脂褐質蛋白。
68. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞包括突變e-H3蛋白。
69. 根據權利要求54所述的方法，其中所述細胞為於活體外。
70. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞為於活體內。
71. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
72. 根據權利要求54的方法，其中所述細胞為人類細胞。
73. —種用於治療PCD的醫藥組合物，包括於醫藥可接受的賦型劑中的 mTOR抑制劑或其類似物。
74. —種用於治療眼部PCD的醫藥組合物，包括於醫藥可接受的賦型劑 中的有效量的增強自體吞噬的化合物。
75. 根據權利要求73或74的組合物，其中所述組合物抑制哺乳動物雷 帕黴素靶蛋白(mTOR)或抑制腦中富集的Ras同源體(Rheb)。
76. 根據權利要求73或74的方法，其中所述化合物為雷帕黴素或其類 似物。
77. 根據權利要求73或74的方法，其中所述化合物為法尼基轉移酶抑 製劑。
78. 根據權利要求73或74的方法，其中所述法尼基轉移酶抑制劑為 FTI-277。
79. 根據權利要求74的方法，其中所述組合物進一步含有有效量的11-順式-視黃醇或9H頓式-視黃醇。
80. —種用於治療視網膜色素變性或年齡相關性黃斑變性的醫藥組合物，包括於醫藥可接受的賦型劑中的有效量的11-順式-視黃醇或 9-順式-視黃醇以及有效量的自體吞噬抑制劑。
81. 根據權利要求80的方法，其中所述化合物為雷帕黴素或其類似物。
82. 根據權利要求80的方法，其中所述化合物為法尼基轉移酶抑制劑。
83. 根據權利要求82的方法，其中所述法尼基轉移酶抑制劑為FTI-277。
84. —種用於治療眼部PCD的試劑盒，所述試劑盒包括有效量的11-順 式-視黃醇或9-順式-視黃醇以及有效量的雷帕黴素或其類似物。
85. —種用於治療視網膜色素變性或年齡相關性黃斑變性的試劑盒，所 述試劑盒包括有效量的l卜順式-視黃醇或9-順式-視黃醇以及有效 量的雷帕黴素或其類似物。
86. —種鑑定有用於治療PCD個體的化合物的方法，所述方法包括a) 於活體外表達錯誤摺疊蛋白質的細胞接觸候選化合物；以及b) 相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接 觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患有PCD的個體。
87. —種鑑定有用於治療患有視網膜色素變性或年齡相關性黃斑變性 個體的化合物的方法，所述方法包括a) 於活體外表達錯誤摺疊蛋白質的細胞接觸 i. 11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇；與ii. 候選化合物；以及b) 相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接 觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患有視網膜色素 變性的個體。
88. 根據權利要求87的方法，其中所述11-順式-視黃醇為l卜順式-視黃醇的7-環鎖異構物。
89. —種鑑定有用於治療患有囊胞性纖維症個體的化合物的方法，所述 方法包括a) 於活體外表達錯誤摺疊蛋白質的細胞接觸候選化合物；以及b) 相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患有囊胞性纖維 症的個體。
90. 根據權利要求86至89的任一項的方法，其中所述錯誤摺疊蛋白質 包括突變。
91. 根據權利要求86至89的任一項的方法，其中所述突變在視蛋白中。
92. 根據權利86至89的任一項的方法，其中所述視蛋白包括P23H突 變。
93. 根據權利86至89的任一項的方法，其中所述自體吞噬增強為通過 監控蛋白濃度而測定。
94. 根據權利86至89的任一項的方法，其中所述自體吞噬增強為通過 由監控自體吞噬標記的表達而測定。
95. 根據權利86至89的任一項的方法，其中所述自體吞噬增強為通過 監控自體吞噬液泡的數目而測定。
96. —種用於個體預防或治療蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，所述的 方法包括對所述的個體給藥有效量的增強雷帕黴素或FTI-277生物 活性的化合物。
97. 根據權利要求96的方法，其中所述化合物與雷帕黴素或其類似物 合併給藥。
98. 根據權利要求96的方法，其中所述化合物與FTI-277或其類似物 合併給藥。
99. 根據權利要求96的方法，其中所述PCD選自下述所成組群a 1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纖維症、亨延頓氏舞蹈症、帕金森氏病、 阿耳茨海默氏病、腎性尿崩症、癌症及庫賈氏症。
100. 根據權利要求96的方法，其中所述PCD為囊胞性纖維症。
101. 根據權利要求96的方法，其中所述PCD為眼睛的PCD且選自下述 所成組群視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、青光眼、角 膜營養不良、視網膜劈裂症、斯塔爾加特病、常染色體顯性遺傳 脈絡膜小疣及貝斯特氏黃斑營養不良。
102. 根據權利要求96的方法，其中所述PCD為視網膜色素變性或年齡 相關性黃斑變性。
103. 根據權利要求96的方法，其中所述方法進一步包括對個體給藥11-順式-視黃醇、9H頓式-視黃醇或11-順式-視黃醇的7-環鎖異構物。
104. —種用於個體預防或治療視網膜色素變性的方法，所述的方法包 括a) 對所述的個體給藥雷帕黴素和增強雷帕黴素生物活性的化合 物；與b) 給藥11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇，其中所述的11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與化合物對所述體為同時或彼此於14 日內給藥足量以治療或預防個體的視網膜色素變性。
105. —種用於個體預防或治療蛋白質構象紊亂症(PCD)的方法，所述的 方法包括合併給藥雷帕黴素或其類似物與增強雷帕黴素生物活性的化合物，其中所述雷帕黴素及化合物各給藥足量以治療或預防 個體的PCD。
106. —種用於增強細胞中錯誤摺疊蛋白質降解的方法，所述的方法包 括使細胞接觸有效量的雷帕黴素或其類似物與增強雷帕黴素生物 活性的化合物，其中所述雷帕黴素及化合物各給藥足量以增強該 蛋白的降解。
107. 根據權利要求106的方法，其中所述細胞為眼部細胞。
108. 根據權利要求106的方法，其中所述方法進一步包括使細胞接觸 ll-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇或11-順式-視黃醇的7-環鎖異 構物。
109. —種用於治療眼部PCD的醫藥組合物，包括於醫藥可接受賦形劑 中的雷帕黴素或其類似物與增強雷帕黴素生物活性的化合物，其 中所述雷帕黴素及化合物各呈現足量以治療或預防個體的PCD。
110. —種鑑定有用於治療PCD個體的化合物的方法，所述方法包括a) 在自體吞噬增強劑的存在或不存在下，使活體外表達錯誤摺疊 蛋白質的細胞接觸候選化合物；以及b) 相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接 觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患有PCD的個 體。
111. —種鑑定有用於治療患有視網膜色素變性的個體的化合物的方 法，所述方法包括a) 使活體外表達錯誤摺疊蛋白質的細胞接觸i. 11-順式-視黃醇或9-順式-視黃醇與雷帕黴素；與ii. 候選化合物；以及b) 相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患有視網膜色 素變性的個體。
112.—種鑑定有用於治療患有囊胞性纖維症的個體的化合物的方法， 所述方法包括a) 使活體外表達錯誤摺疊CFTR蛋白的細胞接觸候選化合物與雷帕 黴素；以及b) 相對於對照細胞決定所述細胞中自體吞噬的增加，其中於經接 觸細胞自體吞噬的增加鑑定化合物有用於治療患有囊胞性纖維 症的個體。
全文摘要
本發明的特徵為組合物與方法，該組合物與方法有用於治療或預防藉由增強體內錯誤摺疊蛋白質的降解於個體的蛋白質構象疾病。
文檔編號A01N43/62GK101287370SQ200680023254
公開日2008年10月15日 申請日期2006年4月27日 優先權日2005年4月27日
發明者R·馬爾霍特拉, S·考沙爾, W·A·鄧恩 申請人:佛羅裡達大學研究基金會有限公司