淨化廢水中鉻汙染的間孢囊菌q5-1及用途的製作方法

2024-04-07 14:14:05

專利名稱：淨化廢水中鉻汙染的間孢囊菌q5-1及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於環境微生物技術領域，具體涉及一株對無機六價鉻有還原作用的間孢囊菌Q5-l的篩選及 其在淨化含鉻廢水汙染方面中的用途。
背景技術：
目前重金屬汙染已經成為一個全球性的問題，在重金屬汙染中，鉻作為重金屬中毒性極強的一種汙染 物，其處理和回收更是成為世界各國科學家研究重金屬汙染的重點。鉻是工業上常用的金屬之一，主要用 於電鍍和特種冶煉等方面，另外，鉻鹽也可以用作為工業上的鞍劑、顏料、催化劑、滅黴劑、木材防腐劑 等等，隨著世界工業的不斷發展，越來越多的鉻(VI)被排放到自然環境中，造成了嚴重的環境汙染。
自然環境中通常只有兩種穩定價態出現即三價和六價。六價鉻的毒性比三價鉻約高100倍，可被還原 為三價鉻，將六價鉻還原為三價鉻是一個解毒的過程。針對鉻汙染，傳統的含鉻廢水的處理主要有兩種 一種是改變鉻(VI)在水中的存在形態，使溶解性的金屬轉變為不溶性的或難溶性的金屬化合物，從廢水中 除去，如化學還原法、電化學法等；二是不改變鉻(VI)的存在形態，將鉻(VI)從廢水中清除，如離子交換 法，活性炭吸附法等等。這些方法在不同程度上存在著投資大，運行費用高，治理後水難達標等等缺點， 並且產生大量汙泥，造成二次汙染。微生物還原法除鉻(VI)作為一種比較新興的除鉻方法，具有較大的應 用潛力。微生物還原法是指利用處於生長狀態的高效功能菌對鉻(VI)的酶催化還原、菌體代謝產物對Cr(VI) 的還原以及菌體對鉻(VI)的靜電吸附、絡合、絮凝和沉澱等作用，使Cr(VI)轉化(III)為沉澱下來，經固液 分離，實現廢水淨化。這種方法處理含鉻廢水是在微生物的生長代謝活動過程中完成的。目前報導的較多 細菌是在厭氧條件下具有較好的鉻(VI)還原效果，但是厭氧條件比較嚴苛，不利於實際應用，本發明的間 孢囊菌Q5-l可以在好氧的條件下將毒性強的六價鉻還原為毒性弱的三價鉻，大大降低了環境中鉻的毒性， 對於提高微生物治理鉻汙染的效果和鉻汙染微生物技術的發展有著重要意義，在含鉻汙水等的處理中也會 有好的應用。

發明內容
本發明的目的在於克服現有廢水中鉻汙染淨化技術的缺陷，分離得到一株新型鉻還原菌，該菌株可以將 廢水中高毒的六價鉻還原為低毒的三價鉻，並且以沉澱或者絡合物形式析出，從而淨化廢水中的鉻汙染。本
發明還涉及其用途。
本發明通過以下技術方案實現本申請人分離、篩選到一株新型鉻還原菌，該菌株被命名為Q5-l，屬間孢囊菌(/"frflwpora"g/"ceae)， 該菌株間孢囊菌(/"/mspora"gz'aceae乎)Q5-l於2008年11月25日送交湖北省武漢市武漢大學內的中 國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCCNO: M208239。
間孢囊菌Q5-1的篩選方案參見附圖1。由附圖1,先採取中國湖南省一錳礦土壤樣品，加一定濃度(見 後面的詳細描述，下同)K2Cr04進行富集培養，再對富集培養的十樣進行稀釋並塗布含有一定濃度K2004 的通用LB固體培養基平板，培養長出鉻抗性菌，挑取不同形態的菌落劃線得單克隆，再用水質六價鉻的 測定-二苯碳醯二肼分光光度法(國家環境保護局，中華人民共和國國家標準GB 7467—87，北京，中國 標準出版社，1987年11月第1版)檢測出能將六價鉻還原還原為三價鉻的菌株，再對檢測出的鉻還原菌 做16S核糖體RNA基因(16SrDNA)、形態學和功能基因等相關鑑定工作，最終得到間孢囊菌Q5-l 。
更詳細的技術步驟如下-
(1) 樣品採取2007年7月上旬採取湖南省一錳礦土壤樣品。
(2) 樣品富集精確稱取土樣100g於250ml滅菌三角瓶中，加5m100 mM的K2Cr04，輕輕攪勻置37 'C溫箱中培養一周，注意補加無菌水，確保樣品不幹。
(3) 鉻抗性菌分離精確稱取K2CrO4富集土樣10g丁裝有90ml無菌生理鹽水的三角瓶中，置37'C搖床 中振蕩半小時，再依次取1 ml到9 ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至10—4， l(T5， l(T6，分別取0.1ml塗布含 lmM的K2Cr04的LB固體培養基平板，每個稀釋度塗布3個平板，置37'C溫箱中培養一周，長出的菌株 為鉻抗性菌，將平板置4。C冰箱中待用。LB固體培養基配方如下，1L溶液中，胰蛋白腖(Tryptone): 10g; 酵母提取物(ctYeastExtra): 5g;氯化鈉(NaCl): 10g;瓊脂，15g。
(4) 劃線分離將步驟(3)中得到的鉻抗性菌挑取不同的菌落在LB固體平板上劃線，確保得到單克隆， 待菌長出後放4'C冰箱中待用並用甘油冷凍管保存一份於-8(TC冰箱。
(5) 鉻還原菌篩選:將步驟(4)中得到的鉻抗性菌單克隆轉接到10ml LB液體培養基中，補加100ul 100mM 的K2Cr04，使其終濃度為lmM,置37。C搖床中振蕩培養，並計時。開始一段時間為菌體細胞生長期，幾 乎沒有還原現象，等到其進入對數生長期後，細胞密度增加，還原速率開始加快，從這時開始密集取樣檢 測。取樣步驟如下在無菌條件下，取L5ml菌液到2ml離心管中，12000rpm離心4分鐘取上清檢測。每 隔兩個小時取一次樣。上清中鉻(VI)的測定方法均採用水質六價鉻的測定-二苯碳醯二肼分光光度法(國家 環境保護局，中華人民共和國國家標準GB7467—87，北京'中國標準出版社'1987年11月第1版)，具 體如下取上清lml置於50ml比色管中，用水稀釋至標線。加入0.5ml硫酸溶液(1 : 1)和0.5ral磷 酸溶液(1 : 1)，搖勾。加入2ml 二苯碳醯二肼顯色劑，搖勻，5-10分鐘後'於540nm波長處'用水做 參比，測定吸光度，從標準曲線上査得相應的六價鉻含量。初始值減去剩餘值便是己被還原的六價鉻含量。 相同條件下，還原的六價鉻越多，細菌的還原性越強。
4(6)鉻還原菌的分類鑑定 一是利用16SrDNA鑑定，即採用原核生物16S rDNA通用引物27F (即正向 引物)5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R (反向引物)5'GGYTACCTTGTTACGACTT3'做PCR (PCR的具體操作方法參見申請人的授權專利文獻，專利號為ZL 200510120584.7發明名稱 一種土壤總 DNA小量快速提取方法)。擴增其16SrDNA並測序，再與國際NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷 酸資料庫比對，核苷酸同源性為97%，鑑定為間孢囊菌；二是革蘭氏染色分析和生長特性鑑定。 本發明製備的間孢囊菌(i/"ras/;orawgi'flceflesp.) Q5-l菌學特徵如下 間孢囊菌(/rt/ra^wra"g&ceae 5p.) Q5-l為革蘭氏陰性菌(革蘭氏染色照片見附圖2所示)，適宜 生長溫度37'C，適宜pH8.0，在LB固體培養基上均為微黃透明、圓形、突起的菌落。 間孢囊菌Q5-l的保藏
間孢囊菌Q5-1可以在通用的LB液體或固體培養基上在37r培養，培養後可在4'C下作短期保藏。若 長期保藏，可使用甘油冷凍管或冷凍乾燥管(參見趙斌，何紹江.微生物學實驗.第一版.科學出版社.2002: 202—205)保藏菌株比較合適。
本發明的積極效果是
六價鉻和三價鉻相比，前者毒性比後者高100多倍，且六價鉻一般以離子形式存在不易去除，三價 鉻一般以沉澱或者絡合物形式存在，較易去除。本發明分離篩選到的間孢囊菌Q5-l可以在好氧條件下將 六價鉻還原為三價鉻，極大降低了廢水中鉻的危害，還可以結合細菌固定化包埋技術治理廢水中鉻汙染， 有望在淨化廢水中鉻汙染方面發揮重要作用。


圖1:是本發明的技術路線圖。
圖2:是本發明的間孢囊菌Q5-l革蘭氏染色照片。
圖3:是本發明的間孢囊菌Q5-1的鉻還原曲線圖，圖中X軸代表時間(小時)，Y軸左邊代表六價鉻 濃度(mg/1)， Y軸右邊代表細胞密度(OD6。o)。
圖4:是本發明的間孢囊菌Q5-l在模擬鉻汙染水體中對六價鉻的累加還原曲線圖，圖中X軸代表時 間(小時)，Y軸代表剩餘六價鉻含量(％)。
圖5:是本發明的間孢囊菌Q5-l進行固定化包埋後對六價鉻的還原曲線圖，圖中X軸代表時間(小 時)，Y軸代表剩餘六價鉻含量(％)。
具體實施例方式
實施例l鉻還原菌的分離鑑定
(1) 樣品採取2007年7月上旬採取中國湖南省一錳礦的土壤樣品。
(2) 樣品富集精確稱取土樣100 g於250 ml滅菌三角瓶中，加5ml 100 mM的K2Cr04,輕輕攪勻置37'C溫箱中培養一周，注意補加無菌水，確保樣品不幹。
(3) 鉻抗性菌分離精確稱取K2Cr04富集土樣10g於裝有90 ml無菌生理鹽水的三角瓶中，置37'C搖床 中振蕩半小時，再依次取l ml到9ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至10弋l(T5， l(T6，分別取0.1ml塗布含 mM的K2&04的LB固體培養基平板，每個稀釋度塗布3個平板，置37'C溫箱中培養一周，長出的菌株 為鉻抗性菌，將平板置4'C冰箱中待用。LB固體培養基配方如下，1L溶液中，胰蛋白腖(Tryptone): 10g; 酵母提取物(ctYeast Extra): 5g;氯化鈉(NaCl): 10g;瓊脂，15g。
(4) 劃線分離將步驟(3)中得到的鉻抗性菌挑取不同的菌落在LB固體平板上劃線，確保得到單克隆， 待菌長出後放4'C冰箱中待用並用甘孰冷凍管保存一份於-8(TC冰箱。
(5) 鉻還原菌篩選將步驟(4)中得到的鉻抗性菌單克隆轉接到10ml LB液體培養基中，補加100ul 100mM 的K2Cr04，使其終濃度為lmM，置37'C搖床中振蕩培養，並計時。開始一段時間為菌體細胞生長期，幾 乎沒有還原現象，等到其進入對數生長期後，細胞密度增加，還原速率開始加快，從這時開始密集取樣檢 測。取樣步驟如下在無菌條件下，取1.5ml菌液到2ml離心管中，12000rpm離心4分鐘取上清檢測。每 隔兩個小時取一次樣。上清中鉻(VI)的測定方法均採用水質六價鉻的測定-二苯碳醯二肼分光光度法(國家 環境保護局，中華人民共和國國家標準GB7467—87，北京，中國標準出版社，1987年11月第1版)，具 體如下取上清lml置於50ml比色管中，用水稀釋至標線。加入0.5ml硫酸溶液(1:1)禾ll 0.5ml磷 酸溶液(1 : 1)，搖勻。加入2ml 二苯碳醯二肼顯色劑，搖勻，5~10分鐘後，於540nm波長處，用水做 參比，測定吸光度，從標準曲線上查得相應的六價鉻含量。初始值減去剩餘值便是已被還原的六價鉻含量。 相同條件下，還原的六價鉻越多，細菌的還原性越強。
(6) 鉻還原菌的分類鑑定 一是利用16SrDNA鑑定，即釆用原核生物16S rDNA通用引物27F (即正向 引物)5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R (反向引物)5'GGYTACCTTGTTACGACTT3'做PCR
(PCR的具體操作方法參見申請人的授權專利文獻，專利號為ZL 200510120584.7發明名稱 一種土壤總 DNA小量快速提取方法)。擴增其16S rDNA並測序，再與國際NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷 酸資料庫比對，核苷酸同源性為97%，鑑定為間孢囊菌；二是革蘭氏染色分析和生長特性鑑定。 本發明製備的間孢囊菌aw/ius/wra"gi'flce恥印.)Q5-l菌學特徵如下 間孢囊菌(/Wraspora"g/aceae乎)Q5-l為革蘭氏陰性菌(革蘭氏染色照片見附圖2所示)，適宜 生長溫度37。C,適宜pH8.0，在LB固體培養基上均為微黃透明、圓形、突起的菌落。 間孢囊菌QS-1的保藏
間孢囊菌Q5-l可以在通用的LB液體或固體培養基上在37'C培養，培養後可在4'C下作短期保藏。若 長期保藏，可使用甘油冷凍管或冷凍乾燥管(參見趙斌，何紹江.微生物學實驗.第一版.科學出版社.2002: 202—205)保藏菌株比較合適。實施例2間孢囊菌Q5-1的鉻還原曲線
挑取間孢囊菌Q5-l單克隆接種到100 ml LB液體培養基中，置37'C搖床中振蕩培乾間隔取樣測定至 細胞密度OD6加為0.15左右，保存在4'C冰箱，作為種子菌液用於接種。以1%的接種量吸取1 ml到100 ml 新鮮LB液體培養基中，補加lml lOOmM的K2Cr04，使其終濃度為lmM，置37'C搖床中振蕩培養。開始 培養8小時後開始取樣，每隔2小時取一次樣，直至K2Cr04完全還原為止。每次分別取1.2 ml和1.5 ml， 再用分光光度法分別測細胞密度(OD6GQ)和六價鉻濃度(OD54Q),全部現取現做。具體做法如下 一是測 細胞密度(OD6(K)),以去離子水為參照，直接用1.2 ml的樣測定其在波長600 nm處的吸光值。二是六價 鉻濃度(OD柳)，取1.5ml菌液到2ml離心管中，12000rpm離心4分鐘取上清檢測。上清中鉻(VI)的測定 方法均採用六價鉻的測定二苯碳醯二肼分光光度法(國家環境保護局，中華人民共和國國家標準GB 7467—87，北京，中國標準出版社，1987年11月第1版)，具體步驟如下取離心後的上清lml置於50ml 比色管中，用水稀釋至標線。加入0.5ml硫酸溶液(體積比為1 : 1)和0.5ml磷酸溶液(體積比為1:1)， 搖勻。加入2ml 二苯碳醯二肼顯色劑，搖勻，5~10分鐘後，於540nm波長處，用水做參比，測定吸光度， 從標準曲線上查得相應的六價鉻含量。繪製的間孢囊菌Q5-1的鉻還原曲線見附圖3。 實施例3:間孢囊菌Q5-l在模擬鉻汙染水體中對六價鉻的累加還原效果
採用去離子水加K2Cr04用來模擬鉻汙染水體，考察間孢囊菌Q5-1對六價鉻的累加去除效果。具體做
法如下準備三個250ml三角瓶，做為三個重複，每個裝100mlLB培養基(121°C，高壓蒸汽滅菌30分
鍾)，以1%的接種量吸取1 ml細胞密度OD柳為0.15左右的Q5-l的菌液接種，補加lml 100mM K2Cr04
母液，使其終濃度為lmM，置37。C搖床中振蕩培養。開始培養12小時開始取樣測定，直至第一次添加的
K2Cr04差不多完全還原；接下來再次補加lml 100mMK2CrO4母液，使其終濃度為lmM，繼續取樣檢測，
直至第二次添加的K2Cr04差不多完全還原，再補加第三次K2CrCV依此類推，直至菌體不能再還原六價
鉻為止。期間用二苯碳醯二肼分光光度法檢測結果見附圖3。從圖中可以看出，間孢囊菌Q5-1在72小時
內可以還原連續三次添加的終濃度為lmM的K2Cr04的模擬鉻汙染水體，還原速率快，重複性較好，具有
良好的應用前景。
實施例4 間孢囊菌Q5-l進行固定化包埋對六價鉻的還原效果。
採用固定化材料對間孢囊菌Q5-l進行包埋，再把固定好的細菌投放到模擬鉻汙染水體中，看其還原 六價鉻的效果。 具體做法如下
(1) 在初步研究基礎上，結合文獻報導，選擇固定化載體材料，分別為聚乙烯醇，海藻酸鈉'活性炭'矽
藻土，載體材料的比例按重量百分數計為聚乙烯醇(4%)-海藻酸鈉(3%)-活性炭(1.5%)-硅藻土(3%)。
(2) 固定化細菌的準備。準備一個體積為250ml三角瓶，裝100mlLB培養基(在121'C,高壓蒸汽滅菌 30分鐘)，以1%的接種量吸取1 ml細胞密度OD柳為0.15左右Q5-l菌液接種'置37。C搖床中振蕩培養， 開始培養8小時後開始取樣，測其細胞密度(OD卿)，當OD卿為0.7左右'便可停止培養，收集菌體。 菌體收集方法為:將培養好的Q5-l菌液轉移到50ml的無菌離心管中'在4'C' 12000rpm條件下'離心IO分鐘，棄除上清；再加入25ml pH8.0的磷酸緩衝液懸浮菌體，4°C， 12000rpm，離心10分鐘洗滌菌體； 再用磷酸緩衝液重複洗滌兩次；最後將洗好的菌體濃縮到一個離心管中，用10 ml pH8.0的磷酸緩衝液懸 浮，放置4'C冰箱，留待固定化時使用。
(3) 將各固定化載體材料按(l)中比例稱量，添加無菌水定容到100ml，用恆溫水浴鍋在90。C溶解，冷卻至 37'C後，與(2)中細菌濃縮液混合，然後用1.5mm直徑針頭的注射器加壓將混和液注射到含2。/。氯化轉的飽和 硼酸交聯液中成球，交聯時間為24個小時。交聯完成後將固定化小球用無菌去離子水洗滌兩次待用。
(4) 準備3個250ml三角瓶，做為三個重複，每個裝100mlLB培養基(121°C,高壓蒸汽滅菌30分鐘)，補 加0.5mll00mMK2CrO4母液，使其終濃度為0.5mM，將(3)中固定化小球投入，置37。C搖床中振蕩培養。開 始取樣檢測六價鉻剩餘量，直至其完全去除。
上述實驗表明，本發明製備的間孢囊菌Q5-1進行固定化包埋後對六價鉻還原效果較好，其中聚乙烯 醇(4%)、海藻酸鈉(3%)、 活性炭(1.5%)和硅藻土 (3%)的組合，在17小時可將0.5mM的&004 還原97.5%。該組合與沒有進行固定化包埋的游離細胞的六價鉻還原效果比較效果見附圖4。由圖4可見其 還原效果接近於游離細胞，並且在應用中使工藝自動化，連續化，使用方便，可以提高處理效率，降低生 產成本，所以具有很好的應用前景。
權利要求
1、一株能將無機六價鉻還原為無機三價鉻的間孢囊菌(Intrasporangaiceae)，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為M208239。
2、 權利要求1所述的間孢囊菌Q5-1在淨化廢水中鉻汙染方面的應用。
全文摘要
本發明屬於環境微生物技術領域，具體涉及一株對六價鉻有還原作用的間孢囊菌Q5-1及其在淨化廢水中鉻汙染方面的應用。本發明的特徵是從湖南一錳礦土壤中分離得到一株對對六價鉻有還原作用的間孢囊菌Q5-1。該菌株可以將含鉻廢水中的六價鉻還原為三價鉻，極大地降低了廢水中鉻的毒性。本發明菌株被命名為間孢囊菌Q5-1(Intrasporangiaceae sp.)Q5-1，是一株新發現的鉻還原細菌，其保藏號為CCTCC NOM208239。初步研究表明，本發明的菌株在治理廢水中的鉻汙染方面具有較好的應用前景。
文檔編號C02F3/34GK101429487SQ200810236679
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月5日 優先權日2008年12月5日
發明者何敏豔, 楊錦霞, 王革嬌 申請人:華中農業大學