一種肺癌高發區患者靶基因的篩選方法與檢測分析的方法
2024-04-14 02:45:05 1
1.本發明涉及技術醫療技術領域,具體是指一種肺癌高發區患者靶基因的篩選方法與檢測分析的方法。
背景技術:
2.肺癌是當前世界上公認死亡率和發病率較高的一類癌症,在全世界內不同地域、不同人種,肺癌都是癌症相關所致死亡的主要原因,雲南宣威市(縣)位於雲南省東北部烏蒙山區,土地面積6069.88平方公裡,約佔雲南省總面積的1.58%,下設5個街道、23個鄉鎮,總人口152.95萬,農村人口佔比較高,但宣威地區男性肺癌的asmr仍然是中國其他地區的3-5倍,而在女性群體中這一差異更是達到了7-9倍,這座經濟欠發達小縣城卻因其肺癌發病率和死亡率遠超過北京、上海等地而引起了國內外廣泛的關注,雲南宣威地區肺癌高發,具有非吸菸女性群體高發、患病群體年輕化等特點,並且缺乏有效的診治指標,目前對於fendrr在宣威地區人群肺癌中靶基因的篩選方法準確性差,無法實現對fendrr基因有抑制效果的靶基因的獲取。
技術實現要素:
3.本發明要解決的技術問題是,提供一種肺癌高發區患者靶基因的篩選方法與檢測分析的方法。
4.為解決上述技術問題,本發明提供的技術方案為:一種肺癌高發區患者靶基因的篩選方法與檢測分析的方法,其特徵在於,所述的一種肺癌高發區患者靶基因的篩選方法包括如下步驟:步驟一:通過臨床收集高發區患者肺癌以及癌旁組織樣本將其送檢;步驟二:採用fold-change以及t檢驗統計學方法挑選10對樣本;步驟三:對高發區患者肺癌以及癌旁組織進行總rna的提取;步驟四:將總rna反轉錄為cdna;步驟五:實時螢光定量pcr檢測;步驟六:採用晶片對樣本組織差異中的lncrna及mrna進行檢測以及生物信息學分析,篩選出fendrrr可能調控的基因,作為改進,所述的步驟一具體包含如下步驟:(1)臨床收集高發區肺癌患者手術切除的腫瘤組織以及距離腫瘤組織3-5cm以上形態學正常的肺部組織,用無菌生理鹽水將組織中的血液和組織液衝洗乾淨;(2)用無菌手術刀片切塊,放入分裝有rnalatersollution的凍存管中,置於4℃冰箱保存;(3)從4℃冰箱取出過夜處理的組織,放入另一乾淨的凍存管並做好標記,於-80℃冰箱中凍存);(4)處理過的組織標本經rna的抽提、質檢與生物晶片的檢測。
5.作為改進,所述的步驟二中選擇樣本的條件為log2|foldchange(linear)|≥2,表示表達差異基因上調或下調2倍以上;t-testp-value《0.05或《0.01,一般以0.05為標準,篩選出差異表達的lncrna及mrna。
6.作為改進,所述的步驟三具體具體包含如下步驟:(1)材料準備:配製0.1%的depc水:將2mldepc溶於2000ml去離子水中,充分攪拌混勻;將實驗所需的勻漿器、鑷子和ep管浸泡於配製好的0.1%depc水中;取出浸泡過的實驗器材並置於消毒盒中,進行高壓滅菌(121℃,30min);高壓滅菌處理過的實驗器材再放入65℃烤箱中烘乾,備用;(2)試劑準備:dna酶i:將550μl無核酸酶水(試劑盒提供)加入dna酶i(凍乾粉)中,輕輕混勻,於-20℃保存;rna裂解液:將1-硫代甘油按2%(v/v)加入到裂解液中,混勻,分裝後於4℃冰箱中保存;rna洗液:將70ml無水乙醇加入到40ml的rna洗液中,混勻,在室溫中保存;dna酶i孵育液:10
×
dna酶i緩衝液5μl、dna酶i5μl以及無核酸酶水40μl混合後;電泳緩衝液的配製:取40ml50
×
taebuffer,加入1960ml去離子水,配製成1
×
tae電泳緩衝液,置室溫24h後備用;(3)癌組織及癌旁組織中總rna的提取將肺組織用4℃生理鹽水衝洗乾淨,用電子天平稱取40mg組織樣本放入勻漿器中,同時在勻漿器中加入500μlrna裂解液(試劑盒提供),置冰水浴中充分研磨(時間不宜過久);取出研磨好的組織液置於ep管內,加入500μlrna稀釋液(試劑盒提供)充分吹打混勻,蓋上管蓋後室溫放置5min;將混合物用最大離心轉速離心5min,小心將上清液吸出並加入分離柱中,同時加入大約為二分之一上清體積的無水乙醇,可見管中出現少量絮狀沉澱,用移液器吹打片刻,混勻;將分離柱置於離心機中,以13000
×
g離心1min,棄濾液(此時rna混合物附著於濾膜上),加入600μlrna洗液,13000
×
g離心45s洗去雜質,棄濾液;加入50μldna酶i孵育液到分離柱裡的吸附濾膜的中央,在20℃-30℃之間放置15min,使dna酶發揮作用去除體系中的dna;在分離柱中加入600μlrna洗液,13000
×
g離心45s,倒掉濾液;重複洗滌步驟兩次,去除dna酶的幹擾。將分離柱重新安置於收集管上,以13000
×
g離心2min,棄去濾液;將分離柱轉移置於洗脫管上(試劑盒提供),在分離柱的中央濾膜上加入50μl的rnasefreeddh2o,室溫靜置2min,13000
×
g離心1min,所收集到的濾液即為提取出的rna,取下收集管標註好樣本信息迅速凍存於-80℃冰箱,待用;(4)總rna的質檢打開nanoq微量分光光度計並運行軟體,用清潔布將檢測器擦乾淨,取1μlrnase-freeddh2o置於檢測器頂端,蓋上蓋子選擇調零,待度數穩定後擦乾液體;將檢測選項樣本類選定為rna,取待測樣本置於檢測器頂端,依次進行檢測並讀數
(每次更換樣本不需要再次調零);用電子天平稱取1g瓊脂糖粉,量筒量取50ml的0.5%tae緩衝液,加入到錐形瓶中搖勻,放入微波爐加熱50-60s至瓊脂糖粉末完全溶解至無顆粒狀態,待溫度降為60℃左右時用移液器加入6μl核酸染料混勻,倒入提前插好了梳電泳梳的電泳槽中,待10-20min後凝膠冷卻成形;緩慢且筆直地取下梳子將凝膠放入電泳槽中,加入配製好的1
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tae緩衝液,至沒過凝膠2-3mm,於上樣孔中加入6μl混合好的樣本(混合樣本中含有:2μlrna、1μl6
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loadingbuffer以及3μl1
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tae緩衝液);調整電壓120v時間為30min,期間觀察樣本移動至2/3處時停止電泳,取出凝膠於紫外成像儀內經曝光後觀察結果。
7.作為改進,所述的步驟四的反轉錄程序:根據primescripttmrtreagentkit試劑盒提供的說明配比去除基因組dna混合液加入到反應管中,依次加入rna樣本室溫反應30min,去除樣本中的dna,然後通過反轉錄體系反應液進行轉錄反應;所述的除基因組dna混合液由2.0μl的5
×
gdnaeraserbuffer、1.0μl的gdnaeraser、1μg的totalrna以及upto10μl的rnasefreedh2o構成;所述的反轉錄體系反應液由10.0μl的除基因組dna混合液、1.0μl的primescriptrtenzymemixl、1.0μl的rtprimermix、4.0μl的5
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primescriptbuffer2、4.0μl的rnasefreedh2o以及20.0μl的total混合後嗎,在37℃的反應罐內反應15min,然後增加至85℃下反應5s,作為改進,所述的步驟五具體步驟包含:(1)引物合成所述的fendrr的實時定量引物序列如下:上遊引物forward:5
』‑
ccggactgcgaatatctgtt-3』;下遊引物reverse:5
』‑
tcaaatcatgcctctccaca-3』;所述的klf4的實時定量引物序列如下:上遊引物forward:5
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agaggagcccaagccaaag-3』;下遊引物reverse:5
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cgtcccagtcacagtggtaag-3』;所述的gapdh的實時定量引物序列如下:上遊引物forward:5
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gagtcaacggatttggtcgt-3』;下遊引物reverse:5
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gacaagcttcccgttctcag-3』;(2)實時螢光定量pcr實時螢光定量pcr反應體系包含5.0μl的faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)、1.0μl的cdna、0.5μl的正向引物(20μm)、0.5μl的反向引物(20μm)以及1.0μl的ddh2o混合後,95℃變性15s,60℃退火併延伸60s,共40個循環每個樣本重複三16次,陰性對照以ddh2o代替模板dna。
8.本發明具有如下優點:本發明設置通過lncrna-mrna晶片檢測技術,分別檢測和分析了在23對宣威地區肺癌患者腫瘤組織與正常對照組織中存在差異表達的lncrna和mrna,藉助多個生物信息學手段進行分析,篩選出了調控關係較為緊密的多對基因,使得篩選方法準確性高,可以實現對fendrr基因有抑制效果的靶基因的獲取。
20℃保存;rna裂解液:將1-硫代甘油按2%(v/v)加入到裂解液中,混勻,分裝後於4℃冰箱中保存;rna洗液:將70ml無水乙醇加入到40ml的rna洗液中,混勻,在室溫中保存;dna酶i孵育液:10
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dna酶i緩衝液5μl、dna酶i5μl以及無核酸酶水40μl混合後;電泳緩衝液的配製:取40ml 的50
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tae buffer,加入1960ml去離子水,配製成1
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tae電泳緩衝液,置室溫24h後備用;(3)癌組織及癌旁組織中總rna的提取將肺組織用4℃生理鹽水衝洗乾淨,用電子天平稱取40mg組織樣本放入勻漿器中,同時在勻漿器中加入500μlrna裂解液(試劑盒提供),置冰水浴中充分研磨(時間不宜過久);取出研磨好的組織液置於ep管內,加入500μlrna稀釋液(試劑盒提供)充分吹打混勻,蓋上管蓋後室溫放置5min;將混合物用最大離心轉速離心5min,小心將上清液吸出並加入分離柱中,同時加入大約為二分之一上清體積的無水乙醇,可見管中出現少量絮狀沉澱,用移液器吹打片刻,混勻;將分離柱置於離心機中,以13000
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g離心1min,棄濾液(此時rna混合物附著於濾膜上),加入600μlrna洗液,13000
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g離心45s洗去雜質,棄濾液;加入50μldna酶i孵育液到分離柱裡的吸附濾膜的中央,在20℃-30℃之間放置15min,使dna酶發揮作用去除體系中的dna;在分離柱中加入600μlrna洗液,13000
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g離心45s,倒掉濾液;重複洗滌步驟兩次,去除dna酶的幹擾。將分離柱重新安置於收集管上,以13000
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g離心2min,棄去濾液;將分離柱轉移置於洗脫管上(試劑盒提供),在分離柱的中央濾膜上加入50μl的rnasefreeddh2o,室溫靜置2min,13000
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g離心1min,所收集到的濾液即為提取出的rna,取下收集管標註好樣本信息迅速凍存於-80℃冰箱,待用;(4)總rna的質檢打開nanoq微量分光光度計並運行軟體,用清潔布將檢測器擦乾淨,取1μlrnase-freeddh2o置於檢測器頂端,蓋上蓋子選擇調零,待度數穩定後擦乾液體;將檢測選項樣本類選定為rna,取待測樣本置於檢測器頂端,依次進行檢測並讀數(每次更換樣本不需要再次調零);用電子天平稱取1g瓊脂糖粉,量筒量取50ml的0.5%tae緩衝液,加入到錐形瓶中搖勻,放入微波爐加熱50-60s至瓊脂糖粉末完全溶解至無顆粒狀態,待溫度降為60℃左右時用移液器加入6μl核酸染料混勻,倒入提前插好了梳電泳梳的電泳槽中,待10-20min後凝膠冷卻成形;緩慢且筆直地取下梳子將凝膠放入電泳槽中,加入配製好的1
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tae緩衝液,至沒過凝膠2-3mm,於上樣孔中加入6μl混合好的樣本(混合樣本中含有:2μlrna、1μl6
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loadingbuffer以及3μl1
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tae緩衝液);調整電壓120v時間為30min,期間觀察樣本移動至2/3處時停止電泳,取出凝膠於紫外成像儀內經曝光後觀察結果,
步驟四:將總rna反轉錄為cdna;根據primescripttmrtreagentkit試劑盒提供的說明配比去除基因組dna混合液加入到反應管中,依次加入rna樣本室溫反應30min,去除樣本中的dna,然後通過反轉錄體系反應液進行轉錄反應;所述的除基因組dna混合液由2.0μl的5
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gdnaeraserbuffer、1.0μl的gdnaeraser、1μg的totalrna以及upto10μl的rnasefreedh2o構成;所述的反轉錄體系反應液由10.0μl的除基因組dna混合液、1.0μl的primescriptrtenzymemixl、1.0μl的rtprimermix、4.0μl的5
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primescriptbuffer2、4.0μl的rnasefreedh2o以及20.0μl的total混合後嗎,在37℃的反應罐內反應15min,然後增加至85℃下反應5s,步驟五:實時螢光定量pcr檢測;(1)引物合成所述的fendrr的實時定量引物序列如下:上遊引物forward:5
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ccggactgcgaatatctgtt-3』;下遊引物reverse:5
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tcaaatcatgcctctccaca-3』;所述的klf4的實時定量引物序列如下:上遊引物forward:5
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cgtcccagtcacagtggtaag-3』;所述的gapdh的實時定量引物序列如下:上遊引物forward:5
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gagtcaacggatttggtcgt-3』;下遊引物reverse:5
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gacaagcttcccgttctcag-3』;(2)實時螢光定量pcr實時螢光定量pcr反應體系包含5.0μl的faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)、1.0μl的cdna、0.5μl的正向引物(20μm)、0.5μl的反向引物(20μm)以及1.0μl的ddh2o混合後,95℃變性15s,60℃退火併延伸60s,共40個循環每個樣本重複三16次,陰性對照以ddh2o代替模板dna。
25.步驟六:採用晶片對樣本組織差異中的lncrna及mrna進行檢測以及生物信息學分析,篩選出fendrrr可能調控的基因。
26.得出結論:(1)lncrna晶片目前已經經完成多種腫瘤的相關研究,檢測總樣本數超過2000個。結合oligodt和隨機引物兩種擴增方式,同時檢測有polya和無polya尾的lncrna及mrna,確保全面檢測。晶片格式4
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180k,每條lncrna和mrna都有2條以上的探針重複,可確保高質量的實驗數據。
27.(2)通過晶片檢測結果,根據晶片檢測結果,計算基因差異表達倍數log2|foldchange(linear)|≥2以及p-value《0.05,能夠篩選出差異表達lncrna共995條,其中表達上調的lncrna有396條,表達下調的lncrna有599條,見圖1;差異表達的mrna共1948條,表達上調的mrna有724條,表達下調的mrna有1224條,見圖2。
28.(3)在23對宣威地區肺癌患者癌組織和癌旁組織中fendrr和klf4的晶片檢測結果顯示,二者均呈表達下調,且一致性較好,見圖3圖4。
29.(4)電泳時,核糖體(rrna)在距離上樣孔附近的位置上,28s、18s為核糖體的大小兩個亞基,而分子量較小的5s帶較淡。在提取過程中,如果出現rna酶汙染的情況,則會導致rna降解,且降解時分子量越大的rna越容易降解,所以電泳時若缺失了28s條帶或條帶亮度較弱、5s條帶亮度增強或者條帶下方有明顯彌散,則證明rna出現降解。本次電泳結果可見條帶分明,分別為5s、18s和28s三條,證明rna提取情況較好且沒有降解,見圖5。
30.(5)實驗中內參基因的擴增曲線擴增曲線呈光滑的「s」型,且熔解曲線為單一峰也證明實驗誤差較小且結果較為準確。觀察內參基因和目的基因的熔解曲線和擴增曲線完整、光滑且無其他雜峰,則表明擴增產物特異性較好,見圖6-圖11。將pcr產物進行瓊脂糖電泳,可觀察到產物呈明亮的單條帶,並無其他雜帶,見圖12。
31.(6)統計fendrr、klf4以及gapdh基因的ct值,根據公式計算出2
‑∆∆
c,根據樣本的相對表達水平通過graphpadprism7.0表示為柱狀圖,見圖13圖14。
32.(7)將以上結果進行w檢驗,以上兩組均符合正態分布,再進行配對t檢驗進行統計分析,fendrr與klf4在宣威地區肺癌患者癌組織中的表達水平明顯低於癌旁組織,p<0.05,差異具有統計學意義,同時證明qrt-pcr結果與晶片結果相符合。
33.雖然,上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述,但在本發明基礎上,可以對之作一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬於本發明要求保護的範圍。