一種中藥組合物、其製備方法及其用途與流程

2024-04-07 06:53:05

本發明涉及中藥材技術領域，具體涉及一種中藥組合物、其製備方法及其用途，具體而言，涉及一種從杜仲葉中提取的綠原酸有效部位，以及從梔子中提取的京尼平苷和西紅花苷有效部位所製備的組合物，及其組合物在製備減肥藥，以及減肥保健食品中的應用。

背景技術：

杜仲葉為杜仲科植物杜仲eucommiaulmoidesoliv的乾燥葉。研究發現杜仲葉水提物可減肥調脂，降低動物體重，抑制甘油三酯在脂肪細胞積聚；對高脂小鼠血清膽固醇(tc)和甘油三酯(tg)降低作用明顯，且升高血清高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)；對餵食高脂飲食倉鼠具有降低血漿tg、游離脂肪酸(ffa)、tc、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)和肝臟膽固醇的水平，升高血漿hdl-c與tc的比值，以及載脂蛋白-a1(apo-a1)的水平，主要是通過改變肝臟中的脂肪生成、脂肪酸β氧化水平及膽固醇代謝來實現的。杜仲葉乙醇提取物具有降低血脂含量與調節機體血脂代謝的作用，杜仲葉甲醇提取物具有抗肥胖的作用，如降低體重、白色脂肪組織重量、血漿tg和tc的水平。

梔子，學名：gardeniajasminoidesellis，別名：黃梔子、山梔、白蟾，是茜草科植物梔子的果實。梔子的果實是傳統中藥，屬衛生部頒布的第1批藥食兩用資源，具有護肝、利膽、降壓、鎮靜、止血、消腫等作用。在中醫臨床常用於治療黃疸型肝炎、高血壓、糖尿病等症。梔子有效組分主要為西紅花苷和京尼平苷等。藥理研究表明，梔子可產生抗氧化、抑制血小板聚集，調節血脂水平防止動脈粥樣硬化及減肥等功效。提示梔子有效成分在減肥調脂方面具有較高的研究開發價值。

肥胖症是一組常見的代謝症群。當人體進食熱量多於消耗熱量時，多餘熱量以脂肪形式儲存於體內，其量超過正常生理需要量，且達一定值時遂演變為肥胖症。誘使肥胖的外因以飲食過多而活動過少為主，內因為脂肪代謝紊亂。肥胖症的發病機理複雜，包括遺傳因素、神經精神因素、內分泌因素、褐色脂肪組織異常等。目前批准上市的減肥藥主要以化學類為主，雖然安全性較高，但在複雜的中樞神經系統中，對類似的受體都有一定的作用，從而引起不可避免的相應副作用。

雖然現有技術披露有關於綠原酸和京尼平苷減肥作用的研究，但是，沒有揭示杜仲葉提取物與梔子提取物聯用對減肥的作用。且由於中藥成分複雜，想以傳統中藥來達到理想的減肥效果，仍是技術研發人員需要解決的課題。

技術實現要素：

鑑於現有技術沒有披露杜仲提取物與梔子提取物組合製備減肥藥的問題，提供一種從杜仲葉中提取的綠原酸有效部位，以及從梔子中提取的京尼平苷和西紅花苷有效部位所製備的組合物。

本發明提供一種中藥組合物，包括杜仲葉提取物和梔子提取物，其中杜仲葉提取物的重量是梔子提取物重量的1/4～4倍。

進一步的，所述杜仲葉提取物和梔子提取物的重量比為1。

作為優選的，所述杜仲葉提取物包括綠原酸，所述梔子提取物包括京尼平苷和西紅花苷。

本發明的工作原理及有益效果，本發明選用我國藥食兩用的傳統中藥材杜仲葉和梔子為研究對象，將杜仲葉提取物和梔子提取物按照一定比例混合，使組合物中含有綠原酸、京尼平苷和西紅花苷的有效部位。製備的中藥組合物中的有效成分相互協同，相互促進，具有明顯的抗炎、調脂減肥作用，同時能激活膽汁酸相關轉運體蛋白的表達，且組方效果優於其中的單一提取物，並且無明顯的毒副反應和藥物耐受性。

一種中藥組合物的製備方法，包括以下步驟：

步驟一、備料：分別稱取杜仲葉和梔子，分別乾燥粉碎，得到杜仲葉粉末和梔子粉末；

步驟二、浸提：採用重量比為杜仲葉粉末8～10倍的60％乙醇對杜仲葉粉末浸提2～4次，每次6-10小時後過濾得到杜仲葉浸提液，採用重量比為梔子粉末8～10倍的60％乙醇對梔子粉末浸提2～4次，每次6～10小時後過濾得到梔子浸提液；

步驟三、純化：分別將杜仲葉浸提液和梔子浸提液旋轉蒸發濃縮，用大孔樹脂分別對杜仲葉浸提液和梔子浸提液分離純化，得到杜仲葉純化液和梔子純化液；

步驟四、洗脫：採用5％-60％的乙醇溶液對杜仲葉純化液和梔子純化液分別進行梯度洗脫，將梔子中主要含京尼平苷及西紅花苷的兩部分的洗脫液進行合併得到梔子洗脫液，將杜仲葉中綠原酸部分進行收集合併得到杜仲葉洗脫液；

步驟五、濃縮乾燥：對杜仲葉洗脫液和梔子洗脫液分別減壓濃縮至浸膏，分別冷凍乾燥得到杜仲葉提取物和梔子提取物；

步驟六、混合：將杜仲葉提取物和梔子提取物按照上述比例混合得到中藥組合物。

進一步的，所述步驟二中，浸提的次數為3次。浸提3次成分含量最高，3次以後浸提液色明顯變淺，點板薄層層析目標產物色淺。

進一步的，所述步驟二中，浸提的時間為8小時。8小時的浸提時間為最佳時間，浸提8小時有效成分能夠充分出來，且能夠較好的控制酒精濃度，若時間太長則酒精揮發不利於提取。

本發明的製備方法的優點：本實驗對杜仲葉及梔子通過60％乙醇溶液冷浸進行充分提取，粗提液中主要活性成分提取率較高且雜質少易處理。使用大孔樹脂對提取液進行分離純化，不同濃度乙醇溶液進行梯度洗脫分離，薄層色譜檢識分離度及純度發現兩種型號樹脂對各自藥材中不同組分吸附能力強、分離度高、易解吸，能得到純度較高的提取物；採用uplc(超高效液相色譜)及uv(紫外線濾光鏡)分別對分離純化樣品進行含量測定，精確測定各自含量：ge含52.5％京尼平苷、10.5％西紅花苷總苷；ee綠原酸含量為52.3％。採用hplc-ms/ms質譜聯用技術建立的杜仲葉及梔子提取物測定方法，初步判斷杜仲葉提取物中主要成分為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷，梔子提取物中主要成分為京尼平苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2、京尼平龍膽二糖苷。此方法能高效、準確、全面地評價其化學成分，在杜仲葉及梔子相關研究及質量控制方面是一個可行的方法。

進一步的，所述的組合物在製備減肥藥物或者製備減肥食品中的用途。

一種非治療目的減肥方法，包括口服中藥組合物。

附圖說明

圖1為本發明的中藥組合物對小鼠血清中血清膽固醇tg含量影響的曲線圖；

圖2為本發明的中藥組合物對小鼠血清中甘油三酯tc含量影響的曲線圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明的技術方法進行詳細介紹：

梔子提取物分離

(1)浸提部分：

取風乾後的梔子樣品粉碎，以10倍質量55％的乙醇溶液冷浸提取3次，每次8h，過濾，合併提取液，減壓抽濾去除雜質後，保留上清液體，旋轉蒸發濃縮後，即得上樣液。

(2)大孔吸附樹脂分離：

1)預處理：因大孔吸附樹脂在生產過程中會混雜入未形成聚合物的單體、分散劑、致孔劑、惰性溶劑，故需對樹脂進行預處理。hpd100大孔吸附樹脂經乙醇浸泡24h，後經乙醇洗至流出液不渾濁，再用蒸餾水洗脫除去雜質直至流出液無醇味，用5％鹽酸溶液通過樹脂柱，浸泡2-4h，再用水洗至中性，備用。

2)裝樣：將樣品溶於純淨水中，製得上樣液，以一定的流速緩慢加注到柱的上端開始吸附。

3)洗脫：先用水清洗以除去樹脂表面或內部殘留的非極性或水溶性大的強極性雜質(如多糖及無機鹽)，後以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％的乙醇由低至高濃度以一定的流速進行洗脫，根據流出液顏色及吸附樹脂顏色變化，適時調整洗脫速度。

4)薄層色譜分析：將矽膠薄層板置於105℃的烘箱中活化半小時，取出置於矽膠板架中待用。在摸索梔子薄層色譜的展開劑中，嘗試了不同的溶劑體系：石油醚-乙酸乙酯，甲醇-水等，並嘗試了不同類型的矽膠板，得出矽膠gf254板可實現目標化合物的清晰分離。實踐證明展開劑乙酸乙酯：甲醇：水＝100:20:13可以使目標化合物基本實現在矽膠板上的有效分離。梔子提取液洗脫過程中以京尼平苷、西紅花苷為對照品進行薄層分析：將矽膠板上的展開劑展開至距底部12cm時取出自然晾乾後，噴20％硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，置於105℃烘箱烘烤10min，觀察薄層板位點並計算rf值。rf＝展開斑點中心至點樣點中心距離/溶劑前沿至點樣點距離。

5)洗脫液篩選及合併：梔子提取物洗脫液過程中以京尼平苷、西紅花苷為對照品進行薄層分析，並以此為依據全程監測大孔樹脂洗脫液的成分及含量，將梔子洗脫液中主要含京尼平苷和西紅花苷的兩部分洗脫液分類合併，減壓濃縮至浸膏，經冷凍乾燥後分別得到梔子提取物乾粉a(西紅花苷總苷)、梔子提取物乾粉b(京尼平苷)，混合得到梔子提取物(西紅花苷總苷、京尼平苷)。

杜仲葉提取物分離

方法同梔子的提取步驟一致，得到杜仲葉提取物(綠原酸)。

薄層色譜檢測、合併及定性檢測：同一薄板上，取各部分洗脫液，與綠原酸標準品對照，以石油醚-乙醇(1:3,v/v)作為展開劑，室溫展開，乾燥後，紫外燈鑑識，5％硫酸-乙醇溶液顯色，烘烤10min。薄層色譜結果只有一個明顯斑點，rf相同部分，即判斷為綠原酸洗脫物。合併與標準品rf相同部分，以此真空旋轉蒸發至乾燥，得杜仲葉提取物乾粉。

uplc對提取物的定量分析

色譜條件的選擇

1)綠原酸含量測定的uplc色譜條件：behshieldrpc18(1.7μm，2.1μm×50mm)色譜柱；流速0.3ml/min；柱溫30℃；流動相：v乙腈：v0.4％磷酸溶液＝13:87；檢測波長327nm；進樣量2μl。

2)京尼平苷含量測定的uplc色譜條件:behshieldrpc18(1.7μm，2.1μm×50mm)色譜柱；流速0.3ml/min；柱溫30℃；流動相：v甲醇：v水＝30:70；檢測波長238nm；進樣量2μl。

西紅花苷總苷含量選擇紫外可見分光光度計在最大吸收峰440nm進行測定。

京尼平苷、綠原酸、西紅花苷對照品的配製：

精密稱取京尼平苷、綠原酸、西紅花苷-1標準品適量，加50％甲醇分別配製成100μg/ml的京尼平苷、綠原酸和西紅花苷-1對照品母液。

分別檢測儀器及樣品的精密性、穩定性、回收率、重複性。

標準曲線的建立及樣品含量的測定：

1)京尼平苷、綠原酸的標準曲線：分別吸取0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml的京尼平苷或綠原酸母液，置10ml量瓶中加50％甲醇稀釋至刻度超聲混勻，0.22μm微孔濾膜過濾後，精確吸取2μl注入uplc，每個濃度進樣5次，分別以京尼平苷、綠原酸濃度(μg/ml)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪製標準曲線。

2)西紅花苷的標準曲線：分別取0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml西紅花苷母液置10ml量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度超聲混勻，吸取2ml於石英比色杯中440nm下測定，每個濃度測定5次，以西紅花苷濃度(μg/ml)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪製標準曲線。

3)提取物溶液的配製及含量測定：精密稱取杜仲葉提取物或梔子提取物適量，均配製成20μg/ml，使用uplc法分別測定杜仲葉提取物中綠原酸的含量、梔子提取物中京尼平苷的含量；同法配製80μg/ml的梔子提取物使用uv法測定梔子提取物中西紅花苷的含量。並分別根據各自對照品標準曲線計算含量。

杜仲葉提取物中綠原酸含量約為52.5％，梔子提取物中京尼平苷含量約為52.8％，西紅花總苷含量約為10.8％。

lc-ms對提取物成分的定性分析

杜仲葉提取物lc-ms分析條件的選擇：

色譜條件：extend-c18色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流動相：0.1％甲酸(a)一乙腈(b)(其中梯度洗脫程序為：0.01min：a—b(90：10)；3min：a—b(60∶40)；7min：a—b(30：70)；9min：a—b(10：90)；11min：a—b(90：10)；記錄時間：13min)；流速：0.3ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：327nm；進樣量：2μl。

質譜條件：esi(一)；乾燥氣流速：12l/min；霧化室壓：20psi；毛細管電壓：4500ev；加熱毛細管溫度350℃；掃描範圍：50～1000m/z；吹掃氣壓力275.6kp。

梔子提取物lc-ms分析條件的選擇：

色譜條件：extend-c18色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流動相：水(a)一甲醇(b)(其中梯度洗脫程序為0.01min：a—b(70：30)；4min：a—b(40：60)；8min：a—b(20：80)；10min：a—b(70：30)；記錄時間：12min)；流速：0.3ml/min；柱溫：30℃；二極體陣列檢測器記錄190～700nm紫外-可見光譜，檢測波長設定為440nm及238nm；進樣量：2μl。

質譜條件：esi(+)；乾燥氣流速：12l/rain；霧化室壓：20psi；毛細管電壓：4500ev；加熱毛細管溫度350℃；掃描範圍：50～1000m/z；吹掃氣壓力275.6kp。

二種提取物主要成分的結果分析：

在lc-ms對供試品溶液進行全掃描獲得一級質譜的基礎上，利用離子阱質譜的步進式碰撞功能，通過改變電場梯度和能量梯度，獲得了總離子流圖中的各個主峰的分子離子流圖及質譜圖，結合相關文獻資料對總離子流圖中較大離子流峰進行歸屬，定性分析提取物中未明確化合物。

實施例1：

試驗方法

皮下注射穀氨酸鈉(4g/kg/d)幹預乳鼠生長，正常對照組皮下注射相應劑量的生理鹽水(10μl/g/d)，4周後將實驗小鼠分為9組：正常對照組(normal)、模型組(model)、陽性對照藥白藜蘆醇組(res)、杜仲葉提取物高劑量組(eeh：400mg/kg)、杜仲葉低劑量組(eel：100mg/kg)、梔子提取物高劑量組(geh：400mg/kg)、梔子提取物低劑量組(gel：100mg/kg)、聯用高劑量組(eeh+geh：400mg/kg+400mg/kg)、聯用低劑量組(eel+gel：100mg/kg+100mg/kg)，每組10隻小鼠。

灌胃期間正常組給予普通飼料，其餘各實驗組給予高脂飼料，灌胃給藥8周後，測定各組小鼠體重和附睪脂肪溼重，試劑盒測定血清中甘油三酯(tg)和膽固醇(tc)水平，elisa法測定血清中腫瘤壞死因子α(tnf-α)、白介素–6(il-6)、一氧化氮合酶(inos)含量。westernblot法檢測各組小鼠肝臟和迴腸中膽汁酸相關轉運體atp結合轉運蛋白g5/8(abcg5/8)、膽汁酸轉運體膽汁酸輸出泵(bsep)、法尼醇x受體(fxr)、牛磺膽酸共運蛋白(ntcp)、小異二聚體伴侶(shp)、g-蛋白偶聯受體(tgr5)蛋白含量的變化，內參基因為gapdh。

測定結果如下表1～表3所示：

上述數據結果表明，杜仲葉提取物和梔子提取物可有效降低穀氨酸鈉誘導的高脂飲食肥胖小鼠的體重，降低血清的的甘油三酯(tg)和膽固醇(tc)水平，降低血清中的腫瘤壞死因子α(tnf-α)、白介素–6(il-6)、一氧化氮合酶(inos)含量。激活肝臟和迴腸中膽汁酸相關轉運體的蛋白表達，降低膽汁酸抑制基因的蛋白表達水平。

如圖1、圖2所示，a表示與空白組相比，p<0.05；b表示與模型組相比，各給藥組p<0.05，c表示與杜仲高劑量相比p<0.05，d表示與杜仲低劑量相比p<0.05，e表示與梔子高劑量相比p<0.05，f表示與梔子低劑量組相比p<0.05。與normal組相比，model組小鼠血清中的甘油三酯(tg)、總膽固醇(tc)顯著升高，差異具有統計學意義(p<0.05)；與model組比較，各給藥組均能不同程度降低tg、tc。其中eeh+geh組降低tg和tc的作用最強。

實用性

根據本發明實施例所提供的組合物可應用於中藥領域或是保健食品領域，尤其適用於肥胖人群，能夠有效減輕肥胖人群的體重，達到減肥的效果。對本領域的技術人員來說，在不脫離本發明結構的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發明的保護範圍，這些都不會影響本發明實施的效果和專利。

急性毒性試驗

以小鼠為試驗動物，對梔子提取物(主要成分京尼平苷和西紅花苷，ge)，杜仲葉提取物(主要成分綠原酸,ee)進行急性毒性研究，測定其半數致死量。方法：採用60％乙醇提取杜仲葉，梔子，經大孔吸附樹脂分離後得到提取物為試藥，經口給小鼠進行灌胃，觀察不同劑量下小鼠的死亡情況及毒性情況，觀察病理切片he染色結果。結果：梔子提取物的ld50大於5000mg/kg；杜仲葉提取物的ld50為大於5000mg/kg；兩者混合物的ld50為大於5000mg/kg。顯示當用量為5000mg/kg時，心臟顯示充血，心肌纖維斷裂，再加大劑量可能導致心力衰竭；脾臟顯示淋巴小結界限模糊不清，大量炎症因子聚集；肺顯示充血，炎症因子聚集；腎顯示腎小球囊腔大小不等，腎小球擴張充血，腎小球內炎症聚集；肝臟表現為中央靜脈紅細胞聚集增多，肝索排列不整齊，炎症細胞聚集。結論：根據急性毒性試驗分級，顯示當梔子提取物，杜仲葉提取物及其混合物在5000mg/kg以下時，為低毒性，為其用藥提供依據。