防除連作菸草黑脛病的拮抗菌及其微生物有機肥料的製作方法

2024-03-01 17:26:15

專利名稱：：防除連作菸草黑脛病的拮抗菌及其微生物有機肥料的製作方法
技術領域：
：本發明涉及能防除連作菸草黑脛病的拮抗菌及用其製成的微生物有機肥料，屬於農業集約化生產
技術領域：
，專用於克服和消除連作菸草黑脛病問題。二
背景技術：
：菸草是我國主要的經濟作物，其質量的優劣關係著國計民生。菸草黑脛病(Phytohthoraparasiticavar.nicotianae)發現於印尼的爪哇，是菸草生產上一類重要的真菌病害。由於其無性繁殖體(孢子囊)形成速度快、數量大，侵染後潛育期短、發病快，在植株生長季節可以進行多次侵染，環境條件適宜時，短時內可大面積蔓延，造成毀滅性病害。菸草黑脛病菌可以在菸草的任何生育階段侵染危害，主要侵染菸草的根和莖基部，在其上形成黑色凹陷的病斑，故稱"黑脛病"。症狀因煙株生長階段和氣候條件的不同而有較大差異。幼苗首先在近土表的莖基部出現暗褐色至黑色的病斑或底葉受到侵染，再沿葉柄擴展到莖上，常引起"猝倒"症狀。但與由Pythiumsp.引起的猝倒病不同的是，在苗床期，菸草黑脛病的病苗部分或全部根系受侵染腐爛變黑，而菸草猝倒病在發病前、中期根系較少受到侵染。當氣溫較低時，幼苗雖可以受到黑脛病菌侵染，但往往不表現症狀，這些受侵染而尚未表現症狀的煙苗菸草移栽到大田，不僅成活率很低，同時也是大田初侵染菌源之一。另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規模化養殖後的畜禽糞便隨地棄置等不僅嚴重汙染了環境，也極大地浪費了能作為有機肥和生物有機肥產品的原料；大量的養分資源(C、N、P、K、S及微量元素)流失於土壤-植物系統之外，明顯地削弱了我國農業可持續發展的能力。如何將從土壤中因收穫作物取走的營養元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機廢棄物製成商品有機肥，再施入土壤。如果將這些固體有機廢棄物經過高溫發酵合成高品位的有機堆肥，再用於功能菌的載體，所製成的微生物有機肥料功能明確，將會有很好的應用前景。三
發明內容1.技術問題本發明的目的在於研製一種能防除菸草黑脛病的拮抗微生物有機肥料，防治效率達到80%以上，使大量的連作障礙土壤得到生物修復，確保集約化農業的順利發展。2.技術方案用於防除連作菸草黑脛病的拮抗菌C-5菌株，屬於多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)，於2009年9月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNo.3303，主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G+，細胞形狀為杆狀，芽孢橢圓形，兼性厭氧生長，V.P.反應陽性，甲基紅試驗陽性，發酵蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等產酸產氣，澱粉水解陽性，明膠水解陽性，最適生長溫度3(TC，最適pH為7.0;用上述的菌株C-5製成的防除連作菸草黑脛病微生物有機肥料，其特徵在於該肥料中分別含有lX108個/g以上的拮抗菌C-5、全氮質量比含量為45X，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分質量比為610%、有機質質量比含量為3035%。上述防除連作菸草黑脛病微生物有機肥料的生產方法，包括1)將菌株C-5接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為初始pH範圍為7.0-7.2，培養溫度3(TC，通氣量為每分鐘體積比為0.5，攪拌速度為170轉/分鐘，發酵中後期形成芽孢，發酵培養液含菌量^5X109個/ml;所用PDA培養液配製方法為(以配製1L培養基為例)用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，經過濾後濾液中加蔗糖20g，定容至1000ml，pH值調至7.2-7.4，121。C滅菌20min。2)將C-5發酵培養液按50L/噸的量分別接種到腐熟的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物中進行固體發酵，發酵溫度為30-5(TC，發酵中每天翻堆1次，發酵5-7天後結束，使拮抗菌含量達到1X108個/g以上，分別獲得豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌05固體菌劑；所用腐熟後的豬糞堆肥為發芽指數98%以上，有機質含量^35%，有機氮含量為1.2-2%，含水量25-30%。3)再將堆肥的固體菌劑按體積比50-70%與菜粕微生物酶解混合物的固體菌劑按體積比30-50%的比例充分混合，並後熟2-3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過6(TC的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為防除連作菸草黑脛病的微生物有機肥料。所述微生物有機肥料可專用於防除連作菸草黑脛病。3.有益效果本發明研製了一種能防除菸草黑脛病的拮抗微生物有機肥料，利用豬糞堆肥和菜粕的微生物酶解胺基酸混合物，再與拮抗菌液混合後製成微生物有機肥料，其產品與目前市場上的產品相比具有如下優點1)該肥料產品中含有一種抑制菸草黑脛病病原細菌生長的專一性高效菌株(多粘類芽孢桿菌)，其抑制效果顯著。試驗結果表明，在連作菸草黑脛病的土壤上施用本產品後，菸草黑脛病的生物防治率達80%以上，連續三年施用本肥料的土壤，黑脛病的生物防治率更高。2)該肥料為生物有機肥，含有豐富的有機質(含量30_35%)，有機氮含量為4%，而且大部分為胺基酸和小分子多肽。本產品總氮含量為4%，而且生物有效性特別高，可為拮抗菌C-5提供生長繁殖條件，使C-5在土壤中存活下來並形成優勢群，發揮防病作用。3)由於是生物菌株製劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利於菸草的無公害生產，農民可以不用或減少其他防治黑脛病化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利於產品的出口。同時，該微生物肥料還有增產功能，可為農民增加收入。四圖1:拮抗菌C-5的抑菌圈圖2:溫室盆栽試驗防治效果:健康水稻土；CK2:菸草連作土；OF:CK2+胺基酸有機肥；ANT:CK2+C_5液體發4酵液；MOF:CK2+C-5微生物有機肥。五具體實施例方式(—)菌株的分離和鑑定採集已經發生連作障礙並出現嚴重黑脛病病症的植株和周圍土壤，樣品低溫保存，採用選擇性培養基分離病原菌——菸草疫黴(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)。然後以黑脛病病原菌為指示菌，從來自於連作菸草黑脛病發病田塊中的健康菸草植株根際土壤中分離拮抗菌。再通過盆栽試驗最終復篩出高效拮抗菌株C-5，鑑定到屬種，菌種於30%甘油中-7(TC保存。拮抗菌C-5的抑菌圈直徑為28mm(圖1)。菌株C-5屬於多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)，主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G+，細胞形狀為杆狀，芽孢橢圓形，兼性厭氧生長，V.P.反應陽性，甲基紅試驗陽性，發酵蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等產酸產氣，澱粉水解陽性，明膠水解陽性，最適生長溫度3(TC，最適pH為7.0。(二)菌劑生產1)將菌株C-5接種到PDA培養液中，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為初始pH範圍為7.0-7.2，培養溫度3(TC，通氣量為每分鐘體積比為0.5，攪拌速度為170轉/分鐘，發酵中後期形成芽孢，發酵的拮抗菌液含菌或芽孢量^5X109個/ml;所用PDA培養液配製方法為(以配製1L培養基為例)用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，用紗布過濾後，濾液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調至7.2-7.4，121。C滅菌20min。2)將C-5拮抗菌液按50L/噸的接種量分別接種到腐熟的豬糞堆肥和菜粕的微生物酶解混合物進行固體發酵，發酵過程中每天翻堆1次，使固體發酵溫度30-5(TC，發酵5-7天後結束，使拮抗菌含量達到1X108個/g以上，分別獲得豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物的C-5拮抗菌固體菌劑。所用腐熟後的豬糞堆肥為發芽指數98%以上，有機質含量>35%，有機氮含量為1.2-2%，含水量25-30%。其中菜粕的微生物酶解混合物製備方法為(公知公用，見發明專利ZL200610086126.0，一種農用胺基酸的生物製取方法及其肥料產品，江蘇新天地胺基酸肥料有限公司生產)，將嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)菌株37-1發酵液加入到菜粕原料中，調節含水量55-65%和pH6.0-7.5，進行開放式固體發酵，待發酵溫度上升至5(TC時立即開始翻堆，以後每天翻堆，使堆溫始終維持在35-5(TC共5天，固體發酵開始後，堆物的PH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調節含水量和pH，使它們分別維持在55-65%和6.0-7.O，發酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物pH調整為5.0左右，再進行低溫乾燥或自然涼幹，即為菜粕的微生物酶解混合物(含胺基酸的混合材料)。3)再將堆肥的固體菌劑按體積比70%與菜粕微生物酶解混合物的固體菌劑按體積比30%的比例充分混合，並後熟2-3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過6(TC的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，獲得防除連作菸草黑脛病的微生物有機肥(含菌株C-5)。用上述拮抗菌所生產的微生物有機肥(防除連作菸草黑脛病的微生物有機肥)，該肥料中含有lXlQ8個/g以上的拮抗菌C-5、全氮質量比含量為45^，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分質量比為610%、有機質質量比含量為3035%。(三)溫室盆栽試驗供試土壤為菸草連作土，黑脛病發病嚴重。菸草種子採用菸草黑脛病敏感型的"雲煙87"。處理如下:健康水稻土；CK2:菸草連作土；0F:CK2+胺基酸有機肥(菜粕酶解物，江蘇新天地胺基酸肥料有限公司，發明專利ZL200610086126.0，一種農用胺基酸的生物製取方法及其肥料產品)；ANT:CK2+C-5液體發酵液；M0F:CK2+C-5微生物有機肥。每處理6個重複，10kg病土/盆。ANT處理使用C_5液體發酵液接種拮抗菌，使拮抗菌在土壤中的濃度達到108cfu/g幹土。M0F處理每盆施25g微生物有機肥，其他處理用化肥補齊肥料差異。煙苗移苗後10天開始記錄發病情況，30天後，0(2發病率達66.7%，而接種拮抗菌液或微生物有機肥都能降低黑脛病的發病率，其中使用C-5生產的微生物有機肥表現出最好的防治效果(表1，圖2)，發病率為16.7%，防病率可達到80%。結果表明，拮抗菌的施入，不單可以起到防治菸草黑脛病，促進菸草根際微生物群落顯著增加(表2)，而且加入微生物肥料的菸草不僅提高了菸草的抗病性，還有利於增加菸草的產量(表3)。表1:不同盆栽處理髮病率和防病率處理髮病率(％)防病率(％)CK1CK266.7OF33.331.6ANT50.042.0MOF16.780.0注防病率=100X(對照感病指數_處理感病指數)/對照感病指數菸草病情分級行業標準0級全株無病。1級莖部病斑步超過莖圍的二分之一，或半數以下葉片輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑。2級莖部病斑超過莖圍的二分之一，或半數以上葉片凋萎。3級莖部病斑環繞莖圍，或三分之二以上凋萎。4級病株全部葉片凋萎或枯死。表2:不同盆栽處理根表微生物的含量差異tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage7表3:不同盆栽處理鮮重、乾重和株高的差異tableseeoriginaldocumentpage7本發明專利從微生物區系這一關鍵問題著手，研製出一種能顯著消除連作菸草黑脛病發生的微生物有機肥料產品。本肥料產品的作用機制在於本肥料產品提供的功能菌及其有效碳和有效氮源給連作障礙土壤有益微生物區系的培育提供了很好的條件，使之迅速恢復和建立外源有益功能菌微生物的生態及其食物鏈；另一方面，本肥料產品中含有較高含量的有機氮和有機磷，這些營養物質對連作障礙土壤中作物的生長十分有利，大大提高了菸草作物的立苗率和抗逆能力。權利要求用於防除連作菸草黑脛病的拮抗菌，該菌株C-5屬於多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)，於2009年9月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNo.3303，主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G+，細胞形狀為杆狀，芽孢橢圓形，兼性厭氧生長，V.P.反應陽性，甲基紅試驗陽性，發酵蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等產酸產氣，澱粉水解陽性，明膠水解陽性，最適生長溫度30℃，最適pH為7.0。2.用權利要求1所述拮抗菌所生產的防除連作菸草黑脛病微生物有機肥料。3.根據權利要求2所述的防除連作菸草黑脛病微生物有機肥料，其特徵在於該肥料中分別含有lX108個/g以上的拮抗菌C-5、全氮質量比含量為45X，全氮中質量比90X以上為有機氮，總氮磷鉀養分質量比為610%、有機質質量比含量為3035%。4.權利要求2或3所述防除連作菸草黑脛病微生物有機肥料的生產方法，包括1)將權利要求1所述的菌株C-5接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為初始PH範圍為6.8-7.2，培養溫度28-35t:，通氣量為每分鐘體積比為0.5，攪拌速度為170轉/分鐘，發酵中後期形成芽孢，發酵培養液含菌量^5X109個/ml;2)將C-5發酵液按50L/噸的量分別接種到腐熟的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物中進行固體發酵，發酵溫度為30-50°C，發酵過程中每天翻堆1次，發酵5-7天後結束，使拮抗菌含量達到1X108個/g以上，分別獲得豬糞堆肥、菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌C-5固體菌劑；3)再將豬糞堆肥的固體菌劑按體積比50-70%與菜粕微生物酶解混合物的固體菌劑按體積比30-50%的比例充分混合，並後熟2-3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過6(TC的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為防除連作菸草黑脛病的微生物有機肥料。5.根據權利要求4所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟1)所用PDA培養液配製方法為，以配製1L培養基為例用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，經過濾後濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調至7.2-7.4，121。C滅菌20min。6.根據權利要求4或5所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟2)所用腐熟後的豬糞堆肥為發芽指數98%以上，有機質質量比含量>35%，有機氮質量比含量為1.2-2%，含水量質量比25-30%。7.權利要求2或3所述微生物有機肥料的應用。全文摘要本發明涉及用於防除菸草黑脛病的拮抗菌及其微生物有機肥料，屬於農業集約化生產技術。本發明分離到了對菸草黑脛病病原細菌有顯著拮抗作用的一種拮抗菌(多粘類芽孢桿菌C-5)，利用該拮抗菌與有機堆肥製成微生物有機肥料，肥料中分別含有1×108個/g以上的C-5、全氮含量為4～5％(90％以上為有機氮)，總氮磷鉀養分為6～10％、有機質含量為30～35％。試驗表明，這種微生物有機肥料施入土壤後能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優勢群。在還沒有形成連作障礙的土壤上長期施用本微生物有機肥料能在很大程度上防止連作菸草黑脛病的發生。文檔編號C12R1/12GK101696395SQ200910233578公開日2010年4月21日申請日期2009年10月29日優先權日2009年10月29日發明者冉煒,曹明慧,楊興明,沈其榮,沈標申請人:南京農業大學;被以下專利引用(3),